Amplificación por polimerasa recombinasa

La amplificación por polimerasa recombinasa (RPA) es una alternativa isotérmica de un solo tubo a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ^{[ 1 ]} Al agregar una enzima transcriptasa inversa a una reacción de RPA, puede detectar ARN además de ADN , sin necesidad de un paso separado para producir ADNc . ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]} Debido a que es isotérmica , la RPA puede usar equipos mucho más simples que la PCR, que requiere un termociclador . Funciona mejor a temperaturas de 37–42  °C y aún funciona, aunque más lentamente, a temperatura ambiente significa que las reacciones de RPA pueden en teoría ejecutarse rápidamente simplemente sosteniendo un tubo en la mano. Esto hace de la RPA una excelente candidata para desarrollar pruebas moleculares rápidas, de bajo costo y en el punto de atención. Una evaluación de calidad internacional de la detección molecular del virus de la fiebre del Valle del Rift tuvo un desempeño tan bueno como las mejores pruebas de RT-PCR, detectando muestras menos concentradas que no fueron detectadas por algunas pruebas de PCR y una prueba RT-LAMP . ^{[ 5 ]} RPA fue desarrollado y lanzado por TwistDx Ltd. (anteriormente conocida como ASM Scientific Ltd), una empresa de biotecnología con sede en Cambridge, Reino Unido.

El proceso RPA emplea tres enzimas centrales : una recombinasa , una proteína de unión a ADN monocatenario (SSB) y una polimerasa de desplazamiento de cadena . Las recombinasas son capaces de emparejar cebadores de oligonucleótidos con secuencias homólogas en ADN bicatenario, ^{[ 1 ]} las SSB se unen a las cadenas de ADN desplazadas y evitan que los cebadores se desplacen, y la polimerasa de desplazamiento de cadena comienza la síntesis de ADN donde el cebador se ha unido al ADN objetivo.

Al utilizar dos cebadores opuestos, de forma similar a la PCR, si la secuencia diana está presente, se inicia una reacción de amplificación exponencial del ADN  . No se requiere ninguna otra manipulación de la muestra, como la fusión térmica o química, para iniciar la amplificación. A temperaturas óptimas (37–42 °C), la reacción progresa rápidamente y da como resultado una amplificación específica del ADN desde solo unas pocas copias diana hasta niveles detectables, generalmente en 10 minutos, para la detección rápida de ADN o ARN genómico viral, ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]} ADN genómico bacteriano patógeno, ^{[ 9 ] [ 10 ]} así como ADN de aptámeros de longitud corta . ^{[ 11 ]}

Las tres enzimas RPA principales pueden complementarse con otras enzimas para proporcionar funcionalidad adicional. La adición de exonucleasa III permite el uso de una sonda exo para detección de fluorescencia en tiempo real, similar a la PCR en tiempo real. ^{[ 1 ]} La adición de endonucleasa IV significa que se puede usar una sonda nfo para la detección de la amplificación exitosa mediante tiras de flujo lateral . ^{[ 1 ] [ 6 ] [ 12 ]} Si se agrega una transcriptasa inversa que funciona a 37–42  °C, el ARN puede transcribirse inversamente y el ADNc producido amplificarse en un solo paso. Actualmente, solo la versión TwistAmp exo de RPA está disponible con la transcriptasa inversa incluida, aunque los usuarios pueden simplemente complementar otras reacciones TwistAmp con una transcriptasa inversa para producir el mismo efecto. Al igual que con la PCR, todas las formas de reacciones RPA pueden multiplexarse ​​mediante la adición de pares de cebadores/sondas adicionales, lo que permite la detección de múltiples analitos o un control interno en el mismo tubo.

