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metilación del ADN

Grupo metilo H 3 C añadido a una nucleobase ( citosina ) Representación de una molécula de ADN metilada. Las dos esferas blancas representan grupos metilo . Estos grupos están u...

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Grupo metilo H 3 C añadido a una nucleobase ( citosina )
Representación de una molécula de ADN metilada. Las dos esferas blancas representan grupos metilo . Estos grupos están unidos a dos moléculas de nucleótidos de citosina que componen la secuencia de ADN.

La metilación del ADN es un proceso biológico mediante el cual se añaden grupos metilo a la molécula de ADN . La metilación puede modificar la actividad de un segmento de ADN sin alterar su secuencia. Cuando se localiza en el promotor de un gen , la metilación del ADN suele reprimir la transcripción génica . En mamíferos, la metilación del ADN es esencial para el desarrollo normal y está asociada a diversos procesos clave, como la impronta genómica , la inactivación del cromosoma X , la represión de elementos transponibles , el envejecimiento y la carcinogénesis .

Hasta 2016, se habían encontrado dos nucleobases en las que tiene lugar la metilación enzimática natural del ADN: adenina y citosina . Las bases modificadas son N 6 -metiladenina, [ 1 ] 5-metilcitosina [ 2 ] y N 4 -metilcitosina. [ 3 ]

La metilación de la citosina está muy extendida tanto en eucariotas como en procariotas , aunque la tasa de metilación del ADN de la citosina puede variar mucho entre especies: el 14% de las citosinas están metiladas en Arabidopsis thaliana , del 4% al 8% en Physarum , [ 4 ] el 7,6% en Mus musculus , el 2,3% en Escherichia coli , el 0,03% en Drosophila ; la metilación es esencialmente indetectable en Dictyostelium ; [ 5 ] [ 6 ] y prácticamente ausente (0,0002 a 0,0003%) en Caenorhabditis [ 7 ] o en hongos como Saccharomyces cerevisiae y S. pombe (pero no en N. crassa ). [ 8 ] [ 9 ] : 3699 Se ha observado metilación de adenina en el ADN bacteriano y vegetal, y recientemente también en el ADN de mamíferos, [ 10 ] [ 11 ] pero ha recibido considerablemente menos atención.

La metilación de la citosina para formar 5-metilcitosina ocurre en la misma posición 5 del anillo de pirimidina donde se encuentra el grupo metilo de la timina , la base del ADN; esta misma posición distingue a la timina de la uracilo , la base análoga del ARN, que carece de grupo metilo. La desaminación espontánea de la 5-metilcitosina la convierte en timina. Esto produce un desajuste T:G. Los mecanismos de reparación lo corrigen, restaurando el par C:G original; alternativamente, pueden sustituir la guanina por adenina, convirtiendo el par C:G original en un par T:A, lo que implica un cambio de base y la introducción de una mutación. Esta base mal incorporada no se corregirá durante la replicación del ADN, ya que la timina es una base del ADN. Si el desajuste no se repara y la célula entra en el ciclo celular, la hebra que contiene la timina será complementada por una adenina en una de las células hijas, de modo que la mutación se vuelve permanente. El uso casi universal de timina exclusivamente en el ADN y de uracilo exclusivamente en el ARN puede haber evolucionado como un mecanismo de control de errores, para facilitar la eliminación de los uracilos generados por la desaminación espontánea de la citosina. [ 12 ] Se ha pensado que la metilación del ADN, así como varias de sus metiltransferasas de ADN contemporáneas (DNMT), evolucionaron a partir de la actividad primitiva de metilación del ARN en los primeros mundos , y esto está respaldado por varias líneas de evidencia. [ 13 ]

En plantas y otros organismos, la metilación del ADN se encuentra en tres contextos de secuencia diferentes: CG (o CpG ), CHG o CHH (donde H corresponde a A, T o C). En mamíferos, sin embargo, la metilación del ADN se encuentra casi exclusivamente en dinucleótidos CpG, con las citosinas en ambas hebras generalmente metiladas. No obstante, la metilación no CpG puede observarse en células madre embrionarias , [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] y también se ha indicado en el desarrollo neural . [ 17 ] Además, la metilación no CpG también se ha observado en células progenitoras hematopoyéticas , y ocurrió principalmente en un contexto de secuencia CpApC. [ 18 ]

Función conservada de la metilación del ADN

Panorama típico de metilación del ADN en mamíferos

El panorama de metilación del ADN en vertebrados es particular en comparación con otros organismos. En mamíferos, alrededor del 75 % de los dinucleótidos CpG están metilados en células somáticas , [ 19 ] y la metilación del ADN aparece como un estado predeterminado que debe excluirse específicamente de ubicaciones definidas. [ 16 ] [ 20 ] Por el contrario, el genoma de la mayoría de las plantas, invertebrados, hongos o protistas muestra patrones de metilación en mosaico, donde solo se dirigen elementos genómicos específicos, y se caracterizan por la alternancia de dominios metilados y no metilados. [ 21 ] [ 22 ]

Metilación de la citosina y luego desaminación a timina.

La alta metilación de CpG en los genomas de mamíferos tiene un costo evolutivo, ya que aumenta la frecuencia de mutaciones espontáneas. La pérdida de grupos amino ocurre con alta frecuencia en las citosinas, con diferentes consecuencias según su metilación. Los residuos de C metilados se desaminan espontáneamente para formar residuos de T con el tiempo; por lo tanto, los dinucleótidos CpG se desaminan progresivamente a dinucleótidos TpG, lo cual se evidencia por la baja representación de dinucleótidos CpG en el genoma humano (aparecen solo al 21% de la frecuencia esperada). [ 23 ] (Por otro lado, la desaminación espontánea de residuos de C no metilados da lugar a residuos de U, un cambio que la célula reconoce y repara rápidamente).

Islas CpG

En los mamíferos, la única excepción a este agotamiento global de CpG reside en una categoría específica de secuencias ricas en GC y CpG denominadas islas CpG que generalmente no están metiladas y, por lo tanto, conservan el contenido de CpG esperado. [ 24 ] Las islas CpG se definen generalmente como regiones con: 1) una longitud mayor a 200 pb, 2) un contenido de G+C mayor al 50%, 3) una relación de CpG observado a esperado mayor a 0,6, aunque a veces se utilizan otras definiciones. [ 25 ] Excluyendo las secuencias repetidas, hay alrededor de 25.000 islas CpG en el genoma humano, el 75% de las cuales tienen menos de 850 pb de longitud. [ 23 ] Son unidades reguladoras importantes y alrededor del 50% de las islas CpG se encuentran en regiones promotoras de genes, mientras que otro 25% se encuentran en cuerpos de genes, a menudo sirviendo como promotores alternativos. Recíprocamente, alrededor del 60-70% de los genes humanos tienen una isla CpG en su región promotora. [ 26 ] [ 27 ] La mayoría de las islas CpG no están metiladas constitutivamente y presentan una alta probabilidad de modificación permisiva de la cromatina, como la metilación de H3K4 . En los tejidos somáticos, solo el 10% de las islas CpG están metiladas, y la mayoría se localizan en regiones intergénicas e intragénicas.

