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Determinación de la estructura de los ácidos nucleicos

Los métodos experimentales para determinar la estructura de los ácidos nucleicos , como el ARN y el ADN , se pueden clasificar en gran medida en métodos biofísicos y bioquímicos...

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Los métodos experimentales para determinar la estructura de los ácidos nucleicos , como el ARN y el ADN , se pueden clasificar en gran medida en métodos biofísicos y bioquímicos . Los métodos biofísicos utilizan las propiedades físicas fundamentales de las moléculas para la determinación de la estructura , incluyendo la cristalografía de rayos X , la RMN y la criomicroscopía electrónica . Los métodos bioquímicos aprovechan las propiedades químicas de los ácidos nucleicos mediante reactivos y condiciones específicas para analizar su estructura. [ 1 ] Estos métodos pueden implicar el análisis químico con reactivos específicos o basarse en la química nativa o análoga . Los diferentes enfoques experimentales tienen ventajas únicas y son adecuados para distintos propósitos experimentales.

Métodos biofísicos

cristalografía de rayos X

La cristalografía de rayos X no es común para los ácidos nucleicos aislados, ya que ni el ADN ni el ARN forman cristales con facilidad. Esto se debe al mayor grado de desorden intrínseco y dinamismo en las estructuras de los ácidos nucleicos, así como a las cadenas principales de (desoxi)ribosa-fosfato con carga negativa, que se repelen entre sí en proximidad. Por lo tanto, los ácidos nucleicos cristalizados tienden a formar complejos con una proteína de interés para proporcionar orden estructural y neutralizar la carga negativa.

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)

La RMN de ácidos nucleicos es el uso de la espectroscopia de RMN para obtener información sobre la estructura y la dinámica de las moléculas de ácidos nucleicos , como el ADN o el ARN . Hasta 2003, casi la mitad de todas las estructuras de ARN conocidas se habían determinado mediante espectroscopia de RMN. [ 2 ]

La RMN de ácidos nucleicos utiliza técnicas similares a las de la RMN de proteínas, pero presenta varias diferencias. Los ácidos nucleicos tienen un menor porcentaje de átomos de hidrógeno, que son los que se suelen observar en la RMN, y debido a que las dobles hélices de los ácidos nucleicos son rígidas y aproximadamente lineales, no se pliegan sobre sí mismas para generar correlaciones de "largo alcance". [ 3 ] Los tipos de RMN que se suelen realizar con ácidos nucleicos son la RMN de 1H o protón , la RMN de 13C , la RMN de 15N y la RMN de 31P . Casi siempre se utilizan métodos de RMN bidimensionales , como la espectroscopia de correlación (COSY) y la espectroscopia de transferencia de coherencia total (TOCSY) para detectar acoplamientos nucleares a través de enlaces, y la espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) para detectar acoplamientos entre núcleos cercanos en el espacio. [ 4 ]

Los parámetros obtenidos del espectro, principalmente los picos cruzados NOESY y las constantes de acoplamiento , pueden utilizarse para determinar características estructurales locales como los ángulos de los enlaces glucosídicos , los ángulos diedros (utilizando la ecuación de Karplus ) y las conformaciones de plegamiento del azúcar. Para la estructura a gran escala, estos parámetros locales deben complementarse con otras suposiciones o modelos estructurales, ya que los errores se acumulan a medida que se recorre la doble hélice y, a diferencia de las proteínas, la doble hélice no tiene un interior compacto ni se pliega sobre sí misma. La RMN también es útil para investigar geometrías no estándar como hélices curvadas , apareamiento de bases no Watson-Crick y apilamiento coaxial . Ha sido especialmente útil para estudiar la estructura de los oligonucleótidos de ARN naturales, que tienden a adoptar conformaciones complejas como bucles de tallo y pseudonudos . La RMN también es útil para estudiar la unión de moléculas de ácido nucleico a otras moléculas, como proteínas o fármacos, observando qué resonancias se desplazan tras la unión de la otra molécula. [ 4 ]

Microscopía electrónica criogénica (crio-EM)