RPA es una de las diversas técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos desarrolladas como técnica de diagnóstico molecular, frecuentemente con el objetivo de simplificar la instrumentación de laboratorio requerida en comparación con la PCR . Una lista parcial de otras técnicas de amplificación isotérmica incluye LAMP , NASBA , amplificación dependiente de helicasa (HDA) y reacción de amplificación de enzima de corte (NEAR). Las técnicas difieren en los detalles del diseño de los cebadores y el mecanismo de reacción , y en algunos casos (como RPA) utilizan cócteles de dos o más enzimas. Al igual que RPA, muchas de estas técnicas ofrecen tiempos de amplificación rápidos con el potencial de simplificar la instrumentación y resistencia reportada a sustancias presentes en muestras no purificadas que se sabe que inhiben la PCR. Con respecto al tiempo de amplificación, los termocicladores modernos con rampas de temperatura rápidas pueden reducir los tiempos de amplificación de PCR a menos de 30 minutos, particularmente para amplicones cortos utilizando ciclos de doble temperatura en lugar de los protocolos convencionales de tres temperaturas. ^{[ 13 ]} Además, las exigencias de la preparación de la muestra (incluida la lisis y la extracción de ADN o ARN, si fuera necesario) deben considerarse como parte del tiempo y la complejidad inherentes a la técnica. Estos requisitos varían según la técnica, así como el objetivo específico y el tipo de muestra.

En comparación con la PCR, las directrices para el diseño de cebadores y sondas para RPA están menos establecidas y pueden requerir cierto grado de ensayo y error, aunque resultados recientes indican que los cebadores de PCR estándar también pueden funcionar. ^{[ 14 ]} El principio general de un amplicón discreto delimitado por un cebador directo e inverso con una sonda fluorogénica interna (opcional) es similar a la PCR. Los cebadores de PCR se pueden usar directamente en RPA, pero su corta longitud implica que las tasas de recombinación son bajas y la RPA no será especialmente sensible ni rápida. Normalmente se necesitan cebadores de 30 a 38 bases para la formación eficiente del filamento de recombinasa y el rendimiento de la RPA. Esto contrasta con otras técnicas como LAMP, que utilizan un mayor número de cebadores sujetos a restricciones de diseño adicionales. Aunque el informe original de 2006 sobre RPA describe un conjunto funcional de componentes de reacción, la formulación actual (patentada) del kit TwistAmp es "sustancialmente diferente" ^{[ 15 ]} y solo está disponible a través del proveedor TwistDx. Esto contrasta con las mezclas de reacción para PCR , que están disponibles en muchos proveedores, o con las de LAMP o NASBA , cuya composición se publica libremente, lo que permite a los investigadores crear sus propios "kits" personalizados a partir de ingredientes económicos.

La literatura científica publicada generalmente carece de una comparación detallada del rendimiento de las técnicas de amplificación isotérmica, como RPA, HDA y LAMP, entre sí, y a menudo compara una única técnica isotérmica con un ensayo de PCR considerado como "estándar de oro". Esto dificulta juzgar las ventajas de estas técnicas independientemente de las afirmaciones de los fabricantes, inventores o promotores. Además, las características de rendimiento de cualquier técnica de amplificación son difíciles de separar del diseño de los cebadores: un conjunto de cebadores "bueno" para un objetivo en RPA puede proporcionar una amplificación más rápida o una detección más sensible que un conjunto de cebadores "malo" para LAMP en el mismo objetivo, pero lo contrario puede ser cierto para diferentes conjuntos de cebadores en un objetivo diferente. Una excepción es un estudio reciente que compara RT-qPCR, RT-LAMP y RPA para la detección del virus de Schmallenberg y el virus de la diarrea viral bovina , ^{[ 16 ]} que demuestra que cada técnica de amplificación tiene fortalezas y debilidades, que pueden variar según el objetivo, y que las propiedades de las técnicas de amplificación disponibles deben evaluarse en combinación con los requisitos de cada aplicación. Al igual que ocurre con la PCR y cualquier otra técnica de amplificación, puede existir un sesgo de publicación , y rara vez se considera que los conjuntos de cebadores con un rendimiento deficiente merezcan ser publicados.