Represión de promotores ricos en CpG

La metilación del ADN probablemente estaba presente en cierta medida en los primeros ancestros eucariotas. En prácticamente todos los organismos analizados, la metilación en las regiones promotoras se correlaciona negativamente con la expresión génica. [ 21 ] [ 28 ] Los promotores densos en CpG de genes activamente transcritos nunca están metilados, pero, recíprocamente, los genes transcripcionalmente silentes no necesariamente llevan un promotor metilado. En ratones y humanos, alrededor del 60-70% de los genes tienen una isla CpG en su región promotora y la mayoría de estas islas CpG permanecen sin metilar independientemente de la actividad transcripcional del gen, tanto en tipos celulares diferenciados como indiferenciados. [ 29 ] [ 30 ] Cabe destacar que, si bien la metilación del ADN de las islas CpG está inequívocamente vinculada con la represión transcripcional, la función de la metilación del ADN en promotores pobres en CG sigue sin estar clara; aunque hay poca evidencia de que pueda ser funcionalmente relevante. [ 31 ]

La metilación del ADN puede afectar la transcripción de genes de dos maneras. Primero, la metilación del ADN en sí misma puede impedir físicamente la unión de proteínas transcripcionales al gen, [ 32 ] y segundo, y probablemente más importante, el ADN metilado puede unirse a proteínas conocidas como proteínas con dominio de unión a metil-CpG (MBD). Las proteínas MBD reclutan entonces proteínas adicionales al locus, como histona deacetilasas y otras proteínas de remodelación de la cromatina que pueden modificar las histonas , formando así una cromatina compacta e inactiva, denominada heterocromatina . Este vínculo entre la metilación del ADN y la estructura de la cromatina es importante. En particular, la pérdida de la proteína 2 con dominio de unión a metil-CpG (MeCP2) se ha relacionado con el síndrome de Rett ; y la proteína 2 con dominio de unión a metil-CpG (MBD2) media el silenciamiento transcripcional de genes hipermetilados en el cáncer.

Represión de elementos transponibles

La metilación del ADN es un potente represor transcripcional, al menos en contextos densos de CpG. La represión transcripcional de los genes codificadores de proteínas parece limitarse esencialmente a clases específicas de genes que necesitan permanecer silenciados permanentemente y en casi todos los tejidos. Si bien la metilación del ADN no posee la flexibilidad necesaria para el ajuste fino de la regulación génica, su estabilidad es perfecta para asegurar el silenciamiento permanente de los elementos transponibles . [ 33 ] El control de los transposones es una de las funciones más antiguas de la metilación del ADN, compartida por animales, plantas y múltiples protistas. [ 34 ] Incluso se sugiere que la metilación del ADN evolucionó precisamente para este propósito. [ 35 ]

Expansión del genoma

Se sabe que la metilación del ADN de los elementos transponibles está relacionada con la expansión del genoma. Sin embargo, el motor evolutivo de dicha expansión sigue siendo desconocido. Existe una clara correlación entre el tamaño del genoma y los CpG, lo que sugiere que la metilación del ADN de los elementos transponibles provocó un aumento notable en la masa del ADN. [ 36 ]

Metilación del cuerpo del gen de genes altamente transcritos

Una función que parece incluso más conservada que el silenciamiento de transposones está correlacionada positivamente con la expresión génica. En casi todas las especies donde está presente la metilación del ADN, esta se enriquece especialmente en el cuerpo de los genes altamente transcritos. [ 21 ] [ 28 ] La función de la metilación del cuerpo del gen no se comprende bien. Un conjunto de evidencia sugiere que podría regular el empalme [ 37 ] y suprimir la actividad de las unidades transcripcionales intragénicas (promotores crípticos o elementos transponibles). [ 38 ] La metilación del cuerpo del gen parece estar estrechamente ligada a la metilación de H3K36. En levaduras y mamíferos, la metilación de H3K36 está altamente enriquecida en el cuerpo de los genes altamente transcritos. En levaduras, al menos, H3K36me3 recluta enzimas como las histonas deacetilasas para condensar la cromatina y prevenir la activación de sitios de inicio crípticos. [ 39 ] En los mamíferos, el dominio PWWP de DNMT3a y DNMT3b se une a H3K36me3 y las dos enzimas son reclutadas al cuerpo de los genes que se transcriben activamente.

En los mamíferos

Dinámica de la metilación del ADN durante el desarrollo embrionario del ratón. E3.5-E6, etc., se refieren a los días posteriores a la fecundación. PGC: células germinales primordiales .

Durante el desarrollo embrionario

Los patrones de metilación del ADN se borran y luego se restablecen en gran medida entre generaciones en mamíferos. Casi todas las metilaciones de los padres se borran, primero durante la gametogénesis y nuevamente en la embriogénesis temprana , con desmetilación y remetilación ocurriendo en cada caso. La desmetilación en la embriogénesis temprana ocurre en el período de preimplantación en dos etapas: inicialmente en el cigoto , luego durante los primeros ciclos de replicación embrionaria de mórula y blástula . Luego tiene lugar una ola de metilación durante la etapa de implantación del embrión, con islas CpG protegidas de la metilación. Esto resulta en una represión global y permite que los genes constitutivos se expresen en todas las células. En la etapa posterior a la implantación, los patrones de metilación son específicos de la etapa y del tejido, con cambios que definirían cada tipo celular individual que perduran de forma estable durante un largo período. [ 40 ] Estudios sobre los brotes de las extremidades de ratas durante la embriogénesis han ilustrado aún más la naturaleza dinámica de la metilación del ADN en el desarrollo. En este contexto, se observaron variaciones en la metilación global del ADN en diferentes etapas de desarrollo y condiciones de cultivo, lo que resalta la intrincada regulación de la metilación durante la organogénesis y sus posibles implicaciones para las estrategias de medicina regenerativa. [ 41 ]

Aunque la metilación del ADN no es necesaria per se para el silenciamiento transcripcional, se cree que representa un estado "bloqueado" que inactiva definitivamente la transcripción. En particular, la metilación del ADN parece fundamental para el mantenimiento del silenciamiento monoalélico en el contexto de la impronta genómica y la inactivación del cromosoma X. [ 42 ] [ 43 ] En estos casos, los alelos expresados ​​y silenciados difieren por su estado de metilación, y la pérdida de la metilación del ADN resulta en la pérdida de la impronta y la reexpresión de Xist en las células somáticas. Durante el desarrollo embrionario, pocos genes cambian su estado de metilación, con la importante excepción de varios genes que se expresan específicamente en la línea germinal. [ 44 ] La metilación del ADN parece absolutamente necesaria en las células diferenciadas , ya que la eliminación de cualquiera de las tres ADN metiltransferasas competentes resulta en letalidad embrionaria o posparto. Por el contrario, la metilación del ADN es prescindible en tipos celulares indiferenciados, como la masa celular interna del blastocisto, las células germinales primordiales o las células madre embrionarias. Dado que la metilación del ADN parece regular directamente solo un número limitado de genes, aún se desconoce cómo la ausencia de metilación del ADN provoca la muerte de las células diferenciadas.

Debido al fenómeno de la impronta genómica , los genomas materno y paterno se marcan de forma diferencial y deben reprogramarse adecuadamente cada vez que pasan por la línea germinal. Por lo tanto, durante la gametogénesis , las células germinales primordiales deben borrar y restablecer sus patrones de metilación del ADN biparentales originales según el sexo del progenitor transmisor. Tras la fecundación, los genomas paterno y materno se desmetilan y remetilan de nuevo (excepto en las regiones diferencialmente metiladas asociadas a genes improntados). Es probable que esta reprogramación sea necesaria para la totipotencia del embrión recién formado y la eliminación de los cambios epigenéticos adquiridos. [ 45 ]

En el cáncer

La hipometilación global se produce cuando los grupos metilo no se unen a las islas CpG, lo que provoca la expresión de un oncogén cuando no debería. En el diagrama, la célula 1 está libre de cáncer, ya que no presenta hipometilación. A continuación, observamos un ejemplo de hipometilación donde los grupos metilo no se unen, lo que provoca la expresión de un oncogén e induce el desarrollo del cáncer. La metilación también puede silenciar un gen supresor de tumores. En el diagrama, vemos que la célula 3 está libre de cáncer, ya que no hay hipermetilación , lo que significa que los grupos metilo no se unen activamente ni silencian un gen supresor de tumores. En la célula 4, la hipermetilación impide la expresión del gen supresor de tumores. [ 46 ]