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) es una técnica que utiliza un haz de electrones para obtener imágenes de muestras conservadas criogénicamente en una solución acuosa. Las muestras líquidas se pipetean sobre pequeñas rejillas metálicas y se sumergen en una solución líquida de etano/propano, mantenida a una temperatura extremadamente baja mediante un baño de nitrógeno líquido. Durante este proceso de congelación, las moléculas de agua de la muestra no tienen tiempo suficiente para formar redes hexagonales como las del hielo, por lo que la muestra se conserva en un estado vítreo similar al agua (también conocido como hielo vitrificado ), lo que facilita su observación mediante el haz de electrones. Una ventaja de la crio-EM sobre la cristalografía de rayos X es que las muestras se conservan en su estado de solución acuosa y no se ven afectadas por la formación de cristales. Una desventaja es la dificultad para resolver estructuras de ácidos nucleicos o proteínas de menos de ~75 kilodaltons , debido en parte a la dificultad de obtener suficiente contraste para localizar partículas en esta solución acuosa vitrificada. Otra desventaja es que para obtener información sobre la estructura a nivel atómico de una muestra se requiere tomar muchas imágenes (a menudo denominadas micrografías electrónicas) y promediarlas en un proceso llamado reconstrucción de partícula única . Este es un proceso computacionalmente intensivo.

La criomicroscopía electrónica (Cryo-EM) es una versión más reciente y menos invasiva de la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Es menos invasiva porque la muestra no se seca sobre una superficie (proceso que se realiza con frecuencia en la TEM de tinción negativa ) y porque la Cryo-EM no requiere agentes de contraste como sales de metales pesados ​​(por ejemplo, acetato de uranilo o ácido fosfotúngstico), que también pueden afectar la estructura de la biomolécula . La microscopía electrónica de transmisión, como técnica, utiliza el hecho de que las muestras interactúan con un haz de electrones y solo las partes de la muestra que no interactúan con el haz de electrones pueden "transmitir" al sistema de detección de electrones. La TEM, en general, ha sido una técnica útil para determinar la estructura de los ácidos nucleicos desde la década de 1960. [ 5 ] [ 6 ] Si bien la estructura del ADN de doble cadena (dsDNA) puede no ser considerada tradicionalmente como una estructura, en el sentido típico de segmentos alternados de regiones de cadena simple y doble, en realidad, el dsDNA no es simplemente una doble hélice perfectamente ordenada en cada lugar de su longitud debido a las fluctuaciones térmicas en el ADN y las estructuras alternativas que pueden formarse como los g-cuadruplexos . Se ha realizado crio-EM de ácido nucleico en ribosomas, [ 7 ] ARN viral, [ 8 ] y estructuras de ARN de cadena simple dentro de virus. [ 9 ] [ 10 ] Estos estudios han resuelto características estructurales a diferentes resoluciones desde el nivel de nucleobase (2-3 angstroms) hasta motivos de estructura terciaria (mayor que un nanómetro).

Sondeo químico

Figura esquemática que explica los pasos de un experimento típico de análisis químico para determinar la estructura de las moléculas de ARN.

El análisis químico del ARN utiliza sustancias químicas que reaccionan con los ARN. Es importante destacar que su reactividad depende de la estructura local del ARN, por ejemplo, del apareamiento de bases o de la accesibilidad. Por lo tanto, las diferencias en la reactividad pueden servir como una huella de la estructura a lo largo de la secuencia. Los diferentes reactivos reaccionan en distintas posiciones de la estructura del ARN y presentan diferentes espectros de reactividad. [ 1 ] Los avances recientes permiten el estudio simultáneo de la estructura de muchos ARN (análisis del transcriptoma completo) [ 11 ] y el análisis directo de moléculas de ARN en su entorno celular (análisis intracelular). [ 12 ]

El ARN estructurado se hace reaccionar primero con los reactivos de sondeo durante un tiempo de incubación determinado. Estos reactivos forman un aducto covalente en el ARN en el sitio de reacción. Cuando el ARN se transcribe inversamente mediante una transcriptasa inversa para generar una copia de ADN, el ADN resultante se trunca en las posiciones de reacción debido a que la enzima queda bloqueada por los aductos. Por lo tanto, la colección de moléculas de ADN de diferentes longitudes truncadas informa sobre la frecuencia de reacción en cada posición de base, lo que refleja el perfil estructural a lo largo del ARN. Tradicionalmente, esto se analiza mediante electroforesis en gel de ADN , y la intensidad de las bandas indica la frecuencia de truncamiento en cada posición. Enfoques recientes utilizan secuenciación de alto rendimiento para lograr el mismo propósito con mayor rendimiento y sensibilidad.

