secuenciación de ADN

La secuenciación se utiliza en biología molecular para estudiar los genomas y las proteínas que codifican. La información obtenida mediante la secuenciación permite a los investigadores identificar cambios en los genes y el ADN no codificante (incluidas las secuencias reguladoras), asociaciones con enfermedades y fenotipos, e identificar posibles dianas farmacológicas.

Dado que el ADN es una macromolécula informativa en términos de transmisión de una generación a otra, la secuenciación del ADN se utiliza en biología evolutiva para estudiar cómo se relacionan los diferentes organismos y cómo evolucionaron. En febrero de 2021, los científicos informaron, por primera vez, la secuenciación del ADN de restos animales , en este caso de un mamut , de más de un millón de años de antigüedad, el ADN más antiguo secuenciado hasta la fecha. ^{[ 10 ] [ 11 ]}

El campo de la metagenómica implica la identificación de organismos presentes en cuerpos de agua, aguas residuales , tierra, residuos filtrados del aire o muestras de organismos tomadas con hisopos. Conocer qué organismos están presentes en un entorno particular es fundamental para la investigación en ecología , epidemiología , microbiología y otros campos. La secuenciación permite a los investigadores determinar qué tipos de microbios pueden estar presentes en un microbioma , por ejemplo.

Como la mayoría de los virus son demasiado pequeños para ser vistos con un microscopio óptico, la secuenciación es una de las principales herramientas en virología para identificar y estudiar el virus. ^{[ 12 ]} Los genomas virales pueden estar basados ​​en ADN o ARN. Los virus de ARN son más sensibles al tiempo para la secuenciación del genoma, ya que se degradan más rápido en muestras clínicas. ^{[ 13 ]} La secuenciación Sanger tradicional y la secuenciación de próxima generación se utilizan para secuenciar virus en investigación básica y clínica, así como para el diagnóstico de infecciones virales emergentes, epidemiología molecular de patógenos virales y pruebas de resistencia a medicamentos. Hay más de 2,3 millones de secuencias virales únicas en GenBank . ^{[ 12 ]} En 2019, la NGS superó a la Sanger tradicional como el enfoque más popular para generar genomas virales. ^{[ 12 ]}

Durante el brote de gripe aviar de 1997 , la secuenciación viral determinó que el subtipo de influenza se originó mediante la recombinación entre codornices y aves de corral. Esto llevó a la legislación de Hong Kong que prohibió la venta conjunta de codornices y aves de corral vivas en el mercado. La secuenciación viral también puede utilizarse para estimar cuándo comenzó un brote viral mediante la técnica del reloj molecular . ^{[ 13 ]}

Los técnicos médicos pueden secuenciar genes (o, teóricamente, genomas completos) de pacientes para determinar si existe riesgo de enfermedades genéticas. Esta es una forma de prueba genética , aunque no todas las pruebas genéticas implican la secuenciación completa del ADN del genoma. ^{[ 14 ]}

Desde 2013, la secuenciación del ADN se utiliza cada vez más para diagnosticar y tratar enfermedades raras. A medida que se identifican más genes que causan enfermedades genéticas raras, los diagnósticos moleculares para pacientes se vuelven más comunes. La secuenciación del ADN permite a los médicos identificar enfermedades genéticas, mejorar el manejo de la enfermedad, brindar asesoramiento reproductivo y terapias más efectivas. ^{[ 15 ]} Los paneles de secuenciación genética se utilizan para identificar múltiples causas genéticas potenciales de un trastorno sospechoso. ^{[ 16 ]}

Además, la secuenciación de ADN puede ser útil para determinar una bacteria específica, lo que permite tratamientos antibióticos más precisos , reduciendo así el riesgo de generar resistencia antimicrobiana en las poblaciones bacterianas. ^{[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

La secuenciación de ADN puede utilizarse junto con métodos de perfilado de ADN para la identificación forense ^{[ 23 ]} y las pruebas de paternidad . Las pruebas de ADN han evolucionado enormemente en las últimas décadas para, en última instancia, vincular una huella genética con lo que se investiga. Los patrones de ADN en huellas dactilares, saliva, folículos pilosos, etc., distinguen de forma única a cada organismo vivo de otro. Las pruebas de ADN son una técnica que puede detectar genomas específicos en una cadena de ADN para producir un patrón único e individualizado.

