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Articulo de referencia

Metilación del ADN dirigida por ARN

Descripción general de varias funciones biológicas de RdDM. Arriba a la izquierda: El silenciamiento de TE por RdDM previene la activación y transposición de TE. Sin RdDM, los T...

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Este artículo se publicó en la revista científica revisada por pares PLOS Genetics (2020). Haga clic para ver la versión publicada.
Descripción general de varias funciones biológicas de RdDM. Arriba a la izquierda: El silenciamiento de TE por RdDM previene la activación y transposición de TE. Sin RdDM, los TE activos pueden transponerse libremente a genes o promotores, lo que puede alterar la expresión génica o resultar en una proteína mutante. Arriba a la derecha: RdDM está involucrado en varios aspectos del desarrollo; por ejemplo, RdDM afecta el tiempo de floración al reprimir FWA. En el polen, los TE se activan en una célula de soporte, lo que lleva a la producción de sRNA para RdDM que se mueven a la célula germinal para reforzar el silenciamiento de TE. Abajo a la izquierda: Los sRNA involucrados en RdDM son móviles y pueden moverse entre células a través de plasmodesmos o sistémicamente a través del sistema vascular, por lo que el silenciamiento mediado por RdDM puede propagarse desde su punto de origen a tejidos distales. Abajo a la derecha: RdDM está involucrado en varias respuestas al estrés abiótico, incluida la respuesta al choque térmico, y puede silenciar TE que de otro modo se activarían y transpondrían bajo estrés térmico. RdDM también participa en la defensa contra patógenos y puede silenciar el ADN viral (ya sea como un minicromosoma viral, como se muestra, o como un provirus integrado) utilizando ARN pequeños derivados de ARNm virales.

La metilación del ADN dirigida por ARN (RdDM) es un proceso biológico en el que las moléculas de ARN no codificante dirigen la adición de metilación del ADN a secuencias específicas de ADN. La vía RdDM es exclusiva de las plantas , aunque también se han descrito otros mecanismos de modificación de la cromatina dirigida por ARN en hongos y animales . Hasta la fecha, la vía RdDM está mejor caracterizada en angiospermas (plantas con flores), y en particular en la planta modelo Arabidopsis thaliana . Sin embargo, también se han encontrado componentes conservados de la vía RdDM y ARN pequeños (ARNp) asociados en otros grupos de plantas, como gimnospermas y helechos . La vía RdDM se asemeja mucho a otras vías de ARNp, en particular a la vía de ARN de interferencia (ARNi ), altamente conservada en hongos, plantas y animales. Tanto la vía RdDM como la de ARNi producen ARNp e involucran proteínas conservadas como Argonaute , Dicer y la ARN polimerasa dependiente de ARN .

La RdDM se ha relacionado con diversos procesos reguladores en plantas. La metilación del ADN añadida por la RdDM se asocia generalmente con la represión transcripcional de las secuencias genéticas a las que se dirige esta vía. Dado que los patrones de metilación del ADN en plantas son hereditarios, estos cambios suelen transmitirse de forma estable a la descendencia. En consecuencia, una función destacada de la RdDM es la supresión estable y transgeneracional de la actividad de los elementos transponibles (TE). La RdDM también se ha vinculado a la defensa contra patógenos , las respuestas al estrés abiótico y la regulación de varias transiciones clave del desarrollo. Si bien la vía de la RdDM desempeña diversas funciones importantes, los mutantes de Arabidopsis thaliana con deficiencia de RdDM son viables y pueden reproducirse, lo que ha permitido realizar estudios genéticos detallados de la vía. Sin embargo, los mutantes de RdDM pueden presentar una variedad de defectos en diferentes especies de plantas, incluyendo letalidad, fenotipos reproductivos alterados, sobreexpresión de TE, inestabilidad genómica y mayor sensibilidad a patógenos. En general, RdDM es una vía importante en las plantas que regula una serie de procesos mediante el establecimiento y el refuerzo de patrones específicos de metilación del ADN, lo que puede conducir a efectos epigenéticos transgeneracionales en la expresión génica y el fenotipo .

Funciones biológicas

El RdDM interviene en diversos procesos biológicos de la planta, como las respuestas al estrés, la comunicación intercelular y el mantenimiento de la estabilidad del genoma mediante el silenciamiento de los elementos transponibles.

Silenciamiento de elementos transponibles y estabilidad del genoma

Los TE son fragmentos de ADN que, al expresarse, pueden moverse por el genoma mediante un mecanismo de copia y pegado o de corte y pegado. Las nuevas inserciones de TE pueden alterar las secuencias codificantes de proteínas o las secuencias reguladoras de genes, lo que puede dañar o matar a la célula u organismo huésped. [ 1 ] Como resultado, la mayoría de los organismos poseen mecanismos para prevenir la expresión de TE. Esto es particularmente importante en los genomas de las plantas, que suelen ser ricos en TE. Algunas especies de plantas, incluyendo cultivos importantes como el maíz y el trigo , tienen genomas compuestos por más del 80 % de TE. [ 1 ] [ 2 ] El RdDM desempeña un papel fundamental en el silenciamiento de estos elementos de ADN móviles en las plantas al añadir metilación del ADN sobre las nuevas inserciones de TE y reforzar constantemente la metilación del ADN sobre los TE existentes, inhibiendo la transposición y manteniendo la estabilidad del genoma a largo plazo . [ 3 ] Aunque el mecanismo RdDM en sí es exclusivo de las plantas, el uso de la metilación del ADN para silenciar los TE es una estrategia común entre los eucariotas. [ 4 ]

RdDM se dirige principalmente a pequeños TE y fragmentos de TE cerca de genes, que generalmente se encuentran en regiones eucromáticas abiertas y accesibles del genoma que permiten la expresión génica. [ 3 ] [ 5 ] En estas regiones, el estado de cromatina "activa" tiende a propagarse desde los genes expresados ​​a regiones reprimidas cercanas, como los TE, lo que puede provocar que estos TE se activen y se transpongan. [ 3 ] La actividad continua de RdDM se opone a la propagación de la cromatina activa, manteniendo un estado heterocromático silencioso y represivo sobre los TE en estas regiones que de otro modo serían eucromáticas. A su vez, la actividad de RdDM recluta otras vías que ayudan a establecer y propagar el estado heterocromático silencioso (véase "Interacciones entre RdDM y otras vías modificadoras de la cromatina"). Debido a la naturaleza autorreforzante de estas vías de silenciamiento, una actividad excesiva de RdDM también puede provocar que el estado de cromatina heterocromática silenciosa sobre los TE se propague a genes cercanos y los reprima, con consecuencias potencialmente dañinas para el organismo. [ 3 ] [ 5 ] Por lo tanto, la actividad de RdDM debe estar finamente ajustada para mantener un equilibrio entre la represión de los TE y permitir la expresión de genes cercanos. [ 3 ]

Además de mantener el silenciamiento estable de los TE, RdDM también puede iniciar el silenciamiento transcripcional de ADN extraño, incluyendo nuevas inserciones de TE, secuencias derivadas de virus y transgenes (ver también 'Estrés biótico' y 'Silenciamiento de transgenes' más adelante). [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] Cuando los TE se integran cerca de los genes, el silenciamiento de los TE mediado por RdDM a menudo afecta la expresión génica. [ 3 ] [ 1 ] Sin embargo, esto no siempre es perjudicial y a veces puede ser superado por otros procesos, [ 11 ] o alterar la expresión génica de maneras beneficiosas para la planta. A lo largo del tiempo evolutivo, los TE beneficiosos pueden convertirse en una parte importante del mecanismo por el cual se regula un gen. [ 3 ] [ 1 ] En un ejemplo, el gen ROS1 se encuentra adyacente a un pequeño TE helitrón que normalmente es metilado por RdDM. [ 12 ] [ 13 ] Si bien la metilación del ADN normalmente se asocia con la represión transcripcional, este no es el caso en el locus ROS1 . En cambio, la metilación del TE helitrón promueve la expresión de ROS1 , por lo que la expresión de ROS1 se pierde en mutantes de la vía RdDM que no pueden metilar el TE. [ 12 ] [ 13 ] Curiosamente, ROS1 codifica una ADN glicosilasa que funciona para eliminar la metilación del ADN del genoma. [ 14 ] El vínculo entre la expresión de ROS1 y la actividad RdDM en este TE asegura que las actividades de metilación y desmetilación del ADN permanezcan en equilibrio, lo que ayuda a mantener la homeostasis de la metilación del ADN en todo el genoma. [ 12 ] [ 13 ] Por lo tanto, la regulación de los TE mediada por RdDM puede conducir a resultados regulatorios beneficiosos.