El perfil de reactividad puede utilizarse para estudiar el grado de estructura en posiciones particulares para hipótesis específicas, o utilizarse junto con algoritmos computacionales para producir un modelo de estructura completo respaldado experimentalmente. [ 13 ]

Dependiendo del reactivo químico utilizado, algunos reactivos, como los radicales hidroxilo, escinden la molécula de ARN. El resultado en el ADN truncado es el mismo. Algunos reactivos, como el DMS, a veces no bloquean la transcriptasa inversa, sino que provocan un error en el sitio de la copia de ADN. Estos errores pueden detectarse mediante métodos de secuenciación de alto rendimiento y, en ocasiones, se emplean para mejorar los resultados de la caracterización mediante perfiles mutacionales (MaP). [ 14 ] [ 15 ]

Las posiciones en el ARN pueden protegerse de los reactivos no solo por la estructura local, sino también por una proteína de unión en esa posición. Esto ha llevado a algunos estudios a utilizar sondas químicas para analizar también la unión de proteínas. [ 16 ]

Sondeo de radicales hidroxilo

Gel de sondeo de radicales hidroxilo que muestra bandas en posiciones y puntos que indican la fuerza de protección. [ 17 ]

Como los radicales hidroxilo tienen una vida corta en solución, es necesario generarlos experimentalmente. Esto se puede lograr utilizando H₂O₂ , ácido ascórbico y el complejo Fe(II)-EDTA. Estos reactivos forman un sistema que genera radicales hidroxilo mediante la reacción de Fenton . Los radicales hidroxilo pueden reaccionar con las moléculas de ácido nucleico. [ 17 ] Los radicales hidroxilo atacan el anillo de ribosa/desoxirribosa , lo que provoca la ruptura del esqueleto de azúcar-fosfato. Los sitios protegidos por proteínas de unión o por la estructura terciaria del ARN se escindirían por el radical hidroxilo a menor velocidad. [ 17 ] Por lo tanto, estas posiciones se manifestarían como ausencia de bandas en el gel o como una señal baja durante la secuenciación. [ 17 ] [ 18 ]

DMS

El sulfato de dimetilo , conocido como DMS, es una sustancia química que se puede utilizar para modificar los ácidos nucleicos con el fin de determinar su estructura secundaria. La reacción con DMS añade un aducto de metilo en el sitio, proceso conocido como metilación . En particular, el DMS metila el N1 de la adenina (A) y el N3 de la citosina (C) , [ 19 ] ambos ubicados en el sitio de los enlaces de hidrógeno naturales tras el apareamiento de bases. Por lo tanto, la modificación solo puede ocurrir en las nucleobases A y C, que son monocatenarias y forman pares de bases.La modificación puede ocurrir al final de una hélice o en un par de bases adyacente a un par de bases GU , siendo estas dos últimas posiciones donde el apareamiento de bases puede ocasionalmente romperse. Además, dado que los sitios modificados no pueden aparearse, pueden detectarse mediante RT-PCR, donde la transcriptasa inversa se detiene en las bases metiladas y produce diferentes ADNc truncados. Estos ADNc truncados pueden identificarse mediante electroforesis en gel o secuenciación de alto rendimiento.

Mejorando los métodos basados ​​en truncamiento, el perfilado mutacional DMS con secuenciación (DMS-MaPseq) puede detectar múltiples modificaciones DMS en una sola molécula de ARN, lo que permite obtener más información por lectura (para una lectura de 150 nt, típicamente dos o tres sitios de mutación, en lugar de cero o un sitio de truncamiento), determinar estructuras de ARN de baja abundancia e identificar subpoblaciones de ARN con estructuras secundarias alternativas. [ 20 ] DMS-MaPseq utiliza una transcriptasa inversa de intrón de grupo II termoestable (TGIRT) que crea una mutación (en lugar de un truncamiento) en el ADNc cuando encuentra una base metilada por DMS, pero de lo contrario, realiza la transcripción inversa con alta fidelidad. La secuenciación del ADNc resultante identifica qué bases fueron mutadas durante la transcripción inversa; estas bases no pueden haber estado apareadas en el ARN original.

La modificación con DMS también se puede utilizar para el ADN, por ejemplo, en el análisis de interacciones ADN-proteína. [ 21 ]

FORMA

La acilación selectiva de 2′- hidroxilo analizada mediante extensión de cebador , o SHAPE , aprovecha reactivos que modifican preferentemente la estructura principal del ARN en regiones estructuralmente flexibles.

El anhídrido 1-metil-7-nitroisatoico (1M7) sufre hidrólisis para formar aductos en la cadena principal de los nucleótidos de ARN no apareados.