El ácido desoxirribonucleico ( ADN ) fue descubierto y aislado por primera vez por Friedrich Miescher en 1869, pero permaneció poco estudiado durante muchas décadas porque se creía que las proteínas , y no el ADN, contenían el código genético de la vida. Esta situación cambió después de 1944 gracias a algunos experimentos de Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty, que demostraron que el ADN purificado podía transformar una cepa de bacteria en otra. Esta fue la primera vez que se demostró que el ADN era capaz de transformar las propiedades de las células.

En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron su modelo de doble hélice del ADN, basado en estructuras cristalizadas por rayos X que estaba estudiando Rosalind Franklin . Según este modelo, el ADN está compuesto por dos cadenas de nucleótidos enrolladas entre sí, unidas por enlaces de hidrógeno y que discurren en direcciones opuestas. Cada cadena está compuesta por cuatro nucleótidos complementarios: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Una A de una cadena siempre se empareja con una T de la otra, y una C siempre se empareja con una G. Propusieron que dicha estructura permitía que cada cadena se utilizara para reconstruir la otra, una idea fundamental para la transmisión de información hereditaria entre generaciones. ^{[ 30 ]}

La base para la secuenciación de proteínas fue establecida por primera vez por el trabajo de Frederick Sanger, quien en 1955 completó la secuencia de todos los aminoácidos de la insulina , una pequeña proteína secretada por el páncreas. Esto proporcionó la primera evidencia concluyente de que las proteínas eran entidades químicas con un patrón molecular específico, en lugar de una mezcla aleatoria de material suspendido en un fluido. El éxito de Sanger en la secuenciación de la insulina impulsó a los cristalógrafos de rayos X, incluidos Watson y Crick, quienes para entonces intentaban comprender cómo el ADN dirigía la formación de proteínas dentro de una célula. Poco después de asistir a una serie de conferencias impartidas por Frederick Sanger en octubre de 1954, Crick comenzó a desarrollar una teoría que sostenía que la disposición de los nucleótidos en el ADN determinaba la secuencia de aminoácidos en las proteínas, lo que a su vez ayudaba a determinar la función de una proteína. Publicó esta teoría en 1958. ^{[ 31 ]}

La secuenciación de ARN fue una de las primeras formas de secuenciación de nucleótidos. El hito principal de la secuenciación de ARN es la secuencia del primer gen completo y el genoma completo del bacteriófago MS2 , identificado y publicado por Walter Fiers y sus colaboradores en la Universidad de Gante ( Gante , Bélgica ) en 1972 ^{[ 32 ]} y 1976 ^{[ 33 ].} Los métodos tradicionales de secuenciación de ARN requieren la creación de una molécula de ADNc que debe ser secuenciada ^{[ 34 ] .}

El primer método para determinar secuencias de ADN implicó una estrategia de extensión de cebadores específica de ubicación establecida por Ray Wu , un genetista estadounidense de origen chino, en la Universidad de Cornell en 1970. ^{[ 35 ]} La catálisis de la ADN polimerasa y el marcaje específico de nucleótidos, ambos prominentes en los esquemas de secuenciación actuales, se utilizaron para secuenciar los extremos cohesivos del ADN del fago lambda . ^{[ 36 ] [ 37 ] [ 38 ]} Entre 1970 y 1973, Wu, el científico Radha Padmanabhan y sus colegas demostraron que este método puede emplearse para determinar cualquier secuencia de ADN utilizando cebadores sintéticos específicos de ubicación. ^{[ 39 ] [ 40 ] [ 8 ]}

Walter Gilbert , bioquímico, y Allan Maxam , genetista molecular, de Harvard , también desarrollaron métodos de secuenciación, incluyendo uno para la "secuenciación de ADN por degradación química". ^{[ 41 ] [ 42 ]} En 1973, Gilbert y Maxam informaron la secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como análisis de puntos errantes. ^{[ 43 ]} Los avances en la secuenciación se vieron favorecidos por el desarrollo simultáneo de la tecnología del ADN recombinante , que permitió aislar muestras de ADN de fuentes distintas a los virus. ^{[ 44 ]}

Dos años después, en 1975, Frederick Sanger , bioquímico, y Alan Coulson , científico especializado en genoma, desarrollaron un método para secuenciar el ADN. ^{[ 45 ]} La técnica, conocida como el método "Más y Menos", consistía en suministrar todos los componentes del ADN, pero excluyendo la reacción de una de las cuatro bases necesarias para completarlo. ^{[ 46 ]}

