ARN polimerasa dependiente de ARN

La ARN polimerasa dependiente de ARN ( RdRp ) o ARN replicasa es una enzima que cataliza la replicación del ARN a partir de una plantilla de ARN. Específicamente, cataliza la síntesis de la cadena de ARN complementaria a una plantilla de ARN dada. Esto contrasta con las ARN polimerasas dependientes de ADN (DdRP) típicas, que todos los organismos utilizan para catalizar la transcripción del ARN a partir de una plantilla de ADN .

La RdRp es una proteína esencial codificada en los genomas de la mayoría de los virus que contienen ARN y carecen de una etapa de ADN. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Algunos eucariotas también contienen RdRps, que participan en la interferencia de ARN y difieren estructuralmente de las RdRps virales.

Las RdRp virales se descubrieron a principios de la década de 1960 a partir de estudios sobre picornavirus, cuando se observó que estos virus no eran sensibles a la actinomicina D , un fármaco que inhibe la síntesis de ARN dirigida por ADN celular. Esta falta de sensibilidad sugirió la acción de una enzima específica del virus que podría copiar el ARN a partir de una plantilla de ARN. ^{[ 3 ]}

Estructura y mecanismo de elongación de la replicación de una RdRp

Las RdRp están altamente conservadas en los virus y están relacionadas con la telomerasa , aunque la razón de esto era una incógnita hasta 2009. ^{[ 4 ]} La similitud llevó a especular que las RdRp virales son ancestrales a la telomerasa humana. ^{[ 5 ]}

El ejemplo más conocido de RdRp se encuentra en el poliovirus . El genoma viral está compuesto de ARN, que ingresa a la célula mediante endocitosis mediada por receptores . A partir de ahí, el ARN actúa como molde para la síntesis de ARN complementario. La cadena complementaria sirve como molde para la producción de nuevos genomas virales que se empaquetan y liberan de la célula, listos para infectar más células huésped . La ventaja de este método de replicación es que no requiere una etapa de ADN. La desventaja es que no se dispone de una copia de ADN de respaldo. ^{[ 6 ]}

Muchas RdRp se asocian fuertemente a las membranas , lo que dificulta su estudio. Las RdRp más conocidas son la 3Dpol del poliovirus, la proteína L del virus de la estomatitis vesicular ^{[ 7 ]} y la proteína NS5B del virus de la hepatitis C.

Muchos eucariotas poseen RdRp que participan en la interferencia de ARN : estas amplifican microARN y ARN temporales pequeños y producen ARN de doble cadena utilizando ARN de interferencia pequeños como cebadores. ^{[ 8 ]} Estas RdRp se utilizan en mecanismos de defensa y pueden ser apropiadas por virus de ARN. ^{[ 9 ]} Su historia evolutiva es anterior a la divergencia de los principales grupos eucariotas. ^{[ 10 ]}

La RdRp se diferencia de la ARN polimerasa dependiente de ADN en que cataliza la síntesis de ARN de cadenas complementarias a una plantilla de ARN determinada. El proceso de replicación del ARN es un mecanismo de cuatro pasos:

• Unión de nucleósido trifosfato (NTP): inicialmente, la RdRp presenta un sitio activo vacante en el que se une un NTP, complementario al nucleótido correspondiente en la cadena molde. La unión correcta del NTP provoca que la RdRp experimente un cambio conformacional. ^{[ 11 ]}
• Cierre del sitio activo: el cambio conformacional , iniciado por la unión correcta del NTP, da como resultado la restricción del acceso al sitio activo y produce un estado catalíticamente competente. ^{[ 11 ]}
• Formación del enlace fosfodiéster : dos iones Mg²⁺ ^están presentes en el estado catalíticamente activo y se disponen alrededor de la cadena de ARN recién sintetizada, de manera que el sustrato NTP experimenta una transferencia de fosfatidil y forma un enlace fosfodiéster con la nueva cadena. ^{[ 12 ]} Sin el uso de estos iones Mg²⁺ ^, el sitio activo deja de ser catalíticamente estable y el complejo RdRp cambia a una conformación abierta. ^{[ 12 ]}
• Translocación: una vez abierto el sitio activo, la cadena molde de ARN se mueve una posición a través del complejo proteico RdRp y continúa la elongación de la cadena mediante la unión de un nuevo NTP, a menos que el molde especifique lo contrario. ^{[ 11 ]}