Algunos elementos transponibles ( ET) han desarrollado mecanismos para suprimir o evadir el silenciamiento mediado por RdDM con el fin de facilitar su propia proliferación, lo que ha dado lugar a una carrera armamentística evolutiva entre los ET y sus genomas hospedadores. En un ejemplo, se descubrió que una secuencia derivada de un ET produce ARN pequeños que desencadenan la represión postranscripcional de un componente de la vía RdDM, inhibiendo así RdDM. [ 15 ] Esta secuencia podría haber ayudado al ET original a evadir el silenciamiento mediado por RdDM e insertarse en el genoma hospedador.

El estudio de cómo RdDM se dirige y reprime diferentes tipos de TE ha llevado a importantes descubrimientos sobre cómo funciona el mecanismo RdDM. El retrotransposón EVADÉ ( EVD ) fue uno de los primeros TE que se demostró específicamente que era reprimido por los sRNA derivados de RdDM. [ 16 ] Trabajos posteriores utilizaron EVD para rastrear el mecanismo por el cual una nueva inserción de TE se silenciaba, revelando un vínculo mecanicista importante entre el silenciamiento génico postranscripcional y RdDM. [ 9 ] Estudios de otros retrotransposones, incluido ONSEN , que está regulado tanto por RdDM como por estrés térmico, [ 17 ] [ 18 ] y los TE de la familia Athila, [ 10 ] entre muchos otros, también han proporcionado información valiosa sobre el silenciamiento de TE mediado por RdDM.

Desarrollo y reproducción

Una serie de cambios epigenéticos necesarios para el desarrollo y la reproducción normales en plantas con flores involucran a RdDM. En un ejemplo bien estudiado, RdDM es necesario para la represión del gen FWA , lo que permite el momento adecuado de la floración en Arabidopsis. [ 19 ] El promotor de FWA contiene repeticiones en tándem que normalmente son metiladas por RdDM, lo que lleva a la represión transcripcional. [ 20 ] La pérdida de esta metilación reactiva la expresión de FWA , causando un fenotipo de floración tardía. [ 19 ] [ 20 ] La pérdida de la metilación del ADN y el fenotipo de floración tardía asociado pueden transmitirse de forma estable a la progenie. Dado que el alelo fwa desmetilado conduce a un cambio estable y heredable en la expresión de FWA sin ningún cambio en la secuencia de ADN, es un ejemplo clásico de un epialelo .

Las mutaciones en la vía RdDM pueden afectar fuertemente la formación de gametos y la viabilidad de las semillas, particularmente en especies de plantas con alto contenido de TE como el maíz y Brassica rapa , lo que resalta la importancia de esta vía en la reproducción de las plantas. [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] Durante la formación de gametos , se ha hipotetizado, y en algunos casos demostrado, que RdDM ayuda a reforzar el silenciamiento de TE en las células germinales . [ 24 ] [ 25 ] Tanto en el polen como en los óvulos, una célula de soporte sufre una reprogramación epigenética, perdiendo la metilación del ADN y otras marcas epigenéticas en varios loci, incluidos los TE. [ 26 ] [ 24 ] Esto causa la reactivación de TE y fomenta la producción de sRNA derivados de RdDM contra estos TE en las células de soporte. Se cree que los sRNA se mueven luego de la célula de soporte a la célula germinal para reforzar el silenciamiento de TE en la siguiente generación. Este fenómeno se ha observado en el polen, pero aún no se ha demostrado de forma definitiva en el óvulo. [ 27 ] [ 28 ] Esta función de los sRNA en las plantas se asemeja a la función de los piRNA en el desarrollo de la línea germinal en Drosophila y algunos otros animales. [ 29 ] [ 30 ] Un fenómeno similar también puede ocurrir en las raíces para preservar el silenciamiento de los TE en poblaciones importantes de células madre. [ 31 ]

La vía RdDM también está involucrada en la regulación de la expresión improntada en algunos genes. [ 32 ] Este patrón de expresión inusual específico del origen parental ocurre en varios loci en el endospermo durante el desarrollo de la semilla en plantas con flores. Algunos factores involucrados en la vía RdDM están a su vez improntados (favoreciendo la expresión del alelo paterno) en diversas especies, incluyendo A. thaliana , A. lyrata , C. rubella y maíz. [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] RdDM también juega un papel en la mediación de los efectos de dosis génica observados en semillas derivadas de cruces interploides , [ 37 ] [ 38 ] aunque el mecanismo para esto sigue siendo en gran parte desconocido.

También hay evidencia de que RdDM juega un papel en varios otros aspectos del desarrollo de las plantas, incluyendo la latencia de las semillas , [ 39 ] la maduración de los frutos, [ 40 ] y otras vías involucradas en la floración. [ 41 ] Sin embargo, la mayoría de estos datos son correlativos, y se necesita más estudio para comprender el papel de RdDM en estos procesos.

respuesta al estrés

estrés abiótico

RdDM ayuda a las plantas a responder a una serie de estreses abióticos, como estrés térmico, sequía, deficiencia de fosfato, estrés salino y otros. [ 42 ] Muchos TE se regulan positivamente en condiciones de estrés abiótico, [ 43 ] [ 44 ] y por lo tanto una función de RdDM en la respuesta al estrés es ayudar a contrarrestar esta activación. En un ejemplo, el retrotransposón ONSEN se regula positivamente por estrés térmico, pero normalmente permanece reprimido por sRNA asociados a RdDM y solo puede transponerse eficientemente en plantas estresadas por calor que también son deficientes en RdDM. [ 17 ] [ 18 ] De manera más general, en plantas expuestas a estrés térmico, varios componentes de la vía RdDM se regulan positivamente, y las mutaciones en algunos componentes de la maquinaria RdDM reducen la tolerancia al calor, lo que sugiere que RdDM juega un papel importante durante el estrés térmico. [ 45 ] [ 46 ] Además de regular los TE en condiciones de estrés, RdDM también puede regular genes para desencadenar respuestas de estrés apropiadas. En condiciones de baja humedad, las hojas producen menos estomas debido a la regulación negativa mediada por RdDM de dos genes involucrados en el desarrollo estomático. [ 47 ] De manera similar, RdDM se regula negativamente en respuesta al estrés salino, y se ha demostrado que esto desencadena la expresión de un factor de transcripción importante en la resistencia al estrés salino. [ 48 ]

Estrés biótico

RdDM se descubrió inicialmente como una respuesta a la infección por viroides, [ 49 ] y junto con RNAi juega un papel importante en la defensa de la planta contra viroides y virus. La maquinaria RdDM y RNAi reconoce los ARN virales y los procesa en sRNA, que luego pueden usarse en ambas vías para degradar el ARN viral (RNAi) y silenciar el ADN viral (RdDM). [ 50 ] [ 51 ] [ 52 ] Sin embargo, se sabe poco sobre cómo la maquinaria RdDM y RNAi distingue entre los ARN virales y los ARN producidos por la planta huésped. Los mutantes defectuosos en RdDM y otros mutantes deficientes en metilación a menudo son hipersensibles a la infección viral. [ 53 ] [ 54 ] Las interacciones virus-huésped son otro ejemplo de una carrera armamentística evolutiva, y muchos virus de plantas codifican supresores tanto de RdDM como de RNAi en un intento de evadir las defensas de la planta huésped. [ 55 ] [ 53 ] [ 56 ] [ 57 ]