Reactivos como el anhídrido N-metilisatoico (NMIA) y el anhídrido 1-metil-7-nitroisatoico (1M7) [ 22 ] reaccionan con el grupo 2'-hidroxilo para formar aductos en el 2'-hidroxilo del esqueleto del ARN. En comparación con los químicos utilizados en otras técnicas de sondeo de ARN, estos reactivos tienen la ventaja de ser en gran medida imparciales con respecto a la identidad de la base, a la vez que siguen siendo muy sensibles a la dinámica conformacional. Los nucleótidos que están restringidos (generalmente por el apareamiento de bases) muestran menos formación de aductos que los nucleótidos que no están apareados. La formación de aductos se cuantifica para cada nucleótido en un ARN dado mediante la extensión de un cebador de ADN complementario con transcriptasa inversa y la comparación de los fragmentos resultantes con los de un control no modificado. [ 23 ] SHAPE informa sobre la estructura del ARN a nivel de nucleótido individual. Estos datos pueden usarse como entrada para generar modelos de estructura secundaria de alta precisión. [ 24 ] SHAPE se ha utilizado para analizar diversas estructuras de ARN, incluyendo la de un genoma completo del VIH-1. [ 25 ] El mejor enfoque es utilizar una combinación de reactivos de sondaje químico y datos experimentales. [ 26 ] En SHAPE-Seq, SHAPE se extiende mediante multiplexación basada en códigos de barras combinada con RNA-Seq y puede realizarse de forma de alto rendimiento. [ 27 ]

Carbodiimidas

Estructura de CMCT utilizada en el sondeo de la estructura del ARN
Mecanismo de la reacción entre uracilo y carbodiimidas [ 28 ]

Los grupos carbodiimida también pueden formar aductos covalentes en las nucleobases expuestas de uracilo y, en menor medida, de guanina, tras el ataque nucleofílico de un nitrógeno desprotonado. Reaccionan principalmente con el N3 del uracilo y el N1 de la guanina, modificando dos sitios responsables de los enlaces de hidrógeno en las bases. [ 19 ]

El 1-ciclohexil-(2-morfolinoetil)carbodiimida meto- p- toluenosulfonato, también conocido como CMCT o CMC, es la carbodiimida más utilizada para el sondeo de la estructura del ARN. [ 29 ] [ 30 ] Al igual que el DMS, puede detectarse mediante transcripción inversa seguida de electroforesis en gel o secuenciación de alto rendimiento. Dado que reacciona con G y U, puede utilizarse para complementar los datos de los experimentos de sondeo con DMS, que proporcionan información sobre A y C. [ 31 ]

La 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida , también conocida como EDC, es una carbodiimida soluble en agua que presenta una reactividad similar a la de la CMC y se utiliza para el análisis químico de la estructura del ARN. La EDC puede penetrar en las células y, por lo tanto, se utiliza para el análisis directo del ARN dentro de las células en sus entornos nativos. [ 32 ] [ 28 ]

Ketoxal, glioxal y derivados

El ketoxal forma un aducto cíclico covalente con la guanina. [ 33 ]
Mecanismo de reacción entre 1,2-dicarbonilos y guanina. [ 34 ]

Algunos compuestos 1,2-dicarbonílicos pueden reaccionar con guanina (G) de cadena simple en N1 y N2, formando un aducto de anillo de cinco miembros en la cara de Watson-Crick.

La 1,1-dihidroxi-3-etoxi-2- butanona , también conocida como ketoxal , tiene una estructura relacionada con los 1,2-dicarbonilos y fue la primera de esta categoría ampliamente utilizada para el análisis químico del ARN. El ketoxal provoca la modificación de la guanina, alterando específicamente el N1 y el grupo amino exocíclico (N2) simultáneamente mediante interacción covalente. [ 35 ]

El glioxal , el metilglioxal y el fenilglioxal, que contienen el grupo 1,2-dicarbonilo clave, reaccionan con las guaninas libres de forma similar al quetoxal y pueden utilizarse para analizar bases de guanina no apareadas en el ARN estructurado. Debido a sus propiedades químicas, estos reactivos pueden penetrar fácilmente en las células y, por lo tanto, pueden utilizarse para analizar el ARN en su entorno celular nativo. [ 34 ]