En múltiples procesos patológicos, como el cáncer , las islas CpG de los promotores genéticos adquieren una hipermetilación anormal, lo que resulta en un silenciamiento transcripcional que puede ser heredado por las células hijas tras la división celular. [ 47 ] Las alteraciones de la metilación del ADN se han reconocido como un componente importante del desarrollo del cáncer. La hipometilación, en general, surge antes y está vinculada a la inestabilidad cromosómica y la pérdida de impronta, mientras que la hipermetilación se asocia con los promotores y puede surgir secundariamente al silenciamiento génico (supresor de oncogenes), pero podría ser un objetivo para la terapia epigenética . [ 48 ] En contextos de desarrollo, los cambios dinámicos en los patrones de metilación del ADN también tienen implicaciones significativas. Por ejemplo, en los brotes de las extremidades de ratas, los cambios en el estado de metilación se asociaron con diferentes etapas de la condrogénesis , lo que sugiere un vínculo potencial entre la metilación del ADN y la progresión de ciertos procesos de desarrollo. [ 41 ]

La hipometilación global también se ha relacionado con el desarrollo y la progresión del cáncer a través de diferentes mecanismos. [ 49 ] Típicamente, hay hipermetilación de genes supresores de tumores e hipometilación de oncogenes . [ 50 ]

Generalmente, durante la progresión al cáncer, cientos de genes se silencian o activan . Si bien el silenciamiento de algunos genes en el cáncer se produce por mutación, una gran proporción del silenciamiento génico carcinogénico es resultado de una metilación del ADN alterada (véase Metilación del ADN en el cáncer ). La metilación del ADN que provoca el silenciamiento en el cáncer suele ocurrir en múltiples sitios CpG en las islas CpG presentes en los promotores de los genes que codifican proteínas.

Las alteraciones en la expresión de los microARN también silencian o activan múltiples genes en la progresión hacia el cáncer (véase microARN en el cáncer ). La alteración en la expresión de los microARN se produce mediante la hiper/hipometilación de los sitios CpG en las islas CpG de los promotores que controlan la transcripción de los microARN .

El silenciamiento de los genes de reparación del ADN mediante la metilación de las islas CpG en sus promotores parece ser especialmente importante en la progresión hacia el cáncer (véase metilación de los genes de reparación del ADN en el cáncer ).

En la aterosclerosis

Las modificaciones epigenéticas, como la metilación del ADN, se han relacionado con enfermedades cardiovasculares, incluida la aterosclerosis . En modelos animales de aterosclerosis, el tejido vascular , así como las células sanguíneas, como las células mononucleares, presentan hipometilación global con áreas de hipermetilación específicas de genes. Los polimorfismos de metilación del ADN pueden utilizarse como biomarcadores tempranos de la aterosclerosis, ya que están presentes antes de que se observen las lesiones, lo que podría proporcionar una herramienta temprana para la detección y la prevención del riesgo. [ 51 ]

Dos de los tipos celulares afectados por los polimorfismos de metilación del ADN son los monocitos y los linfocitos, que experimentan una hipometilación general. Un mecanismo propuesto para explicar esta hipometilación global son los niveles elevados de homocisteína que causan hiperhomocisteinemia , un factor de riesgo conocido para la enfermedad cardiovascular. Los altos niveles plasmáticos de homocisteína inhiben las ADN metiltransferasas, lo que provoca hipometilación. La hipometilación del ADN afecta a genes que alteran la proliferación de las células del músculo liso, causan disfunción de las células endoteliales y aumentan los mediadores inflamatorios, todos ellos cruciales en la formación de lesiones ateroscleróticas. [ 52 ] Los altos niveles de homocisteína también dan lugar a la hipermetilación de las islas CpG en la región promotora del gen del receptor de estrógeno alfa (ERα), lo que provoca su regulación negativa. [ 53 ] El ERα protege contra la aterosclerosis debido a su acción como supresor del crecimiento, lo que hace que las células del músculo liso permanezcan en un estado quiescente. [ 54 ] La hipermetilación del promotor ERα permite así que las células musculares lisas de la íntima proliferen excesivamente y contribuyan al desarrollo de la lesión aterosclerótica. [ 55 ]

Otro gen que experimenta un cambio en su estado de metilación en la aterosclerosis es el transportador de monocarboxilato (MCT3), que produce una proteína responsable del transporte de lactato y otros cuerpos cetónicos fuera de diversos tipos celulares, incluidas las células del músculo liso vascular. En pacientes con aterosclerosis, se observa un aumento en la metilación de las islas CpG en el exón 2, lo que disminuye la expresión de la proteína MCT3. La disminución de la expresión de MCT3 altera el transporte de lactato y aumenta significativamente la proliferación de las células del músculo liso, lo que contribuye aún más a la lesión aterosclerótica. Un experimento ex vivo con el agente desmetilante Decitabina (5-aza-2-desoxicitidina) demostró inducir la expresión de MCT3 de forma dosis-dependiente, ya que todos los sitios hipermetilados en la isla CpG del exón 2 se desmetilaron tras el tratamiento. Esto podría constituir un nuevo agente terapéutico para el tratamiento de la aterosclerosis, aunque hasta la fecha no se han realizado estudios en humanos. [ 56 ]

En caso de insuficiencia cardíaca

Además de la aterosclerosis descrita anteriormente, se han identificado cambios epigenéticos específicos en el corazón humano con insuficiencia cardíaca. Esto puede variar según la etiología de la enfermedad. Por ejemplo, en la insuficiencia cardíaca isquémica, los cambios en la metilación del ADN se han relacionado con cambios en la expresión génica que pueden dirigir la expresión génica asociada con los cambios en el metabolismo cardíaco que se sabe que ocurren. [ 57 ] Se deben explorar otras formas de insuficiencia cardíaca (p. ej., miocardiopatía diabética) y comorbilidades (p. ej., obesidad) para ver cuán comunes son estos mecanismos. Lo más llamativo es que, en el corazón humano con insuficiencia cardíaca, estos cambios en la metilación del ADN están asociados con el estatus racial y socioeconómico, lo que influye aún más en cómo se altera la expresión génica, [ 58 ] y puede influir en cómo se debe tratar la insuficiencia cardíaca del individuo.

En el envejecimiento

En humanos y otros mamíferos, los niveles de metilación del ADN pueden utilizarse para estimar con precisión la edad de los tejidos y los tipos de células, formando un reloj epigenético preciso . [ 59 ]

Un estudio longitudinal de niños gemelos mostró que, entre los 5 y los 10 años, hubo divergencia en los patrones de metilación debido a influencias ambientales más que genéticas. [ 60 ] Hay una pérdida global de metilación del ADN durante el envejecimiento. [ 50 ]

En un estudio que analizó los metilomas completos del ADN de las células T CD4 + en un recién nacido, un individuo de 26 años y un individuo de 103 años, se observó que la pérdida de metilación es proporcional a la edad. [ 61 ] Los CpG hipometilados observados en los ADN centenarios en comparación con los neonatos cubrieron todos los compartimentos genómicos (promotores, regiones intergénicas , intrónicas y exónicas ). [ 61 ] Sin embargo, algunos genes se hipermetilan con la edad, incluidos los genes para el receptor de estrógeno , p16 , factor de crecimiento similar a la insulina 2 , [ 50 ] ELOVL2 [ 62 ] y FHL2 [ 63 ]