RdDM también participa en la protección de la planta contra otros estreses bióticos, [ 50 ] incluyendo infecciones bacterianas, [ 58 ] infecciones fúngicas, [ 59 ] y depredación. [ 60 ] La pérdida de RdDM puede tener efectos opuestos en la resistencia a diferentes patógenos. Por ejemplo, algunos mutantes de RdDM tienen mayor susceptibilidad a la bacteria Agrobacterium tumefaciens , [ 61 ] pero esos mismos mutantes tienen menor susceptibilidad a la bacteria Pseudomonas syringae , [ 58 ] lo que resalta la complejidad de las diferentes vías de defensa contra patógenos y sus interacciones con RdDM. [ 62 ]

Silenciamiento de transgenes

Además de los factores de estrés de ácidos nucleicos extraños que ocurren naturalmente, como los TE y los virus, las secuencias de ADN introducidas artificialmente, como los transgenes , también son objetivo de la represión por RdDM. [ 63 ] [ 6 ] Los transgenes se utilizan ampliamente en la investigación genética para estudiar la función y regulación de los genes, y en el mejoramiento de plantas para introducir propiedades novedosas y deseables en una planta. Por lo tanto, el silenciamiento de transgenes por RdDM y otros mecanismos ha resultado problemático para los investigadores de plantas. Los esfuerzos para comprender cómo se silencian los transgenes han ayudado en última instancia a revelar gran parte de lo que ahora sabemos sobre la vía RdDM (ver 'Historia y descubrimiento de RdDM'). En un ejemplo temprano, los investigadores transformaron secuencialmente plantas con dos transgenes diferentes que compartían parte de su secuencia de ADN. [ 64 ] Descubrieron que la transformación del segundo transgén en las plantas condujo a que el primer transgén ganara metilación del ADN y se inactivara. [ 64 ] Esto proporcionó una pista temprana de que existía un mecanismo trans-activo, basado en secuencias, para el silenciamiento transcripcional del ADN extraño, que más tarde se demostró que era RdDM.

Estrés y 'memoria' epigenética mediada por RdDM

Debido a la heredabilidad de los patrones de metilación del ADN en las plantas y la naturaleza autorreforzante de RdDM y otras vías de metilación del ADN, cualquier cambio en la metilación del ADN causado por factores de estrés ambiental tiene el potencial de mantenerse y transmitirse a las generaciones futuras. Esto puede permitir que los cambios en la metilación del ADN inducidos por el estrés actúen como una "memoria" del factor de estrés y ayuden a preparar a la planta o a su descendencia para responder de manera más eficiente al estrés si se reexpone. [ 50 ] [ 65 ] Por ejemplo, los sRNA derivados de RdDM contra TE o virus que ya se han integrado en el genoma y han sido silenciados sirven como una "memoria" de esas infecciones previas, protegiendo contra futuras invasiones por secuencias similares. También hay evidencia de que los cambios en la metilación del ADN debidos a otros factores de estrés, como el estrés salino o térmico, pueden persistir en la descendencia de plantas estresadas incluso en ausencia del factor de estrés original. [ 66 ] En este estudio, la persistencia de los cambios de metilación del ADN inducidos por el estrés requirió varias proteínas relacionadas con RdDM, lo que sugiere que RdDM participó en el mantenimiento de los patrones de metilación del ADN alterados por el estrés. En otro ejemplo, la resistencia al ataque de insectos se transmitió a la progenie a través de cambios en la metilación del ADN, y esta herencia también dependió de vías funcionales de biogénesis de sRNA. [ 60 ] [ 50 ] Por lo tanto, RdDM puede alterar potencialmente el epigenoma de la planta en respuesta al estrés y ayuda a mantener estos cambios para modular futuras respuestas al estrés en la planta afectada y sus descendientes.

Señalización de corto y largo alcance

Las moléculas de sRNA producidas por RdDM y otras vías pueden moverse entre células a través de plasmodesmos, y también pueden moverse sistémicamente a través de la planta a través del sistema vascular. [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ] Por lo tanto, tienen el potencial de actuar como moléculas de señalización. Esto se ha demostrado en plantas modificadas genéticamente para expresar proteína verde fluorescente (GFP). [ 70 ] La proteína GFP producida por estas plantas hizo que brillaran en verde bajo ciertas condiciones de luz. Cuando se injertó tejido de una segunda planta que expresaba una construcción de sRNA complementaria a GFP en la planta que expresaba GFP, la fluorescencia de GFP se perdió: después del injerto, los sRNA producidos en los tejidos de la segunda planta se movían a los tejidos de la primera planta que expresaba GFP, y desencadenaban el silenciamiento de GFP. [ 70 ] El mismo estudio mostró que un subconjunto de estos sRNA móviles desencadenaba la adición de metilación del ADN al locus de GFP a través de RdDM. Por lo tanto, los ARN pequeños involucrados en RdDM pueden actuar como moléculas de señalización y desencadenar la adición de metilación del ADN en loci complementarios en células alejadas de donde se generaron originalmente los ARN pequeños. Desde entonces, los estudios han demostrado que los ARN pequeños pueden moverse y dirigir RdDM tanto del tallo a la raíz como de la raíz al tallo, aunque el efecto de silenciamiento es más robusto cuando los ARN pequeños se mueven del tallo a la raíz. [ 69 ] [ 70 ] [ 71 ] [ 72 ]

El movimiento de los sRNA que impulsan la actividad RdDM juega un papel importante en el desarrollo de las plantas, incluyendo durante la reproducción [ 23 ] [ 24 ] [ 27 ] y el desarrollo de la raíz. [ 31 ] En ambos casos, el movimiento de los sRNA parece funcionar principalmente como una forma de reforzar la metilación del ADN y el silenciamiento de los TE en tipos celulares importantes para el desarrollo, como las células germinales y las células madre. El silenciamiento de los TE y el mantenimiento de la integridad del genoma en estas células es particularmente importante porque dan origen a muchas otras células, todas las cuales heredarán cualquier defecto o mutación en la célula madre o germinal original. El movimiento de los sRNA también está involucrado en las interacciones planta-patógeno: los sRNA pueden moverse de células infectadas a tejidos distales no infectados para preparar una respuesta de defensa, aunque hasta la fecha esto solo se ha demostrado para el ARNi, no para RdDM. [ 73 ]

Vías y mecanismos

Esta sección se centra en las vías y los mecanismos mediante los cuales la RdDM conduce a la metilación del ADN específica de secuencia. Las vías aquí presentadas se caracterizaron principalmente en la planta modelo Arabidopsis thaliana , pero probablemente sean similares en otras angiospermas. La conservación de la RdDM en otras especies de plantas se analiza con mayor detalle en la sección «Conservación evolutiva» a continuación.

Contexto de metilación del ADN

Contextos de secuencia de metilación del ADN y metiltransferasas de ADN relacionadas. La metilación del ADN en citosinas seguidas de guaninas (metilación CG) es mantenida por MET1, mientras que la metilación CHG y CHH son mantenidas por CMT3 y CMT2, respectivamente. La metiltransferasa implicada en RdDM, DRM2, puede añadir metilación al ADN independientemente del contexto de la secuencia.