En 1976, Gilbert y Maxam inventaron un método para secuenciar rápidamente el ADN mientras estaban en Harvard, conocido como secuenciación de Maxam-Gilbert. ^{[ 47 ]}

En 1977, Sanger adoptó una estrategia de extensión de cebadores para desarrollar métodos de secuenciación de ADN más rápidos en el Centro MRC de Cambridge , Reino Unido. Esta técnica era similar a su estrategia "Más y Menos", pero se basaba en la incorporación selectiva de dideoxinucleótidos terminadores de cadena (ddNTP) por la ADN polimerasa durante la replicación de ADN in vitro . ^{[ 48 ] [ 49 ] [ 50 ]} Sanger publicó este método ese mismo año. ^{[ 51 ]}

El interés de Gilbert por la secuenciación del ADN surgió de sus estudios sobre la regulación génica, en particular del operón lac . Este método representó una de las primeras técnicas prácticas para la secuenciación rápida del ADN y les valió a Gilbert y a Frederick Sanger el Premio Nobel de Química de 1980 por sus contribuciones independientes a la secuenciación de ácidos nucleicos.

El primer genoma de ADN completo que se secuenció fue el del bacteriófago φX174 en 1977. ^{[ 52 ]} Científicos del Consejo de Investigación Médica descifraron la secuencia completa de ADN del virus de Epstein-Barr en 1984, encontrando que contenía 172.282 nucleótidos. La finalización de la secuencia marcó un punto de inflexión significativo en la secuenciación de ADN porque se logró sin conocimiento previo del perfil genético del virus. ^{[ 53 ] [ 8 ]}

Herbert Pohl y colaboradores desarrollaron a principios de la década de 1980 un método no radiactivo para transferir las moléculas de ADN de las mezclas de reacción de secuenciación a una matriz inmovilizadora durante la electroforesis . ^{[ 54 ] [ 55 ]} Posteriormente, GATC Biotech comercializó el secuenciador de ADN "Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500" , que se utilizó intensivamente en el marco del programa de secuenciación del genoma de la UE, obteniendo así la secuencia completa de ADN del cromosoma II de la levadura Saccharomyces cerevisiae . ^{[ 56 ]} El laboratorio de Leroy E. Hood en el Instituto Tecnológico de California anunció la primera máquina de secuenciación de ADN semiautomatizada en 1986. ^{[ 57 ]} A esto le siguió la comercialización por parte de Applied Biosystems de la primera máquina de secuenciación totalmente automatizada, la ABI 370, en 1987 y por Genesis 2000 de Dupont ^{[ 58 ]} que utilizó una novedosa técnica de marcaje fluorescente que permitió identificar los cuatro dideoxinucleótidos en un solo carril. Para 1990, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU. habían comenzado ensayos de secuenciación a gran escala en Mycoplasma capricolum , Escherichia coli , Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae a un costo de US$0.75 por base. Mientras tanto, la secuenciación de secuencias de ADNc humano llamadas etiquetas de secuencia expresada comenzó en el laboratorio de Craig Venter , un intento de capturar la fracción codificante del genoma humano . ^{[ 59 ]} En 1995, Venter, Hamilton Smith y sus colegas del Instituto de Investigación Genómica (TIGR) publicaron el primer genoma completo de un organismo de vida libre, la bacteria Haemophilus influenzae . El cromosoma circular contiene 1.830.137 bases y su publicación en la revista Science ^{[ 60 ]} marcó el primer uso publicado de la secuenciación de escopeta del genoma completo, eliminando la necesidad de esfuerzos de mapeo iniciales.

Para 2003, los métodos de secuenciación de escopeta del Proyecto Genoma Humano se habían utilizado para producir una secuencia preliminar del genoma humano; tenía una precisión del 92 %. ^{[ 61 ] [ 62 ] [ 63 ]} En 2022, los científicos secuenciaron con éxito el último 8 % del genoma humano. El gen de referencia estándar completamente secuenciado se llama GRCh38.p14 y contiene 3100 millones de pares de bases. ^{[ 63 ] [ 64 ]}

Entre mediados y finales de la década de 1990 se desarrollaron varios métodos nuevos para la secuenciación del ADN, que se implementaron en secuenciadores de ADN comerciales hacia el año 2000. En conjunto, estos métodos se denominaron secuenciación de "siguiente generación" o de "segunda generación" (NGS), para distinguirlos de los métodos anteriores, incluida la secuenciación de Sanger . A diferencia de la primera generación de secuenciación, la tecnología NGS se caracteriza por su alta escalabilidad, lo que permite secuenciar el genoma completo de una sola vez. Generalmente, esto se logra fragmentando el genoma en pequeños trozos, seleccionando aleatoriamente un fragmento y secuenciándolo mediante diversas tecnologías, como las que se describen a continuación. Es posible secuenciar un genoma completo porque se secuencian múltiples fragmentos a la vez (lo que da nombre a la secuenciación "masivamente paralela") en un proceso automatizado.