En ejercicio

Se ha demostrado que el ejercicio de alta intensidad produce una reducción de la metilación del ADN en el músculo esquelético. [ 64 ] La metilación del promotor de PGC-1α y PDK4 se redujo inmediatamente después del ejercicio de alta intensidad, mientras que la metilación de PPAR-δ no se redujo hasta tres horas después del ejercicio. [ 64 ] Al mismo tiempo, seis meses de ejercicio en hombres de mediana edad previamente sedentarios produjeron un aumento de la metilación en el tejido adiposo . [ 65 ] Un estudio mostró un posible aumento en la metilación global del ADN genómico de los glóbulos blancos con una mayor actividad física en personas no hispanas. [ 66 ]

En la diferenciación de células B

Un estudio que investigó el metiloma de las células B a lo largo de su ciclo de diferenciación, utilizando la secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS), mostró que existe hipometilación desde las etapas más tempranas hasta las más diferenciadas. La mayor diferencia de metilación se observa entre las etapas de las células B del centro germinal y las células B de memoria. Además, este estudio mostró que existe una similitud entre los tumores de células B y las células B de larga vida en sus firmas de metilación del ADN. [ 18 ]

En el cerebro

Dos revisiones resumen la evidencia de que las alteraciones de la metilación del ADN en las neuronas cerebrales son importantes en el aprendizaje y la memoria. [ 67 ] [ 68 ] El condicionamiento del miedo contextual (una forma de aprendizaje asociativo) en animales, como ratones y ratas, es rápido y extremadamente robusto en la creación de recuerdos. [ 69 ] En ratones [ 70 ] y en ratas [ 71 ] el condicionamiento del miedo contextual, dentro de 1 a 24 horas, se asocia con metilaciones alteradas de varios miles de citosinas de ADN en genes de neuronas del hipocampo . Veinticuatro horas después del condicionamiento del miedo contextual, el 9,2% de los genes en las neuronas del hipocampo de la rata están metilados diferencialmente. [ 71 ] En ratones, [ 70 ] cuando se examinaron cuatro semanas después del condicionamiento, las metilaciones y desmetilaciones del hipocampo se habían restablecido a las condiciones originales ingenuas. El hipocampo es necesario para formar recuerdos, pero los recuerdos no se almacenan allí. Para estos ratones, a las cuatro semanas después del condicionamiento de miedo contextual, se produjeron metilaciones y desmetilaciones diferenciales sustanciales de CpG en las neuronas corticales durante el mantenimiento de la memoria, y había 1223 genes diferencialmente metilados en su corteza cingulada anterior. [ 70 ] Los mecanismos que guían las nuevas metilaciones y desmetilaciones de ADN en el hipocampo durante el establecimiento de la memoria se resumieron en 2022. [ 72 ] Esa revisión también indicó los mecanismos por los cuales los nuevos patrones de metilación dieron lugar a nuevos patrones de expresión de ARN mensajero . Estos nuevos ARN mensajeros fueron luego transportados por partículas de RNP mensajero (gránulos neuronales) a las sinapsis de las neuronas, donde podían ser traducidos a proteínas. [ 72 ] Los cambios activos en la metilación y desmetilación del ADN neuronal parecen actuar como controladores de la escala sináptica y el tráfico de receptores de glutamato en el aprendizaje y la formación de la memoria . [ 67 ]

ADN metiltransferasas (en mamíferos)

Posibles vías de metilación y desmetilación de la citosina. Abreviaturas: S-adenosil-L-homocisteína ( SAH ), S-adenosil-L-metionina ( SAM ), ADN metiltransferasa ( ADN MTasa ), uracilo-ADN glicosilasa ( UNG ).

En las células de mamíferos, la metilación del ADN ocurre principalmente en la posición C5 de los dinucleótidos CpG y es llevada a cabo por dos clases generales de actividades enzimáticas: metilación de mantenimiento y metilación de novo . [ 73 ]

La actividad de metilación de mantenimiento es necesaria para preservar la metilación del ADN después de cada ciclo de replicación celular. Sin la ADN metiltransferasa (DNMT), la maquinaria de replicación produciría hebras hijas no metiladas, lo que, con el tiempo, conduciría a la desmetilación pasiva. Se ha propuesto que la DNMT1 es la metiltransferasa de mantenimiento responsable de copiar los patrones de metilación del ADN a las hebras hijas durante la replicación. Los modelos de ratón con ambas copias de DNMT1 eliminadas presentan letalidad embrionaria aproximadamente al noveno día, debido a que la actividad de DNMT1 es esencial para el desarrollo de las células de mamíferos.

Se cree que DNMT3A y DNMT3B son las metiltransferasas de novo que establecen los patrones de metilación del ADN en las primeras etapas del desarrollo. DNMT3L es una proteína homóloga a las otras DNMT3, pero carece de actividad catalítica. En cambio, DNMT3L asiste a las metiltransferasas de novo aumentando su capacidad de unión al ADN y estimulando su actividad. Los ratones y las ratas poseen una tercera enzima metiltransferasa de novo funcional , denominada DNMT3C, que evolucionó como parálogo de Dnmt3b mediante duplicación en tándem en el ancestro común de los roedores Muroidea. DNMT3C cataliza la metilación de los promotores de los elementos transponibles durante la espermatogénesis temprana, una actividad que se ha demostrado esencial para su represión epigenética y la fertilidad masculina. [ 74 ] [ 75 ] Todavía no está claro si otros mamíferos que no tienen DNMT3C (como los humanos) dependen de DNMT3B o DNMT3A para la metilación de novo de elementos transponibles en la línea germinal. Finalmente, se ha identificado a DNMT2 (TRDMT1) como un homólogo de la ADN metiltransferasa, que contiene los 10 motivos de secuencia comunes a todas las ADN metiltransferasas; sin embargo, DNMT2 (TRDMT1) no metila el ADN, sino que metila la citosina-38 en el bucle del anticodón del ARN de transferencia de ácido aspártico. [ 76 ]

Dado que algunos genes supresores de tumores se silencian por metilación del ADN durante la carcinogénesis , se han realizado intentos para reexpresar estos genes inhibiendo las DNMT. La 5-aza-2'-deoxicitidina ( decitabina ) es un análogo de nucleósido que inhibe las DNMT al atraparlas en un complejo covalente en el ADN, impidiendo así la etapa de β-eliminación de la catálisis y, por consiguiente, la degradación de las enzimas. Sin embargo, para que la decitabina sea activa, debe incorporarse al genoma celular, lo que puede causar mutaciones en las células hijas si la célula no muere. Además, la decitabina es tóxica para la médula ósea, lo que limita su ventana terapéutica. Estos inconvenientes han llevado al desarrollo de terapias con ARN antisentido que actúan sobre las DNMT degradando sus ARNm e impidiendo su traducción . No obstante, actualmente se desconoce si la inhibición de DNMT1 por sí sola es suficiente para reactivar los genes supresores de tumores silenciados por metilación del ADN.

En las plantas

Se han logrado avances significativos en la comprensión de la metilación del ADN en la planta modelo Arabidopsis thaliana . La metilación del ADN en plantas difiere de la de los mamíferos: mientras que en los mamíferos la metilación del ADN ocurre principalmente en el nucleótido citosina en un sitio CpG , en las plantas la citosina puede metilarse en sitios CpG, CpHpG y CpHpH, donde H representa cualquier nucleótido excepto guanina. [ 77 ] En general, el ADN de Arabidopsis está altamente metilado; el análisis de espectrometría de masas estimó que el 14% de las citosinas están modificadas. [ 9 ] : resumen Posteriormente, los datos de secuenciación con bisulfito estimaron que alrededor del 25% de los sitios CG de Arabidopsis están metilados, pero estos niveles varían según la ubicación geográfica de las accesiones de Arabidopsis (las plantas del norte están más metiladas que las accesiones del sur). [ 78 ]

Las principales enzimas ADN metiltransferasas de Arabidopsis , que transfieren y unen covalentemente grupos metilo al ADN, son DRM2, MET1 y CMT3. Tanto la proteína DRM2 como la MET1 comparten una homología significativa con las metiltransferasas de mamíferos DNMT3 y DNMT1, respectivamente, mientras que la proteína CMT3 es exclusiva del reino vegetal. Actualmente existen dos clases de ADN metiltransferasas: 1) la clase de novo , que crea nuevas marcas de metilación en el ADN; 2) una clase de mantenimiento, que reconoce las marcas de metilación en la cadena parental del ADN y transfiere la nueva metilación a las cadenas hijas tras la replicación del ADN. DRM2 es la única enzima que se ha identificado como ADN metiltransferasa de novo . También se ha demostrado que DRM2, junto con MET1 y CMT3, participa en el mantenimiento de las marcas de metilación durante la replicación del ADN. [ 79 ] Otras ADN metiltransferasas se expresan en plantas pero no tienen función conocida (véase la base de datos de cromatina ).