RdDM es el único mecanismo en plantas que puede agregar metilación de ADN a las citosinas independientemente del contexto de secuencia. [ 55 ] La metilación de ADN en plantas se divide típicamente en tres categorías según el contexto de secuencia de la citosina metilada: CG, CHG y CHH, donde H es cualquier nucleótido excepto G. Estas reflejan los diferentes contextos de secuencia a los que se dirigen varias vías de metilación de ADN en plantas. Estas vías específicas de contexto están involucradas principalmente en el mantenimiento de los patrones de metilación de ADN existentes. La metiltransferasa altamente conservada MET1 (homóloga de DNMT1 de mamíferos) mantiene la metilación de ADN en el contexto CG, mientras que dos metiltransferasas conservadas específicas de plantas, la cromometilasa 3 (CMT3) y CMT2, ayudan a mantener la metilación CHG y CHH, respectivamente. [ 74 ] [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] A diferencia de estas vías, RdDM conduce a la adición de metilación de ADN en todas las citosinas independientemente de su contexto de secuencia. Al igual que MET1, CMT2 y CMT3, RdDM participa principalmente en el mantenimiento de los patrones de metilación del ADN existentes. [ 55 ] Sin embargo, RdDM es también la única vía capaz de agregar metilación del ADN de novo a regiones previamente no metiladas en plantas.

Mecanismo

La vía RdDM se puede dividir en dos procesos principales: la producción de ARN pequeños (sRNA) y el reclutamiento de la maquinaria de metilación del ADN por parte de esos sRNA a loci diana específicos en el ADN. [ 78 ] [ 55 ] [ 79 ] Estas dos actividades juntas constituyen RdDM y, en última instancia, conducen a la adición de metilación del ADN a las citosinas en loci diana específicos.

Esquema de la vía canónica RdDM (arriba) y de las vías no canónicas RdDM y RNAi/PTGS (abajo). La vía canónica RdDM se divide en (1) producción de sRNA y (2) metilación del ADN dirigida a los sitios de producción de sRNA. La vía no canónica RdDM está estrechamente relacionada con RNAi y otras vías PTGS, y se diferencia de la vía canónica RdDM principalmente en la fuente de sRNA y su procesamiento. H3K9 = lisina 9 en la histona H3; H3K4 = lisina 4 en la histona H3; ssRNA = ARN monocatenario; dsRNA = ARN bicatenario; miRNA = microARN.

RdDM canónico

La vía canónica de RdDM es, como su nombre indica, la vía de RdDM mejor caracterizada hasta la fecha. La RdDM canónica se recluta preferentemente en regiones que ya están metiladas en el ADN y son heterocromáticas, y actúa para reforzar los patrones de metilación del ADN existentes en estos loci, formando un bucle de retroalimentación positiva. [ 55 ] [ 79 ] La RdDM canónica constituye la mayor parte de la actividad de RdDM en una célula. [ 79 ]

producción de sRNA

La primera parte de la vía RdDM gira en torno a la biogénesis de los sRNA. Un complejo de ARN polimerasa específico de plantas, la ARN polimerasa IV (Pol IV), es reclutado primero a la heterocromatina silente a través de su interacción con las proteínas CLASSY (CLSY) y el homólogo 1 del homeodominio SAWADEE (SHH1) (véase también 'Interacciones entre RdDM y otras vías de modificación de la cromatina' más adelante). [ 80 ] [ 79 ] [ 81 ] Pol IV transcribe estas regiones para producir ARN monocatenarios cortos (ssRNA) de aproximadamente 30 a 45 nucleótidos de longitud, cada uno de los cuales es el precursor de un único sRNA. [ 82 ] [ 83 ] [ 84 ] Estos ssRNA se convierten en ARN bicatenarios (dsRNA) cotranscripcionalmente por la ARN polimerasa 2 dirigida por ARN (RDR2), que se asocia físicamente con Pol IV. [ 83 ] Los dsRNA son luego escindidos por la endorribonucleasa Dicer-like 3 ( DCL3 ) en sRNA de 24 nucleótidos (nt). Pol IV, RDR2 y DCL3 por sí solos son suficientes para la producción de sRNA de 24 nt in vitro , [ 84 ] lo que sugiere que, si bien otros factores involucrados en esta parte de la vía pueden ayudar a aumentar la eficiencia o la especificidad, no son necesarios para la producción de sRNA mediada por Pol IV.

Si bien casi todos los ARN pequeños de 24 nt involucrados en RdDM se producen a través de la vía Pol IV-RDR2- DCL3 , una pequeña proporción se produce a través de otras vías. Por ejemplo, algunos transcritos de ARN polimerasa II (Pol II) que contienen una secuencia de repetición invertida forman estructuras de horquilla de doble cadena que pueden ser escindidas directamente por DCL3 para formar ARN pequeños de 24 nt. [ 85 ] [ 79 ]

Metilación del ADN de los loci objetivo

En la segunda parte de la vía, la maquinaria de metilación del ADN RdDM es guiada a secuencias de ADN complementarias a los sRNA generados en la primera parte de la vía. Una hebra de cada sRNA bicatenario de 24 nt se carga en las proteínas Argonaute (AGO) AGO4, AGO6 o AGO9. [ 55 ] AGO3 también puede funcionar en esta vía. [ 86 ] Las Argonautas son una familia grande y altamente conservada de proteínas que pueden unirse a los sRNA, formando un dúplex proteína-sRNA que les permite reconocer y unirse a otras secuencias de ARN complementarias a su sRNA asociado. [ 87 ] Una vez formado, el dúplex AGO-sRNA encuentra y se une a secuencias complementarias a lo largo de un "andamio" de ARN producido por la ARN polimerasa V (Pol V) específica de plantas, con la ayuda de interacciones con Suppressor of Ty insertion 5-like (SPT5L), el complejo Involved in de novo 2 - IDN2 Paralog (IDN2-IDP) y la subunidad NRPE1 de Pol V. [ 88 ] Esto conduce al reclutamiento de la enzima ADN metiltransferasa Domains Rearranged Methyltransferase 2 (DRM2), que metila el ADN cercano. [ 89 ] [ 55 ] [ 79 ] El mecanismo por el cual el dúplex AGO-sRNA recluta a DRM2 aún no se comprende bien. [ 90 ]

RdDM no canónico

Trabajos recientes han revelado varias variaciones de la vía RdDM, denominadas colectivamente RdDM no canónica. [ 79 ] A diferencia de la RdDM canónica, las vías no canónicas generalmente participan en el establecimiento de la metilación inicial del ADN en nuevos loci diana, como nuevas inserciones de TE, en lugar de mantener la heterocromatina existente. Los elementos que se expresan activamente, como las nuevas inserciones de TE, normalmente son fuertemente atacados por las vías de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS/RNAi). La RdDM no canónica ocurre principalmente como un subproducto de estas vías PTGS, lo que lleva al establecimiento inicial de un estado silencioso y heterocromático sobre el nuevo TE u otro locus diana. Una vez establecido ese estado silencioso inicial, la Pol IV puede ser reclutada al locus por CLSY y SHH1, y la vía RdDM canónica se encarga del mantenimiento a largo plazo del silenciamiento. [ 79 ] Por lo tanto, las vías RdDM no canónicas a menudo actúan como un puente temporal entre el silenciamiento postranscripcional inicial de elementos nuevos por ARNi y el silenciamiento transcripcional transgeneracional a largo plazo a través de RdDM canónica. [ 10 ] [ 9 ] [ 79 ] En consonancia con este papel en la iniciación del silenciamiento nuevo, RdDM no canónica se dirige a relativamente pocos loci en comparación con RdDM canónica. [ 79 ]