Sondeo láser o NAz

La técnica LASER (examen estructural de ARN activado por luz) utiliza luz UV para activar la azida de nicotinoilo (NAz), generando un catión nitrenio altamente reactivo en agua, que reacciona con la guanosina y la adenosina accesibles al disolvente del ARN en la posición C-8 mediante una reacción de Friedel-Crafts sin barrera. La técnica LASER se dirige tanto a residuos de cadena simple como de cadena doble, siempre que sean accesibles al disolvente. Dado que la detección con radicales hidroxilo requiere radiación sincrotrón para medir la accesibilidad al disolvente del ARN in vivo , resulta difícil aplicarla para estudiar el ARN en células en muchos laboratorios. En cambio, la técnica LASER utiliza una lámpara UV portátil (20 W) para la excitación, lo que facilita su aplicación en el estudio in vivo de la accesibilidad al disolvente del ARN. Este método de detección química es controlable mediante luz y permite analizar la accesibilidad al disolvente de las nucleobases, lo que ha demostrado ser útil para identificar proteínas de unión al ARN dentro de las células. [ 36 ]

Sondeo en línea

Ensayo de sondeo en línea de ribointerruptores de guanina que muestra cambios en la flexibilidad en respuesta a varios ligandos de nucleótidos [ 37 ].

El sondeo en línea no implica el tratamiento con ningún tipo de químico o reactivo para modificar las estructuras del ARN. Este tipo de ensayo de sondeo utiliza la escisión del ARN dependiente de la estructura; las regiones monocatenarias son más flexibles e inestables y se degradarán con el tiempo. [ 38 ] El proceso de sondeo en línea se utiliza a menudo para determinar cambios en la estructura debido a la unión de ligandos. La unión de un ligando puede dar lugar a diferentes patrones de escisión. El proceso de sondeo en línea implica la incubación de ARN estructurales o funcionales durante un período prolongado. Este período puede ser de varios días, pero varía en cada experimento. Los productos incubados se analizan posteriormente en un gel para visualizar las bandas. Este experimento se suele realizar utilizando dos condiciones diferentes: 1) con ligando y 2) en ausencia de ligando. [ 37 ] La escisión da lugar a longitudes de banda más cortas e indica áreas que no están apareadas, ya que las regiones apareadas tienden a ser menos sensibles a la escisión espontánea. [ 38 ] El sondeo en línea es un ensayo funcional que se puede utilizar para determinar cambios estructurales en el ARN en respuesta a la unión de un ligando. Puede mostrar directamente el cambio en la flexibilidad y la unión de regiones de ARN en respuesta a un ligando, así como comparar esa respuesta con ligandos análogos. Este ensayo se utiliza comúnmente en estudios dinámicos, específicamente al examinar ribointerruptores . [ 38 ]

Mapeo de interferencia de análogos de nucleótidos (NAIM)

El mapeo de interferencia de análogos de nucleótidos (NAIM) es el proceso de usar análogos de nucleótidos, moléculas que son similares en algunos aspectos a los nucleótidos pero carecen de función, para determinar la importancia de un grupo funcional en cada ubicación de una molécula de ARN. [ 39 ] [ 40 ] El proceso de NAIM consiste en insertar un único análogo de nucleótido en un sitio único. Esto se puede hacer transcribiendo un ARN corto usando la ARN polimerasa T7 , luego sintetizando un oligonucleótido corto que contiene el análogo en una posición específica, luego ligándolos juntos en la plantilla de ADN usando una ligasa. [ 39 ] Los análogos de nucleótidos se marcan con un fosforotioato , luego se distinguen los miembros activos de la población de ARN de los miembros inactivos, luego se elimina la etiqueta de fosforotioato de los miembros inactivos y los sitios análogos se identifican usando electroforesis en gel y autorradiografía. [ 39 ] Esto indica un nucleótido funcionalmente importante, ya que la escisión del fosforotioato por el yodo da como resultado un ARN que se escinde en el sitio de inserción del análogo de nucleótido. Al correr estas moléculas de ARN truncadas en un gel, el nucleótido de interés se puede identificar en un experimento de secuenciación [ 40 ] Los resultados de la incorporación dirigida al sitio indican posiciones importantes donde, al correr en un gel, los ARN funcionales que tienen el análogo incorporado en esa posición tendrán una banda presente, pero si el análogo da como resultado no funcional, cuando las moléculas de ARN funcionales corren en un gel no habrá ninguna banda correspondiente a esa posición en el gel. [ 41 ] Este proceso se puede utilizar para evaluar un área completa, donde se colocan análogos en ubicaciones específicas del sitio, que difieren en un solo nucleótido, luego cuando se aíslan los ARN funcionales y se corren en un gel, todas las áreas donde se producen bandas indican nucleótidos no esenciales, pero las áreas donde no hay bandas del ARN funcional indican que la inserción de un análogo de nucleótido en esa posición hizo que la molécula de ARN se volviera no funcional [ 39 ]

Referencias

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