Los niveles de metilación del ADN en todo el genoma varían ampliamente entre las especies de plantas, y las citosinas de Arabidopsis tienden a estar menos densamente metiladas que las de otras plantas. Por ejemplo, ~92,5% de las citosinas CpG están metiladas en Beta vulgaris . [ 80 ] Los patrones de metilación también difieren entre los contextos de secuencia de citosina; universalmente, la metilación de CpG es mayor que la metilación de CHG y CHH, y la metilación de CpG se puede encontrar tanto en genes activos como en elementos transponibles, mientras que CHG y CHH generalmente se relegan a elementos transponibles silenciados. [ 81 ] [ 77 ]

No está claro cómo la célula determina las ubicaciones de la metilación de novo del ADN, pero la evidencia sugiere que para algunas ubicaciones, está involucrada la metilación del ADN dirigida por ARN (RdDM). En la RdDM, se producen transcritos de ARN específicos a partir de una plantilla de ADN genómico, y este ARN forma estructuras secundarias llamadas moléculas de ARN de doble cadena. [ 82 ] Los ARN de doble cadena, a través de las vías del ARN de interferencia pequeño ( siRNA ) o del microARN ( miRNA ), dirigen la metilación de novo del ADN en la ubicación genómica original que produjo el ARN. [ 82 ] Se cree que este tipo de mecanismo es importante en la defensa celular contra los virus de ARN y/o los transposones , los cuales a menudo forman un ARN de doble cadena que puede ser mutagénico para el genoma del huésped. Al metilar sus ubicaciones genómicas, a través de un mecanismo aún poco comprendido, se desactivan y dejan de estar activos en la célula, protegiendo el genoma de su efecto mutagénico. Recientemente, se describió que la metilación del ADN es el principal determinante de la formación de cultivos embriogénicos a partir de explantes en plantas leñosas y se considera el principal mecanismo que explica la escasa respuesta de los explantes maduros a la embriogénesis somática en las plantas (Isah 2016).

En los insectos

Diversos órdenes de insectos muestran patrones variados de metilación del ADN, desde niveles casi indetectables en moscas hasta niveles bajos en mariposas y más altos en chinches y algunas cucarachas (hasta el 14 % de todos los sitios CG en Blattella asahinai ). [ 83 ]

Se ha descubierto la metilación funcional del ADN en las abejas melíferas. [ 84 ] [ 85 ] Las marcas de metilación del ADN se encuentran principalmente en el cuerpo del gen, y las opiniones actuales sobre la función de la metilación del ADN apuntan a la regulación genética mediante el empalme alternativo. [ 86 ]

Los niveles de metilación del ADN en Drosophila melanogaster son casi indetectables. [ 87 ] Los métodos sensibles aplicados al ADN de Drosophila sugieren niveles en el rango de 0,1–0,3% de la citosina total. [ 88 ] Un estudio de 2014 encontró que el bajo nivel de metilación en las moscas de la fruta aparecía "en motivos cortos específicos y es independiente de la actividad de DNMT2". [ 89 ] Además, los enfoques de espectrometría de masas altamente sensibles, [ 90 ] han demostrado ahora la presencia de niveles bajos (0,07%) pero significativos de metilación de adenina durante las primeras etapas de la embriogénesis de Drosophila.

En los hongos

Muchos hongos presentan bajos niveles (0,1 a 0,5 %) de metilación de citosina, mientras que otros tienen hasta un 5 % del genoma metilado. [ 91 ] Este valor parece variar tanto entre especies como entre aislados de la misma especie. [ 92 ] También hay evidencia de que la metilación del ADN puede estar involucrada en el control específico del estado de la expresión génica en hongos. Sin embargo, con un límite de detección de 250 attomoles mediante espectrometría de masas de ultra alta sensibilidad , no se confirmó la metilación del ADN en especies de levaduras unicelulares como Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe , lo que indica que las levaduras no poseen esta modificación del ADN. [ 9 ] : resumen

Aunque la levadura de cerveza ( Saccharomyces ), la levadura de fisión ( Schizosaccharomyces ) y Aspergillus flavus [ 93 ] no tienen metilación de ADN detectable, el hongo filamentoso modelo Neurospora crassa tiene un sistema de metilación bien caracterizado. [ 94 ] Varios genes controlan la metilación en Neurospora y la mutación de la ADN metiltransferasa, dim-2 , elimina toda la metilación de ADN pero no afecta el crecimiento ni la reproducción sexual . Si bien el genoma de Neurospora tiene poco ADN repetido, la mitad de la metilación ocurre en ADN repetido, incluyendo reliquias de transposones y ADN centromérico. La capacidad de evaluar otros fenómenos importantes en un contexto genético deficiente en ADN metilasa hace de Neurospora un sistema importante en el que estudiar la metilación del ADN.

En otros eucariotas

La metilación del ADN está prácticamente ausente en Dictyostelium discoideum [ 95 ], donde parece ocurrir en aproximadamente el 0,006% de las citosinas. [ 6 ] En contraste, la metilación del ADN está ampliamente distribuida en Physarum polycephalum [ 96 ], donde la 5-metilcitosina constituye hasta el 8% de la citosina total. [ 4 ]

En las bacterias

Todas las metilaciones en un procariota . En algunos organismos procariotas, están representados los tres tipos de metilación del ADN previamente conocidos (N4-metilcitosina: m4C, 5-metilcitosina: m5C y N6-metiladenina: m6A). Aquí se muestran seis ejemplos, dos de los cuales pertenecen al dominio Archaea y cuatro al dominio Bacteria . La información proviene de Blow et al. (2016). [ 97 ] En la columna izquierda se encuentran los nombres de las especies de los organismos, a la derecha hay ejemplos de motivos de ADN metilado. [ 98 ]

La metilación de adenina o citosina está mediada por sistemas de restricción-modificación de varias bacterias , en los que secuencias de ADN específicas se metilan periódicamente a lo largo del genoma. [ 99 ] Una metilasa es la enzima que reconoce una secuencia específica y metila una de las bases en o cerca de esa secuencia. Los ADN extraños (que no están metilados de esta manera) que se introducen en la célula son degradados por enzimas de restricción específicas de secuencia y cortados. El ADN genómico bacteriano no es reconocido por estas enzimas de restricción. La metilación del ADN nativo actúa como una especie de sistema inmunitario primitivo, permitiendo a las bacterias protegerse de la infección por bacteriófagos .