La principal diferencia entre las vías RdDM canónica y no canónica radica en el origen y la biogénesis de los ARN pequeños (ARNp) implicados. La vía RdDM canónica utiliza ARNp de 24 nucleótidos (nt), específicos de esta vía y provenientes predominantemente de una única fuente (el complejo Pol IV-RDR2). En cambio, las vías RdDM no canónicas utilizan ARNp de 21-22 nt de diversas fuentes, lo que permite que la metilación de novo del ADN se inicie en muchos tipos diferentes de loci. Estos ARNp de 21-22 nt no son específicos de la vía RdDM no canónica y también participan en otras vías de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS). De hecho, solo una pequeña fracción de los ARNp de 21-22 nt participa en la vía RdDM, mientras que la mayoría impulsa un bucle de retroalimentación positiva que amplifica la respuesta PTGS. [ 91 ] El resultado funcional de un sRNA específico de 21-22 nt depende de la proteína AGO con la que finalmente se asocia: los sRNA que se asocian con AGO4, AGO6 o AGO9 dan como resultado RdDM y metilación del ADN, mientras que los sRNA que se asocian con otras AGO, como AGO1, dan como resultado principalmente PTGS. [ 55 ] [ 79 ]

Al utilizar sRNAs de 21-22 nt derivados de diversas fuentes, el RdDM no canónico puede inducir de forma flexible la metilación y el silenciamiento del ADN de novo en muchos tipos diferentes de loci. Una de las fuentes principales de sRNAs de 21-22 nt son los transcritos de Pol II. Algunos de estos transcritos, en particular los producidos por TE, virus o ciertos transcritos no codificantes de proteínas, son el objetivo de vías PTGS como miRNAs o RNAi, lo que lleva a la escisión del transcrito. Los fragmentos resultantes pueden ser convertidos en dsRNA por RDR6 y luego procesados ​​en sRNAs de 21-22 nt por DCL2 o DCL4 . [ 8 ] La mayoría de estos sRNAs de 21-22 nt se cargan en AGO1 y retroalimentan al PTGS, amplificando la eficiencia del PTGS. [ 79 ] Sin embargo, algunos se asociarán con AGO6, lo que dará lugar al RdDM. [ 10 ] Los dsRNA resultantes de la actividad de RDR6 también pueden ser procesados ​​a veces por DCL3 en lugar de DCL2/4 y desencadenar RdDM. [ 9 ] Además, algunos transcritos de Pol II contienen secuencias repetidas invertidas , que pueden formar estructuras de doble cadena similares a horquillas. Estas pueden ser escindidas por proteínas DCL independientemente de RDR para producir sRNA de 21-22 nt o 24 nt que pueden participar en RdDM. [ 79 ] De manera similar, los precursores de miRNA, que también forman estructuras de horquilla y normalmente son escindidos por DCL1 para producir miRNA, pueden ser escindidos por otras DCL para formar sRNA para RdDM. [ 79 ] Si bien la mayor parte de la RdDM no canónica ocurre a través de AGO6 o AGO4, también hay una versión de la vía donde los sRNA se asocian con AGO2, que junto con el complejo NERD (Needed for RDR2-independent DNA methylation) recluta a DRM2 a los loci objetivo y desencadena la metilación del ADN. [ 92 ] Dado que las vías no canónicas aún no están tan bien caracterizadas como la vía canónica de RdDM, [ 79 ] es probable que existan fuentes adicionales de sRNA utilizadas para RdDM que aún no se han descubierto.

Factores involucrados

A continuación se enumeran varios factores que intervienen en RdDM, junto con detalles adicionales sobre su función y las referencias correspondientes. También se incluyen varios factores que intervienen principalmente en PTGS y que a veces participan en RdDM.

Interacciones con otras vías de modificación de la cromatina

Los diferentes estados de la cromatina, como la eucromatina activa o la heterocromatina silente, se definen por una combinación de patrones específicos de modificación de histonas y metilación del ADN. Las modificaciones represivas de la cromatina, como la metilación del ADN, ayudan a promover la compactación del ADN y reducen su accesibilidad, mientras que otras modificaciones ayudan a abrir la cromatina y aumentar su accesibilidad. La metilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9), principalmente en forma de trimetilación de H3K9 ( H3K9me3 ) en animales y dimetilación de H3K9 ( H3K9me2 ) en plantas, es una modificación represiva altamente conservada. [ 121 ] [ 122 ] La falta de metilación de H3K4 (H3K4me0) también se asocia con la represión, junto con varias otras modificaciones y variantes de histonas . La combinación de metilación del ADN, H3K9me2 y H3K4me0 está fuertemente asociada con la heterocromatina en plantas.

Dado que la metilación del ADN y las modificaciones represivas de las histonas definen conjuntamente la heterocromatina, la mayoría de las vías de metilación del ADN en las plantas reconocen e interactúan con las marcas represivas de las histonas y viceversa, formando bucles de retroalimentación positiva que ayudan a mantener el estado represivo de la cromatina. [ 123 ] La proteína SHH1 asociada a RdDM reconoce H3K4me0 y H3K9me2 en los loci heterocromáticos y recluta a Pol IV a estos loci para desencadenar una metilación adicional del ADN en estas regiones. [ 106 ] De manera similar, SUVH2 y SUVH9 ayudan a reclutar a Pol V a los loci con metilación del ADN. [ 110 ] Por lo tanto, ambas partes principales de la vía canónica de RdDM son reclutadas preferentemente a regiones que ya se encuentran en el estado silencioso y heterocromático marcado por la metilación del ADN, H3K9me2 y H3K4me0. La metilación del ADN en estos mismos loci heterocromáticos también es reconocida por las histona metiltransferasas SUVH4/KYP, SUVH5 y SUVH6, que se unen a la metilación no-CG y agregan H3K9me2 a las histonas cercanas, [ 123 ] [ 124 ] cerrando el bucle de retroalimentación positiva. De manera similar, CMT3 y CMT2, las dos ADN metiltransferasas involucradas en el mantenimiento de la metilación CHG y CHH respectivamente, [ 75 ] se unen y agregan metilación del ADN a la heterocromatina marcada con H3K9me2, formando su propio bucle de retroalimentación con SUVH4/5/6. [ 125 ] [ 123 ] Estas interacciones ayudan a reforzar fuertemente el silenciamiento en los TE y otras regiones heterocromáticas.

Un bucle de retroalimentación similar ocurre en animales. HP1 desempeña un papel vital en el mantenimiento de la heterocromatina al propagar la metilación de H3K9 a través de un bucle de retroalimentación positiva con la metiltransferasa de H3K9 SUV39H. [ 126 ] La metilación de H3K9 recluta a HP1, que a su vez recluta a SUV39H para depositar más metilación de H3K9. [ 126 ] Aunque HP1 está conservado en plantas, su función en este bucle de retroalimentación no lo está. [ 127 ] En cambio, los bucles de retroalimentación positiva entre H3K9me2 y las vías de metilación del ADN RdDM y CMT2/3 cumplen una función similar en la propagación de H3K9me2. Más recientemente, también se identificó una proteína específica de plantas, la proteína 1 que contiene el dominio Agenet (ADCP1), que puede funcionar de forma análoga a HP1 en el mantenimiento de los niveles de H3K9me2 en la heterocromatina, facilitando su formación. [ 128 ]

En última instancia, el refuerzo constante de las modificaciones de silenciamiento de la cromatina en los loci heterocromáticos crea un estado de cromatina represivo en el que el ADN y las histonas ( nucleosomas ) se compactan estrechamente. Esto ayuda a silenciar la expresión génica al inhibir físicamente el acceso al ADN, impidiendo que la ARN polimerasa II , los factores de transcripción y otras proteínas inicien la transcripción. [ 129 ] Sin embargo, esta misma compactación también impide que los factores involucrados en el mantenimiento de la heterocromatina accedan al ADN, lo que podría llevar a la pérdida del estado compacto y silencioso. Esto es particularmente cierto en la densa heterocromatina constitutiva que rodea al centrómero. En estas regiones, el remodelador de cromatina DDM1 desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la metilación del ADN al desplazar temporalmente los nucleosomas para permitir que las metiltransferasas y otros factores accedan al ADN. [ 130 ] [ 131 ] [ 5 ] Sin embargo, dado que la mayoría de los objetivos de RdDM son pequeños TE en regiones abiertas, accesibles y ricas en genes (véase "Silenciamiento de TE y estabilidad del genoma"), pocos sitios de RdDM requieren DDM1. [ 5 ] [ 99 ] De hecho, la heterocromatina densa inhibe RdDM. [ 5 ] Por el contrario, CMT2 y CMT3 funcionan preferentemente en heterocromatina constitutiva y dependen fuertemente de DDM1 para mantener el silenciamiento sobre estas regiones. [ 131 ] [ 5 ] [ 3 ] De manera similar, MET1, que mantiene la metilación del ADN en sitios CG después de la replicación, requiere DDM1 para acceder a la heterocromatina y mantener la metilación CG en esas regiones. [ 132 ] Por lo tanto, DDM1 es un regulador clave de la metilación del ADN en heterocromatina densa, pero regula los sitios mayormente de forma independiente de RdDM. [ 5 ] [ 99 ]