La síntesis de ARN puede realizarse mediante un mecanismo independiente de cebador ( de novo ) o un mecanismo dependiente de cebador que utiliza un cebador unido al genoma de la proteína viral (VPg). ^{[ 13 ]} La iniciación de novo consiste en la adición de un NTP al 3'-OH del primer NTP iniciador. ^{[ 13 ]} Durante la fase de elongación posterior, esta reacción de transferencia de nucleótidos se repite con NTP subsiguientes para generar el producto de ARN complementario. La terminación de la cadena de ARN naciente producida por la RdRp no se conoce completamente; sin embargo, la terminación de la RdRp es independiente de la secuencia. ^{[ 14 ]}

Una desventaja importante de la replicación de la ARN polimerasa dependiente de ARN es la tasa de error de transcripción . ^{[ 13 ]} Las RdRp carecen de fidelidad del orden de 10⁴ ^nucleótidos , lo que se cree que es resultado directo de una corrección de pruebas inadecuada . ^{[ 13 ]} Esta tasa de variación se ve favorecida en los genomas virales, ya que permite al patógeno superar las defensas del huésped que intentan evitar la infección, lo que permite el crecimiento evolutivo. ^{[ 15 ]}

La RdRp viral/procariota, junto con muchas DdRp de una sola subunidad, emplean un plegamiento cuya organización se ha relacionado con la forma de una mano derecha con tres subdominios denominados dedos, palma y pulgar. ^{[ 16 ]} Solo el subdominio de la palma, compuesto por una lámina beta antiparalela de cuatro hebras con dos hélices alfa , está bien conservado. En la RdRp, el subdominio de la palma comprende tres motivos bien conservados (A, B y C). El motivo A (Dx(4,5)-D) y el motivo C (GDD) están yuxtapuestos espacialmente; los residuos de ácido aspártico de estos motivos están implicados en la unión de Mg ²⁺ y/o Mn ²⁺ . El residuo de asparagina del motivo B está involucrado en la selección de ribonucleósido trifosfatos sobre dNTPs y, por lo tanto, determina si se sintetiza ARN en lugar de ADN. ^{[ 17 ]} La organización de dominios ^{[ 18 ]} y la estructura 3D del centro catalítico de una amplia gama de RdRp, incluso aquellas con una baja homología de secuencia general, están conservadas. El centro catalítico está formado por varios motivos que contienen residuos de aminoácidos conservados.

La interferencia de ARN eucariota requiere una RdRp celular (c RdRp). A diferencia de las polimerasas "mano", se asemejan a las DdRP multisubunitarias simplificadas, específicamente en las subunidades catalíticas β/β', ya que utilizan dos conjuntos de barriles β de doble psi en el sitio activo. QDE1 ( Q9Y7G6 ) en Neurospora crassa , que tiene ambos barriles en la misma cadena, ^{[ 19 ]} es un ejemplo de dicha enzima ac RdRp. ^{[ 20 ]} Los homólogos de c RdRp en bacteriófagos , incluyendo la DdRp yonO ( O31945 ) de cadena simple similar , parecen estar más cerca de las c RdRp que las DdRP. ^{[ 8 ] [ 21 ]}

Cuatro superfamilias de virus abarcan todos los virus que contienen ARN y carecen de una fase de ADN:

• Virus que contienen ARN de cadena positiva o ARN de doble cadena, excepto retrovirus y Birnaviridae.
  • Todos los virus eucariotas de ARN de cadena positiva sin etapa de ADN, como Coronaviridae
  • Todos los bacteriófagos que contienen ARN ; las dos familias de bacteriófagos que contienen ARN son Fiersviridae (fagos de ARN monocatenario positivo) y Cystoviridae (fagos de ARN bicatenario).
  • Familia de virus dsRNA Reoviridae , Totiviridae , Hypoviridae , Partitiviridae
• Mononegavirales (virus de ARN de cadena negativa con genomas no segmentados; InterPro : IPR016269 ) 
• Virus de ARN de cadena negativa con genomas segmentados ( InterPro : IPR007099 ), como los ortomixovirus y los bunyavirus. 
• Familia de virus de ARN bicatenario Birnaviridae ( InterPro : IPR007100 ) 