La ADN adenina metiltransferasa (Dam) de E. coli es una enzima de aproximadamente 32 kDa que no pertenece a un sistema de restricción/modificación. La secuencia de reconocimiento diana para Dam de E. coli es GATC, ya que la metilación ocurre en la posición N6 de la adenina en esta secuencia (G meATC). Los tres pares de bases que flanquean cada lado de este sitio también influyen en la unión ADN-Dam. Dam desempeña varias funciones clave en procesos bacterianos, incluyendo la reparación de errores de apareamiento, la sincronización de la replicación del ADN y la expresión génica. Como resultado de la replicación del ADN, el estado de los sitios GATC en el genoma de E. coli cambia de completamente metilado a hemimetilado. Esto se debe a que la adenina introducida en la nueva cadena de ADN no está metilada. La remetilación ocurre en un lapso de dos a cuatro segundos, tiempo durante el cual se reparan los errores de replicación en la nueva cadena. La metilación, o su ausencia, es el marcador que permite al aparato de reparación de la célula diferenciar entre la cadena molde y la cadena naciente. Se ha demostrado que la alteración de la actividad de Dam en bacterias produce un aumento en la tasa de mutación espontánea. La viabilidad bacteriana se ve comprometida en mutantes de Dam que también carecen de otras enzimas de reparación del ADN, lo que proporciona evidencia adicional del papel de Dam en la reparación del ADN.

Una región del ADN que conserva su hemimetilación durante más tiempo es el origen de replicación , que posee una gran cantidad de sitios GATC. Esto es fundamental para el mecanismo bacteriano que regula la replicación del ADN. La proteína SeqA se une al origen de replicación, secuestrándolo y, por lo tanto, impidiendo su metilación. Dado que los orígenes de replicación hemimetilados son inactivos, este mecanismo limita la replicación del ADN a una sola vez por ciclo celular.

La expresión de ciertos genes, por ejemplo, los que codifican la expresión de pili en E. coli , está regulada por la metilación de sitios GATC en la región promotora del operón génico. Las condiciones ambientales de las células justo después de la replicación del ADN determinan si se bloquea la metilación de Dam en una región proximal o distal a la región promotora. Una vez que se ha creado el patrón de metilación, la transcripción del gen del pilus queda bloqueada en la posición activada o desactivada hasta que el ADN se replica de nuevo. En E. coli , estos operones de pili desempeñan un papel importante en la virulencia de las infecciones del tracto urinario. Se ha propuesto que los inhibidores de Dam podrían funcionar como antibióticos.

Por otro lado, la citosina metilasa del ADN actúa sobre los sitios CCAGG y CCTGG para metilar la citosina en la posición C5 (C meC(A/T) GG). La otra enzima metilasa, EcoKI, provoca la metilación de las adeninas en las secuencias AAC(N 6 )GTGC y GCAC(N 6 )GTT.

En Clostridioides difficile , se demostró que la metilación del ADN en el motivo objetivo CAAAAA afecta la esporulación , un paso clave en la transmisión de la enfermedad, así como la longitud celular, la formación de biopelículas y la colonización del huésped. [ 100 ]

Clonación molecular

La mayoría de las cepas utilizadas por los biólogos moleculares son derivadas de E. coli K-12 y poseen tanto Dam como Dcm, pero existen cepas disponibles comercialmente que son dam-/dcm- (carecen de la actividad de cualquiera de las metilasas). De hecho, es posible desmetilar el ADN extraído de cepas dam+/dcm+ transformándolo en cepas dam-/dcm-. Esto facilitaría la digestión de secuencias que no son reconocidas por las enzimas de restricción sensibles a la metilación. [ 101 ] [ 102 ]

La enzima de restricción DpnI reconoce los sitios 5'-GmeATC-3' y digiere el ADN metilado. Al ser un motivo tan corto, aparece con frecuencia en secuencias por casualidad, por lo que su principal uso para los investigadores es degradar el ADN molde después de las PCR (los productos de PCR carecen de metilación, ya que no hay metilasas presentes en la reacción). De manera similar, algunas enzimas de restricción disponibles comercialmente son sensibles a la metilación en sus sitios de restricción correspondientes y, como se mencionó anteriormente, deben usarse en ADN procesado mediante una cepa dam-/dcm- para permitir el corte.

Detección

La metilación del ADN se puede detectar mediante los siguientes ensayos que se utilizan actualmente en la investigación científica: [ 103 ]