Las interacciones entre RdDM y las otras tres vías de mantenimiento de la metilación del ADN son limitadas y predominantemente indirectas. La ADN metiltransferasa MET1 mantiene robustamente la metilación CG en todo el genoma, incluyendo los sitios diana de RdDM. En los mutantes de RdDM, se pierde la metilación no CG en los sitios diana de RdDM, pero la metilación CG aún se mantiene, lo que sugiere que la actividad de MET1 es independiente de RdDM. [ 99 ] Sin embargo, aunque los mutantes met1 pierden la metilación CG como se esperaba, también pierden gran parte de su metilación no CG, incluyendo en los loci diana de RdDM. [ 99 ] En estos sitios, el silenciamiento aún puede ser iniciado por RdDM en los mutantes met1 , pero no se mantiene ni se transmite a la progenie, lo que sugiere que MET1 es importante para el mantenimiento, pero no para la iniciación, del silenciamiento en un subconjunto de loci diana de RdDM. [ 133 ] [ 120 ] Es probable que este efecto sea indirecto: la pérdida de MET1 conduce a la pérdida de H3K9me2 en algunos sitios, lo que inhibe el reclutamiento de Pol IV y, por lo tanto, impide el mantenimiento de la metilación del ADN a través de RdDM canónico, aunque las vías no canónicas (que no involucran a Pol IV) no se ven afectadas. [ 99 ] [ 120 ] La pérdida de la histona deacetilasa HDA6, que facilita el mantenimiento de la metilación por MET1 en algunos loci, tiene un efecto similar, lo que sugiere que múltiples factores diferentes involucrados en el mantenimiento de la heterocromatina probablemente facilitan el mantenimiento de la metilación del ADN mediado por RdDM. [ 120 ]

La pérdida de RdDM conduce a una fuerte pérdida de metilación no-CG en TE en regiones ricas en genes en los brazos cromosómicos, pero tiene poco efecto en los niveles de metilación del ADN en la heterocromatina constitutiva alrededor del centrómero. [ 99 ] [ 5 ] [ 3 ] Esto sugiere que CMT2 y CMT3, que funcionan principalmente para mantener la metilación CHG y CHH en la heterocromatina constitutiva densa, no dependen de la actividad de RdDM. [ 99 ] [ 5 ] [ 3 ] De manera similar, en los mutantes dobles cmt2,cmt3 , muchos TE en los brazos cromosómicos permanecen metilados, presumiblemente debido a la actividad persistente de RdDM, lo que indica que la pérdida de CMT2/3 tiene poco efecto en la actividad de RdDM. [ 5 ] [ 3 ] Esto sugiere que RdDM y CMT2/3 funcionan mayormente de forma independiente y en loci distintos: RdDM es la principal vía responsable de mantener la metilación del ADN no-CG en regiones eucromáticas ricas en genes, mientras que CMT2 y CMT3 mantienen la metilación del ADN no-CG en la heterocromatina constitutiva. En mutantes defectuosos tanto en RdDM como en CMT2/CMT3, se elimina toda la metilación no-CG en el genoma, [ 74 ] lo que demuestra que, en conjunto, RdDM y CMT2/CMT3 representan toda la metilación no-CG en el genoma.

Equilibrio entre la metilación y la desmetilación del ADN.

La mayoría de los mecanismos de metilación del ADN en las plantas son autorreforzantes (ver arriba), incluido RdDM: Pol IV y Pol V son reclutados a regiones heterocromáticas que ya tienen metilación del ADN, lo que fomenta la metilación adicional del ADN a través de RdDM canónico. [ 55 ] Los bucles de retroalimentación positiva como estos pueden hacer que la actividad de metilación del ADN se extienda desde los sitios diana metilados previstos a genes u otros elementos reguladores, lo que puede afectar negativamente la expresión génica. Para evitar esta propagación, las vías de metilación del ADN se oponen a la desmetilación pasiva y activa del ADN. La metilación del ADN puede perderse pasivamente con cada división celular, porque las hebras de ADN recién sintetizadas carecen de metilación del ADN hasta que se vuelve a agregar mediante una de las vías de mantenimiento de la metilación del ADN. [ 134 ] La metilación del ADN también puede eliminarse activamente en las plantas mediante glicosilasas de ADN , que eliminan las citosinas metiladas a través de la vía de reparación por escisión de bases . En Arabidopsis, hay cuatro proteínas responsables de eliminar la metilación del ADN: Represor del silenciamiento 1 (ROS1), Demeter (DME), Demeter-like 2 (DML2) y Demeter-like 3 (DML3). [ 135 ] [ 136 ] Estas glicosilasas de ADN ayudan a prevenir la propagación de la metilación del ADN desde los objetivos de RdDM a los genes activos. [ 137 ] [ 14 ] La pérdida de la desmetilación activa del ADN en los mutantes triples ros1;dml2;dml3 conduce a un aumento generalizado en los niveles de metilación del ADN, mientras que la expresión ectópica de ROS1 conduce a una pérdida progresiva de la metilación del ADN en muchos loci, [ 138 ] lo que destaca la importancia de equilibrar la actividad de metilación y desmetilación del ADN.

Curiosamente, la expresión de la ADN desmetilasa ROS1 está directamente ligada a la actividad de RdDM: la metilación del ADN sobre un TE al que apunta RdDM en el promotor de ROS1 es necesaria para la expresión de ROS1 , [ 12 ] [ 13 ] aunque otros factores también están involucrados en la regulación de ROS1 . [ 139 ] [ 140 ] Dado que la expresión de ROS1 está ligada a la metilación del ADN en un TE específico, la expresión de ROS1 también se reduce fuertemente en plantas con RdDM defectuoso que pierden la capacidad de metilar ese TE y otros. [ 12 ] Este mecanismo general ayuda a mantener la homeostasis de la metilación del ADN al ajustar la actividad de desmetilación del ADN a la actividad de metilación del ADN, lo que ayuda a asegurar que los patrones de metilación del ADN se puedan mantener estables a lo largo del tiempo.

Conservación evolutiva

Orígenes de los miembros de la vía RdDM

Esquema que muestra la conservación evolutiva de ortólogos de subunidades seleccionadas de Pol IV y V dentro del reino vegetal. Las subunidades que comienzan con NRPD son subunidades de Pol IV, las que comienzan con NRPE son subunidades de Pol V, y las etiquetadas como NRPD/E se encuentran tanto en Pol IV como en V. [ 141 ] Un círculo relleno para una subunidad indica que se ha identificado un ortólogo para esa subunidad dentro del linaje asociado.
Esquema que muestra la conservación evolutiva de ortólogos seleccionados de la vía RdDM dentro del reino vegetal. Un círculo relleno indica que se ha identificado un ortólogo para esa subunidad dentro del linaje asociado.