Los flavivirus producen una poliproteína a partir del genoma de ARN monocatenario. Esta poliproteína se escinde en varios productos, uno de los cuales es NS5, una RdRp. Posee regiones cortas y motivos homólogos a otras RdRp. ^{[ 22 ]}

Las ARN replicasas encontradas en virus de ARN monocatenario de cadena positiva están relacionadas entre sí, formando tres grandes superfamilias. ^{[ 23 ]} La ARN replicasa de birnavirus es única porque carece del motivo C (GDD) en la palma. ^{[ 24 ]} La RdRp de mononegavirus (PDB 5A22) se ha clasificado automáticamente como similar a las RdRp de ARN monocatenario (+)−, específicamente una de Pestivirus y otra de Leviviridae . ^{[ 25 ]} El monómero de RdRp de bunyavirus (PDB 5AMQ) se asemeja al complejo heterotrimérico de la RdRp de ortomixovirus (influenza; PDB 4WSB). ^{[ 26 ]}

Dado que es una proteína universal en los virus que contienen ARN, RdRp es un marcador útil para comprender su evolución. ^{[ 27 ] [ 28 ]} Los virus portadores de RdRP se agrupan en el taxón Orthornavirae .

• Las RdRp pueden utilizarse como dianas farmacológicas para patógenos virales, ya que su función no es esencial para la supervivencia de los eucariotas. Al inhibir la función de la RdRp, no se pueden replicar nuevos ARN a partir de una cadena molde de ARN; sin embargo, la ARN polimerasa dependiente de ADN permanece funcional.
• Algunos fármacos antivirales contra la hepatitis C y la COVID-19 se dirigen específicamente a la RdRp. Estos incluyen sofosbuvir y ribavirina contra la hepatitis C ^{[ 33 ]} y remdesivir , un fármaco aprobado por la FDA contra la COVID-19.
• El trifosfato GS-441524 es un sustrato para la RdRp, pero no para las polimerasas de mamíferos. Provoca la terminación prematura de la cadena y la inhibición de la replicación viral. El trifosfato GS-441524 es la forma biológicamente activa del remdesivir. El remdesivir se clasifica como un análogo de nucleótido que inhibe la función de la RdRp al unirse covalentemente e interrumpir la terminación del ARN naciente mediante una terminación temprana o tardía, o al impedir una mayor elongación del polinucleótido de ARN. ^{[ 34 ] [ 35 ]} Esta terminación temprana conduce a un ARN no funcional que se degrada mediante procesos celulares normales.
• Baloxavir marboxil es un fármaco aprobado para el tratamiento de la infección por influenza. Además, suraxavir marboxil y tivoxavir marboxil se encuentran actualmente en ensayos clínicos para la misma indicación. El desarrollo de otro inhibidor, pimodivir , se ha interrumpido. ^{[ 36 ]}

El uso de RdRp juega un papel importante en la interferencia de ARN en eucariotas, un proceso utilizado para silenciar la expresión génica a través de pequeños ARN de interferencia ( siRNA ) que se unen al ARNm, inactivándolos. ^{[ 37 ]} La RdRp eucariota se activa en presencia de dsRNA y está menos extendida que otros componentes de la RNAi, ya que se ha perdido en algunos animales, aunque todavía se encuentra en C. elegans , P. tetraurelia ^{[ 38 ]} y plantas . ^{[ 39 ]} Esta presencia de dsRNA desencadena la activación de RdRp y los procesos de RNAi al preparar el inicio de la transcripción de ARN a través de la introducción de siRNA. ^{[ 38 ]} En C. elegans , los siRNA se integran en el complejo de silenciamiento inducido por ARN, RISC , que trabaja junto con los ARNm que son objeto de interferencia para reclutar más RdRp para sintetizar más siRNA secundarios y reprimir la expresión génica. ^{[ 40 ]}

• El monstruo de Spiegelman
• inhibidor de NS5B

• ARN+Replicasa en los Encabezamientos de Materia Médica (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• CE 2.7.7.48