  • La espectrometría de masas es un método analítico sensible y fiable para detectar la metilación del ADN. Sin embargo, en general, la espectrometría de masas no proporciona información sobre el contexto de la secuencia de metilación, lo que limita su utilidad para estudiar la función de esta modificación del ADN.
  • La PCR específica de metilación (MSP) , que se basa en una reacción química de bisulfito de sodio con ADN que convierte las citosinas no metiladas de los dinucleótidos CpG en uracilo o UpG, seguida de la PCR tradicional . [ 104 ] Sin embargo, las citosinas metiladas no se convertirán en este proceso, y los cebadores están diseñados para superponerse al sitio CpG de interés, lo que permite determinar el estado de metilación como metilado o no metilado.
  • La secuenciación del genoma completo con bisulfito , también conocida como BS-Seq, es un análisis genómico de alto rendimiento de la metilación del ADN. Se basa en la conversión del ADN genómico con bisulfito de sodio, que posteriormente se secuencia en una plataforma de secuenciación de nueva generación . Las secuencias obtenidas se realinean con el genoma de referencia para determinar el estado de metilación de los dinucleótidos CpG a partir de las discrepancias resultantes de la conversión de citosinas no metiladas en uracilo.
  • La secuenciación enzimática de metilación (EM-seq) funciona de manera similar a la secuenciación con bisulfito, pero utiliza las enzimas APOBEC y TET2 para desaminar la citosina no metilada en uracilo antes de la secuenciación. Las bibliotecas EM-seq son menos propensas al daño del ADN que las bibliotecas tratadas con bisulfito. [ 105 ]
  • La secuenciación de bisulfito de representación reducida , también conocida como RRBS, cuenta con varios protocolos de trabajo. El primer protocolo RRBS se denominó RRBS y tiene como objetivo aproximadamente el 10 % del metiloma, requiriendo un genoma de referencia. Posteriormente surgieron otros protocolos que permitieron secuenciar una porción menor del genoma y una mayor multiplexación de muestras. EpiGBS fue el primer protocolo que permitió multiplexar 96 muestras en una sola línea de secuenciación Illumina, eliminando la necesidad de un genoma de referencia. La construcción de una referencia de novo a partir de las lecturas de Watson y Crick hizo posible el análisis poblacional simultáneo de SNP y SMP.
  • El ensayo HELP se basa en la capacidad diferencial de las enzimas de restricción para reconocer y cortar los sitios de ADN CpG metilados y no metilados.
  • El ensayo GLAD-PCR se basa en un nuevo tipo de enzimas: endonucleasas de ADN dirigidas a la metilación específicas del sitio, que hidrolizan únicamente el ADN metilado.
  • Los ensayos ChIP-on-chip se basan en la capacidad de anticuerpos preparados comercialmente para unirse a proteínas asociadas a la metilación del ADN, como MeCP2.
  • El escaneo genómico de marcadores de restricción es un ensayo complejo y actualmente poco utilizado, basado en el reconocimiento diferencial de sitios CpG metilados y no metilados por parte de las enzimas de restricción; el concepto de este ensayo es similar al del ensayo HELP.
  • La inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP), análoga a la inmunoprecipitación de cromatina , se utiliza para aislar fragmentos de ADN metilado que se introducen en métodos de detección de ADN como los microarrays de ADN (MeDIP-chip) o la secuenciación de ADN (MeDIP-seq).
  • Pirosecuenciación de ADN tratado con bisulfito. Este proceso consiste en la secuenciación de un amplicón generado mediante PCR con un cebador directo normal y un cebador inverso biotinilado para el gen de interés. El pirosecuenciador analiza la muestra desnaturalizando el ADN y añadiendo un nucleótido a la vez, según la secuencia proporcionada por el usuario. Si se detecta una discrepancia, se registra y se indica el porcentaje de ADN en el que se presenta. Esto permite obtener el porcentaje de metilación por isla CpG.
  • Ensayo molecular de ruptura de luz para la actividad de la ADN adenina metiltransferasa: un ensayo que se basa en la especificidad de la enzima de restricción DpnI para los sitios GATC completamente metilados (metilación de adenina) en un oligonucleótido marcado con un fluoróforo y un extintor. La adenina metiltransferasa metila el oligonucleótido, convirtiéndolo en un sustrato para DpnI. El corte del oligonucleótido por DpnI produce un aumento de la fluorescencia. [ 106 ] [ 107 ]
  • La técnica de Southern Blotting sensible a la metilación es similar al ensayo HELP, aunque utiliza técnicas de Southern blotting para analizar las diferencias de metilación específicas de cada gen mediante digestiones con enzimas de restricción. Esta técnica se emplea para evaluar la metilación local cerca del sitio de unión de la sonda.
  • Las proteínas de unión a metil-CpG (MBP) y las proteínas de fusión que contienen únicamente el dominio de unión a metilo (MBD) se utilizan para separar el ADN nativo en fracciones metiladas y no metiladas. El porcentaje de metilación de las islas CpG individuales se puede determinar cuantificando la cantidad del objetivo en cada fracción. Se puede lograr una detección extremadamente sensible en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) mediante detección basada en la atribución.
  • El análisis de fusión de alta resolución (HRM o HRMA) es una técnica analítica posterior a la PCR . El ADN diana se trata con bisulfito de sodio, que convierte químicamente las citosinas no metiladas en uracilos, mientras que las citosinas metiladas se conservan. A continuación, se realiza la amplificación por PCR con cebadores diseñados para amplificar tanto las plantillas metiladas como las no metiladas. Tras esta amplificación, las secuencias de ADN altamente metiladas contienen un mayor número de sitios CpG en comparación con las plantillas no metiladas, lo que da como resultado una temperatura de fusión diferente que puede utilizarse en la detección cuantitativa de la metilación. [ 108 ] [ 109 ]
  • Reconstrucción de la metilación del ADN antiguo, un método para reconstruir la metilación del ADN de alta resolución a partir de muestras de ADN antiguo. El método se basa en los procesos de degradación natural que ocurren en el ADN antiguo: con el tiempo, las citosinas metiladas se degradan en timinas, mientras que las citosinas no metiladas se degradan en uracilos. Esta asimetría en las señales de degradación se utilizó para reconstruir los mapas completos de metilación del neandertal y el denisovano . [ 110 ] En septiembre de 2019, investigadores publicaron un método novedoso para inferir rasgos morfológicos a partir de datos de metilación del ADN. Los autores pudieron demostrar que vincular genes regulados a la baja con fenotipos de enfermedades monogénicas, donde una o dos copias de un gen están alteradas, permite una precisión de ~85% en la reconstrucción de rasgos anatómicos directamente a partir de mapas de metilación del ADN. [ 111 ]
  • Ensayo de extensión de cebador de nucleótido único sensible a la metilación (msSNuPE), que utiliza cebadores internos que se unen directamente al extremo 5' del nucleótido que se va a detectar. [ 112 ]
  • El ensayo de metilación de Illumina mide la metilación del ADN específica de locus mediante hibridación en microarrays. El ADN tratado con bisulfito se hibrida con sondas en "BeadChips". Se utiliza la extensión de una sola base con sondas marcadas para determinar el estado de metilación de los sitios objetivo. [ 113 ] En 2016, se lanzó el BeadChip Infinium MethylationEPIC, que analiza más de 850 000 sitios de metilación en todo el genoma humano. [ 114 ]
  • La secuenciación PacBio SMRT ofrece detección de metilación como parte de la secuenciación de ADN sin PCR.
  • La secuenciación de ADN de Oxford Nanopore Technologies también puede realizarse con detección simultánea de metilación si el ADN no se amplificó mediante PCR antes de la secuenciación.

Regiones diferencialmente metiladas (DMR)

Las regiones diferencialmente metiladas (DMR), que son regiones genómicas con diferentes estados de metilación entre múltiples muestras (tejidos, células, individuos u otros), se consideran posibles regiones funcionales involucradas en la regulación de la transcripción génica. La identificación de DMR entre múltiples tejidos (T-DMR) proporciona un estudio exhaustivo de las diferencias epigenéticas entre los tejidos humanos. [ 115 ] Por ejemplo, estas regiones metiladas que son únicas para un tejido en particular permiten a los individuos diferenciar entre tipos de tejido, como el semen y el fluido vaginal. La investigación actual realizada por Lee et al., mostró que DACT1 y USP49 identificaron positivamente el semen al examinar las T-DMR. [ 116 ] El uso de T-DMR ha demostrado ser útil en la identificación de varios fluidos corporales encontrados en escenas del crimen. Los investigadores en el campo forense están buscando actualmente nuevas T-DMR en genes para usarlas como marcadores en el análisis forense de ADN. Las DMR entre muestras cancerosas y normales (C-DMR) demuestran la metilación aberrante en los cánceres. [ 117 ] Es bien sabido que la metilación del ADN está asociada con la diferenciación y proliferación celular. [ 118 ] Se han encontrado múltiples DMR en las etapas de desarrollo (D-DMR) [ 119 ] y en el progreso de reprogramación (R-DMR). [ 120 ] Además, existen DMR intraindividuales (Intra-DMR) con cambios longitudinales en la metilación global del ADN junto con el aumento de la edad en un individuo dado. [ 121 ] También existen DMR interindividuales (Inter-DMR) con diferentes patrones de metilación entre múltiples individuos. [ 122 ]

QDMR (Regiones Diferencialmente Metiladas Cuantitativas) es un método cuantitativo para cuantificar las diferencias de metilación e identificar DMR a partir de perfiles de metilación de todo el genoma, adaptando la entropía de Shannon. [ 123 ] La naturaleza independiente de la plataforma y de la especie de QDMR lo hace potencialmente aplicable a diversos datos de metilación. Este método proporciona una herramienta eficaz para la identificación de alto rendimiento de las regiones funcionales involucradas en la regulación epigenética. QDMR puede utilizarse como una herramienta eficaz para la cuantificación de las diferencias de metilación y la identificación de DMR en múltiples muestras. [ 124 ]

Se ha demostrado que el análisis de conjuntos de genes (también conocido como análisis de vías metabólicas; generalmente realizado con herramientas como DAVID, GoSeq o GSEA) está gravemente sesgado cuando se aplica a datos de metilación de alto rendimiento (por ejemplo, MeDIP-seq, MeDIP-ChIP, HELP-seq, etc.), y una amplia gama de estudios han informado erróneamente sobre la hipermetilación de genes relacionados con el desarrollo y la diferenciación; se ha sugerido que esto puede corregirse utilizando permutaciones de etiquetas de muestras o utilizando un modelo estadístico para controlar las diferencias en el número de sondas CpG / sitios CpG que se dirigen a cada gen. [ 125 ]

Marcas de metilación del ADN

Las marcas de metilación del ADN —regiones genómicas con patrones de metilación específicos en un estado biológico determinado, como un tejido, un tipo celular o un individuo— se consideran posibles regiones funcionales implicadas en la regulación de la transcripción génica. Aunque varios tipos de células humanas pueden tener el mismo genoma, estas células presentan metilomas diferentes. La identificación y caracterización sistemáticas de las marcas de metilación en distintos tipos celulares son cruciales para comprender la compleja red reguladora de la determinación del destino celular. Hongbo Liu et al. propusieron un marco basado en la entropía, denominado SMART, para integrar los metilomas de secuenciación de bisulfito del genoma completo en 42 tejidos/células humanas e identificaron 757.887 segmentos genómicos. [ 126 ] Casi el 75 % de los segmentos mostraron una metilación uniforme en todos los tipos celulares. Del 25 % restante de los segmentos, identificaron marcas de hipo/hipermetilación específicas de cada tipo celular, que se encontraban hipo/hipermetiladas específicamente en una minoría de tipos celulares, utilizando un enfoque estadístico, y presentaron un atlas de las marcas de metilación humanas. Análisis posteriores revelaron que las marcas de hipometilación específicas de cada tipo celular se enriquecieron mediante H3K27ac y sitios de unión de factores de transcripción de manera específica para cada tipo celular. En particular, observaron que estas marcas están asociadas con los superpotenciadores específicos de cada tipo celular que impulsan la expresión de genes de identidad celular. Este marco proporciona una anotación funcional complementaria del genoma humano y ayuda a dilucidar las características y funciones cruciales de la hipometilación específica de cada tipo celular.