Si bien todos los eucariotas comparten tres ARN polimerasas (ARN Pol I, II y III), las plantas tienen dos polimerasas adicionales, Pol IV y Pol V. Tanto Pol IV como V comparten un origen evolutivo, derivado de Pol II. [ 141 ] [ 94 ] En otros reinos eucariotas que carecen de estas dos ARN polimerasas especializadas, Pol II transcribe los precursores de los ARN pequeños utilizados en las vías de silenciamiento; de hecho, los transcritos de Pol II también se procesan a veces en ARN pequeños en las plantas. Se ha planteado la hipótesis de que el origen tanto de Pol IV como de Pol V radica en "escapar de un conflicto adaptativo". [ 142 ] La idea es que las posibles tensiones entre la función "tradicional" de Pol II y la función de biogénesis de ARN pequeños podrían aliviarse mediante la duplicación de Pol II y la subfuncionalización de las múltiples ARN polimerasas resultantes.

Los análisis del linaje evolutivo de Pol IV y Pol V se complican en cierta medida por el hecho de que cada enzima está compuesta en realidad por al menos 12 subunidades . [ 141 ] En Arabidopsis thaliana , algunas subunidades son compartidas entre Pol IV y Pol V, algunas son únicas para cada polimerasa y algunas son compartidas entre Pol II, IV y V. [ 143 ] Se han encontrado ortólogos de ciertas subunidades de Pol IV y V en todos los linajes de plantas terrestres, incluidos helechos, hepáticas y musgos. [ 144 ] [ 142 ] Estos hallazgos sugieren un origen común de Pol IV y V que se remonta a las primeras plantas terrestres/vasculares.

Gran parte del trabajo realizado para dilucidar los genes y proteínas involucrados en la vía RdDM se ha llevado a cabo en Arabidopsis thaliana , una angiosperma modelo. Sin embargo, los estudios de Pol IV y V realizados en maíz muestran algunas diferencias clave con Arabidopsis. Las Pol IV y V del maíz difieren entre sí en términos de una sola subunidad (la más grande). En Arabidopsis, las Pol IV y V difieren entre sí en términos de tres subunidades. [ 145 ] Sin embargo, el maíz utiliza un conjunto de subunidades catalíticas intercambiables – dos en el caso de Pol IV y tres en el caso de Pol V – que proporcionan una especialización adicional de la funcionalidad de la polimerasa. [ 145 ] Si bien existen diferencias, en general hay una amplia superposición en las funciones y componentes de RdDM entre las diferentes especies de angiospermas estudiadas hasta la fecha.

Fuera de Pol IV y Pol V, una gran proporción de proteínas clave de componentes de RdDM (por ejemplo, DCL3 y AGO4) tienen ortólogos encontrados dentro de cada clase de plantas terrestres, lo que respalda la hipótesis de que alguna forma de la vía RdDM evolucionó tempranamente dentro del linaje vegetal. [ 142 ] Sin embargo, la funcionalidad de la vía RdDM parece cambiar en una medida apreciable entre diferentes especies y linajes de plantas. Por ejemplo, mientras que las gimnospermas tienen Pol IV funcional y producen ARN pequeños de 24 nt, la biogénesis de sRNA dentro de las gimnospermas está mucho más sesgada hacia los sRNA de 21 nt que hacia los de 24 nt. [ 146 ] Esto sugiere que el RdDM canónico puede ser más raro o menos pronunciado en las gimnospermas que en las angiospermas. De manera similar, mientras que se encuentran ortólogos de DRM2 en varias angiospermas, no se conocen ortólogos de DRM2 en otros linajes de plantas. [ 147 ] Una posibilidad es que las angiospermas tengan la versión "más completa" de la vía RdDM, mientras que todos los demás linajes de plantas poseen subconjuntos robustos y funcionales de dicha vía. Sin embargo, dado que casi todo el trabajo sobre RdDM se ha realizado en angiospermas, también es posible que versiones alternativas de RdDM en otros linajes simplemente no se hayan descubierto aún, particularmente si estas versiones alternativas incluyen proteínas diferentes o proteínas sin homólogos claros en las angiospermas.

Relaciones con las vías de silenciamiento de ARN pequeños en otros reinos

Todos los reinos eucariotas albergan alguna forma de ARN pequeños. Una de estas clases de ARN pequeños son los ARN que interactúan con Piwi (piARN) . Al igual que en RdDM, los piARN funcionan principalmente para dirigir y silenciar transposones, particularmente en la línea germinal. [ 29 ] [ 30 ] Sin embargo, los piARN solo se encuentran en animales, son más largos que los ARN pequeños que funcionan en RdDM (24-32 nucleótidos) y median sus funciones a través de interacciones con una subclase diferente de proteínas AGO, la subfamilia PIWI, que está ausente en las plantas. [ 29 ] [ 30 ] Los microARN (miARN) son otra clase de ARN pequeños con propiedades de silenciamiento. [ 148 ] Si bien los miRNAs tienen un tamaño similar al de los sRNAs de RdDM (~21 nt), los miRNAs se asocian con un conjunto distinto de proteínas Argonaute que silencian los ARN diana iniciando su degradación o bloqueando su traducción posterior a proteínas, en lugar de reclutar a DRM2 para agregar metilación de ADN al ADN cercano. Tanto la vía RdDM como la de los miRNAs involucran proteínas relacionadas de las familias Argonaute y Dicer. [ 148 ]

Quizás las vías más análogas a RdDM en otro reino eucariota son las vías de silenciamiento génico transcripcional dirigido por sRNA (TGS) y silenciamiento génico cotranscripcional (CTGS) en Schizosaccharomyces pombe . [ 149 ] En S. pombe , TGS dirige la metilación de H3K9, lo que conduce a la formación de heterocromatina, y está dirigido por sRNA producidos a partir de las regiones objetivo. [ 150 ] Similar a RdDM canónico, esta vía es un bucle de retroalimentación positiva: los sRNA se generan preferentemente a partir de áreas ricas en heterocromatina del genoma, y ​​estos sRNA dirigen la adición de metilación de K3K9 para mantener/propagar la heterocromatina. Mientras tanto, CTGS está dirigido por sRNA unidos a AGO1, similar a PTGS dentro de las plantas, y resulta en la inhibición de la transcripción por Pol II, así como en la liberación de Pol II. [ 151 ] [ 152 ] A diferencia de RdDM, TGS y CTGS en S. pombe no dependen de la transcripción de fuentes distintas a la Pol II ni conducen a la adición de metilación del ADN. Sin embargo, las vías de S. pombe y RdDM comparten muchos de los mismos componentes, como las ARN polimerasas dirigidas por ARN y los ARN pequeños, y tienen funciones similares en el mantenimiento de la heterocromatina.

Historia

La introducción de transgenes en organismos ha sido una herramienta ampliamente utilizada en la investigación de genética vegetal durante décadas. Sin embargo, los investigadores a menudo encuentran que sus transgenes introducidos no se expresan con la fuerza esperada, o a veces ni siquiera se expresan, un fenómeno llamado silenciamiento de transgenes. [ 153 ] El descubrimiento del silenciamiento de transgenes en la década de 1990 impulsó un gran interés en comprender los mecanismos detrás de este silenciamiento. [ 154 ] [ 155 ] [ 156 ] Los investigadores encontraron que el silenciamiento de transgenes era ubicuo, ocurriendo en múltiples especies (incluyendo Arabidopsis, tabaco y petunia), y estaba asociado con un aumento de la metilación del ADN sobre y alrededor del transgén silenciado. [ 157 ] [ 158 ] [ 159 ]

Casi al mismo tiempo, en 1994, un estudio en plantas de tabaco reveló una nueva vía que involucraba ARN y que resultaba en la metilación del ADN. Los investigadores descubrieron que cuando se introducían viroides en la planta y se integraban en su genoma, las secuencias de los viroides, pero no el genoma del huésped, adquirían metilación del ADN. [ 49 ] La deposición de metilación sobre estas secuencias de viroides extraños ayudaba a inhibir la replicación de los viroides y, por lo tanto, se pensó que representaba un mecanismo de defensa de la planta contra patógenos. La evidencia sugería que los ARN de los viroides producidos durante la replicación de los mismos eran utilizados por la planta como plantilla para dirigir la metilación del ADN a las secuencias de los viroides. Este mecanismo se denominó, por lo tanto, metilación del ADN dirigida por ARN, o RdDM. [ 49 ]