La herramienta de análisis e informe de metilación específica basada en entropía, denominada "SMART", se centra en la integración de un gran número de metilomas de ADN para la identificación de novo de marcas de metilación específicas de cada tipo celular. La última versión de SMART se centra en tres funciones principales: la identificación de novo de regiones diferencialmente metiladas (DMR) mediante la segmentación del genoma, la identificación de DMR a partir de regiones de interés predefinidas y la identificación de sitios CpG diferencialmente metilados. [ 127 ]

En la identificación y detección de fluidos corporales

La metilación del ADN permite analizar varios tejidos en un solo ensayo, así como identificar pequeñas cantidades de fluidos corporales mediante el uso de ADN extraído. Generalmente, los dos enfoques de metilación del ADN son las enzimas de restricción sensibles a la metilación o el tratamiento con bisulfito de sodio. [ 128 ] Las enzimas de restricción sensibles a la metilación funcionan cortando sitios de reconocimiento específicos de CpG, citosina y guanina separados por un solo grupo fosfato cuando el CpG está metilado. Por el contrario, las citosinas no metiladas se transforman en uracilo y, en el proceso, las citosinas metiladas permanecen metiladas. En particular, los perfiles de metilación pueden proporcionar información sobre cuándo o cómo se dejaron los fluidos corporales en las escenas del crimen, identificar el tipo de fluido corporal y aproximar la edad, el sexo y las características fenotípicas de los perpetradores. [ 129 ] La investigación indica varios marcadores que se pueden utilizar para la metilación del ADN. Decidir qué marcador utilizar para un ensayo es uno de los primeros pasos en la identificación de fluidos corporales. En general, los marcadores se seleccionan examinando investigaciones previas. Los marcadores de identificación elegidos deben dar un resultado positivo para un tipo de célula. Una porción del cromosoma que es un área de enfoque al realizar la metilación del ADN son las regiones diferencialmente metiladas específicas de tejido, T-DMR. El grado de metilación para las T-DMR varía según el fluido corporal. [ 129 ] Un equipo de investigación desarrolló un sistema de marcadores que es doble. El primer marcador está metilado solo en el fluido objetivo, mientras que el segundo está metilado en el resto de los fluidos. [ 112 ] Por ejemplo, si el marcador de sangre venosa A no está metilado y el marcador de sangre venosa B está metilado en un fluido, indica la presencia de solo sangre venosa. Por el contrario, si el marcador de sangre venosa A está metilado y el marcador de sangre venosa B no está metilado en algún fluido, entonces eso indica que hay sangre venosa en una mezcla de fluidos. Algunos ejemplos de marcadores de metilación del ADN son Mens1 (sangre menstrual), Spei1 (saliva) y Sperm2 (líquido seminal).

La metilación del ADN proporciona un medio relativamente bueno de sensibilidad para identificar y detectar fluidos corporales. En un estudio, solo se necesitaron diez nanogramos de muestra para obtener resultados satisfactorios. [ 130 ] La metilación del ADN permite una buena distinción entre muestras mixtas, ya que utiliza marcadores que emiten señales de activación o desactivación. La metilación del ADN no es inmune a las condiciones externas. Incluso en condiciones de degradación, al utilizar las técnicas de metilación del ADN, los marcadores son lo suficientemente estables como para que se observen diferencias notables entre las muestras degradadas y las de control. En concreto, en un estudio se constató que no se produjeron cambios perceptibles en los patrones de metilación durante un periodo prolongado. [ 129 ]

La detección de la metilación del ADN en el ADN libre de células y otros fluidos corporales se ha convertido recientemente en uno de los principales enfoques de la biopsia líquida . [ 131 ] En particular, la identificación de patrones específicos de tejido y de enfermedad permite la detección y el seguimiento no invasivos de enfermedades como el cáncer. [ 132 ] En comparación con los enfoques estrictamente genómicos de la biopsia líquida, el perfil de metilación del ADN ofrece un mayor número de sitios CpG diferencialmente metilados y regiones diferencialmente metiladas (DMRS), lo que potencialmente mejora su sensibilidad. Los algoritmos de deconvolución de señales basados ​​en la metilación del ADN se han aplicado con éxito al ADN libre de células y pueden determinar el tejido de origen de cánceres de origen primario desconocido, rechazo de aloinjertos y resistencia a la terapia hormonal. [ 133 ]

Predicción computacional

La metilación del ADN también puede detectarse mediante modelos computacionales a través de algoritmos y métodos sofisticados. Estos modelos facilitan el análisis global de la metilación del ADN en los cromosomas y, a menudo, son más rápidos y económicos que los ensayos biológicos. Algunos ejemplos de modelos computacionales actualizados son los de Bhasin et al. [ 134 ] , Bock et al . [ 135 ] y Zheng et al . [ 136 ] [ 137 ]. Junto con los ensayos biológicos, estos métodos facilitan enormemente el análisis de la metilación del ADN.

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • Straussman R, Nejman D, Roberts D, Steinfeld I, Blum B, Benvenisty N, et  al. (mayo de 2009). "Programación del desarrollo de los perfiles de metilación de islas CpG en el genoma humano". Nature Structural & Molecular Biology . 16 (5): 564– 571. doi : 10.1038/nsmb.1594 . PMID 19377480. S2CID 8804930 .  
  • Patra SK (abril de 2008). "Regulación de la metilación del ADN y el cáncer por Ras". Experimental Cell Research . 314 (6): 1193– 1201. doi : 10.1016/j.yexcr.2008.01.012 . PMID 18282569 . 
  • Patra SK, Patra A, Rizzi F, Ghosh TC, Bettuzzi S (junio de 2008). "Desmetilación del ADN (citosina-5-C-metilo) y regulación de la transcripción en las vías epigenéticas del desarrollo del cáncer". Cancer and Metastasis Reviews . 27 (2): 315– 334. doi : 10.1007/s10555-008-9118- y . hdl : 11381/1797001 . PMID 18246412. S2CID 22435914 .  
  • Nagpal G, Sharma M, Kumar S, Chaudhary K, Gupta S, Gautam A, Raghava GP (febrero de 2014). " PCMdb: base de datos de metilación del cáncer de páncreas" . Scientific Reports . 4 4197. Bibcode : 2014NatSR...4.4197N . doi : 10.1038/srep04197 . PMC 3935225. PMID 24569397 .  
  • ADN+Metilación en los Encabezamientos de Materia Médica (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
  • Explorador de hilos ENCODE: Caracterización de ARN no codificante. Nature (revista).
  • PCMdb Base de datos de metilación del cáncer de páncreas.
  • Herramienta SMART para el análisis e informe de metilación específica
  • Atlas de marcas de metilación humanas
  • DiseaseMeth Archivado el 27/01/2020 en la Wayback Machine Base de datos de metilación de enfermedades humanas
  • Atlas EWAS: Una base de conocimientos sobre estudios de asociación a nivel de todo el epigenoma.