RdDM resultó ser la solución al misterio de los transgenes: al igual que los viroides y los virus, los transgenes son secuencias extrañas y, como resultado, a menudo se reconocen como invasores extraños y se silencian mediante RdDM y PTGS. Dado que el silenciamiento de los transgenes era un marcador fiable de la actividad de RdDM, los investigadores pudieron diseñar cribados genéticos para identificar mutantes que no desencadenaban el silenciamiento en los transgenes, razonando que estos genes probablemente estaban involucrados en la vía de RdDM. Estos experimentos revelaron muchas partes de la vía, incluyendo la ARN polimerasa IV y V, proteínas similares a Dicer , Argonautas y otras. [ 6 ] [ 160 ] [ 161 ]

La participación de los sRNA en RdDM se sospechó inicialmente debido a la similitud entre RdDM y RNAi, este último del cual se había demostrado recientemente que involucra pequeños ARN. [ 49 ] [ 162 ] Para probar si los sRNA estaban involucrados en RdDM, se introdujeron estructuras de horquilla de ARN complementarias a un promotor génico específico en Arabidopsis y tabaco. [ 163 ] Los ARN en horquilla se procesaron en sRNA, que fueron capaces de desencadenar la adición de metilación del ADN al promotor objetivo y silenciar el gen. [ 163 ] Esto demostró que los sRNA podían dirigir la metilación del ADN a loci específicos. Esfuerzos posteriores mostraron que los sRNA involucrados en RdDM tenían aproximadamente 24-26 nt de longitud, mientras que los sRNA asociados con RNAi tenían solo alrededor de 21-22 nt de longitud. [ 164 ] Poco después, la identificación de AGO4 y la caracterización de su función en RdDM llevaron a predicciones, confirmadas posteriormente, de que los sRNA de 24 nt se asociaban con AGO4 y dirigían la metilación del ADN a loci complementarios. [ 165 ] [ 164 ]

Los primeros trabajos sobre el silenciamiento de transgenes y RdDM también identificaron a SDE4 como necesario para la producción de la mayoría de los sRNA involucrados en RdDM. [ 166 ] Posteriormente, SDE4 fue identificado como la subunidad más grande de Pol IV y renombrado como NRPD1. Varios estudios publicados en rápida sucesión por múltiples grupos de investigación, utilizando enfoques genéticos tanto directos como inversos , lograron identificar y caracterizar a Pol IV y Pol V como ARN polimerasas vegetales altamente especializadas involucradas en RdDM. [ 167 ] [ 168 ] [ 169 ] [ 170 ] La convención de nomenclatura Pol IV / Pol V fue adoptada poco después. [ 88 ] [ 141 ]

Aplicaciones potenciales de la biotecnología

Dado que el mecanismo subyacente a la especificidad de secuencia de RdDM es bien conocido, RdDM puede ser "engañado" para dirigirse a genes endógenos y silenciarlos de manera altamente específica, lo que tiene varias aplicaciones potenciales en biotecnología y bioingeniería. Se pueden utilizar varios métodos diferentes para desencadenar la metilación del ADN mediada por RdDM y el silenciamiento de genes específicos. Un método, llamado silenciamiento génico inducido por virus (VIGS), consiste en insertar parte de la secuencia promotora del gen diana deseado en un virus. [ 171 ] El virus reproducirá el fragmento de secuencia promotora como parte de su propio ARN, que de otro modo sería ajeno a la planta. Debido a que el ARN viral es ajeno, será dirigido a PTGS y procesado en sRNA, algunos de los cuales serán complementarios al promotor del gen diana original. Un subconjunto de estos sRNA reclutará la maquinaria RdDM al gen diana para agregar metilación del ADN. En un estudio, los investigadores utilizaron este método con un virus del mosaico del pepino modificado genéticamente para reclutar RdDM y silenciar un gen que afectaba la pigmentación de las flores en la petunia y otro que afectaba la maduración del fruto en el tomate. [ 172 ] En ambos casos, demostraron que la metilación del ADN se añadió al locus como se esperaba. En la petunia, tanto la ganancia de metilación del ADN como los cambios en la coloración de las flores fueron heredables, mientras que en el tomate solo se observó un silenciamiento parcial y heredabilidad. VIGS también se ha utilizado para silenciar el locus FLOWERING WAGENINGEN ( FWA ) en Arabidopsis, lo que dio como resultado plantas que florecieron más tarde de lo normal. [ 171 ] El mismo estudio también demostró que el efecto inhibidor de VIGS sobre FWA y la floración puede volverse más fuerte a lo largo de generaciones exitosas. [ 171 ]

Otro método para dirigir RdDM a un gen diana deseado consiste en introducir una estructura de ARN en horquilla complementaria al locus diana. Los ARN en horquilla contienen una repetición invertida , lo que provoca que la molécula de ARN forme una estructura de ARN de doble cadena (dsRNA) denominada horquilla de ARN. Las proteínas DCL procesan la horquilla de dsRNA en sRNA complementarios al locus diana, lo que desencadena RdDM en dicho locus. Este método se ha utilizado en varios estudios. [ 12 ] [ 173 ] [ 174 ]

Los cambios inducidos por RdDM a veces pueden mantenerse y heredarse durante varias generaciones sin intervención o manipulación externa, lo que sugiere que RdDM puede ser una herramienta valiosa para la edición dirigida del epigenoma. Trabajos recientes incluso han evitado RdDM por completo al anclar artificialmente DRM2 (u otros componentes de la vía RdDM) directamente a loci objetivo específicos, utilizando nucleasas de dedos de zinc o CRISPR . [ 90 ] [ 175 ] En estos experimentos, anclar la maquinaria RdDM a un locus específico condujo a una ganancia de metilación del ADN en el sitio objetivo que a menudo fue heredable durante varias generaciones, incluso después de que el constructo artificial fue eliminado por cruzamiento. Sin embargo, para todos estos métodos, se necesita más trabajo para minimizar los efectos fuera del objetivo y aumentar la eficiencia de la metilación del ADN.

Los organismos genéticamente modificados (OGM) han desempeñado un papel importante en la investigación y la práctica agrícola recientes, pero han resultado controvertidos y enfrentan barreras regulatorias para su implementación en algunas jurisdicciones. Los OGM se definen por la inclusión de material genético "extraño" en el genoma. El tratamiento de plantas con ARN o virus diseñados para desencadenar RdDM no cambia la secuencia de ADN subyacente del genoma de la planta tratada; solo se altera el estado epigenético de porciones de la secuencia de ADN ya presente. Como resultado, estas plantas no se consideran OGM. Esto ha llevado a esfuerzos para utilizar RdDM y otros efectos mediados por ARN para inducir rasgos beneficiosos para la agricultura, como alterar la susceptibilidad a patógenos o herbicidas, o acelerar el mejoramiento de plantas mediante la rápida inducción de rasgos favorables. [ 176 ] [ 177 ] [ 178 ] Sin embargo, si bien esta es un área de interés activo, existen pocas aplicaciones ampliamente implementadas hasta el momento.

Referencias

Este artículo fue adaptado de la siguiente fuente bajo una licencia CC BY 4.0 ( 2020 ) ( informes de revisores ): Robert M. Erdmann; Colette Lafontaine Picard (8 de octubre de 2020). "Metilación del ADN dirigida por ARN" . PLOS Genetics . 16 (10) e1009034. doi : 10.1371/JOURNAL.PGEN.1009034 . ISSN 1553-7390 . PMID 33031395. Wikidata Q100233435 .   

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