La tecnología NGS ha empoderado enormemente a los investigadores para buscar información sobre la salud, a los antropólogos para investigar los orígenes humanos y está impulsando el movimiento de la " Medicina Personalizada ". Sin embargo, también ha aumentado la posibilidad de errores. Existen numerosas herramientas de software para realizar el análisis computacional de datos NGS, a menudo recopiladas en plataformas en línea como el Portal NGS del CSI, cada una con su propio algoritmo. Incluso los parámetros dentro de un mismo paquete de software pueden modificar el resultado del análisis. Además, la gran cantidad de datos producidos por la secuenciación de ADN ha requerido el desarrollo de nuevos métodos y programas para el análisis de secuencias. Se han realizado varios esfuerzos para desarrollar estándares en el campo de la NGS con el fin de abordar estos desafíos, la mayoría de los cuales han sido iniciativas a pequeña escala surgidas de laboratorios individuales. Más recientemente, un esfuerzo organizado y de gran envergadura, financiado por la FDA, ha culminado en el estándar BioCompute . ^{[ 66 ]}

El 26 de octubre de 1990, Roger Tsien , Pepi Ross, Margaret Fahnestock y Allan J. Johnston presentaron una patente que describía la secuenciación por etapas ("base por base") con bloqueadores 3' removibles en matrices de ADN (blots y moléculas de ADN individuales). ^{[ 67 ]} En 1996, Pål Nyrén y su estudiante Mostafa Ronaghi, del Real Instituto de Tecnología de Estocolmo, publicaron su método de pirosecuenciación . ^{[ 68 ]}

El 1 de abril de 1997, Pascal Mayer y Laurent Farinelli presentaron patentes que describían la secuenciación de colonias de ADN. ^{[ 69 ]} Los métodos de preparación de muestras de ADN y de formación de matrices de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de superficie aleatoria descritos en esta patente, junto con el método de secuenciación "base por base" de Roger Tsien et al., ahora se implementan en los secuenciadores de genoma Hi-Seq de Illumina .

En 1998, Phil Green y Brent Ewing de la Universidad de Washington describieron su puntuación de calidad Phred para el análisis de datos de secuenciadores, ^{[ 70 ]} una técnica de análisis trascendental que obtuvo una amplia adopción y que sigue siendo la métrica más común para evaluar la precisión de una plataforma de secuenciación. ^{[ 71 ]}

Lynx Therapeutics publicó y comercializó la secuenciación de firmas masivamente paralela (MPSS, por sus siglas en inglés) en el año 2000. Este método incorporaba una tecnología de secuenciación paralela, mediada por adaptadores/ligación y basada en microesferas, y se convirtió en el primer método de secuenciación de "próxima generación" disponible comercialmente, aunque no se vendieron secuenciadores de ADN a laboratorios independientes. ^{[ 72 ]}

En 1977, Allan Maxam y Walter Gilbert publicaron un método de secuenciación de ADN basado en la modificación química del ADN y su posterior escisión en bases específicas. ^{[ 41 ]} Este método, también conocido como secuenciación química, permitía utilizar muestras purificadas de ADN de doble cadena sin necesidad de clonación adicional. El uso de marcaje radiactivo y la complejidad técnica de este método desalentaron su uso generalizado tras las mejoras introducidas en los métodos de Sanger.

La secuenciación de Maxam-Gilbert requiere el marcaje radiactivo en un extremo 5' del ADN y la purificación del fragmento de ADN que se va a secuenciar. Posteriormente, un tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases nucleotídicas en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). La concentración de los reactivos modificadores se controla para introducir, en promedio, una modificación por molécula de ADN. De este modo, se genera una serie de fragmentos marcados, desde el extremo radiomarcado hasta el primer sitio de corte en cada molécula. Los fragmentos de las cuatro reacciones se someten a electroforesis en paralelo en geles de acrilamida desnaturalizantes para su separación por tamaño. Para visualizar los fragmentos, el gel se expone a una película de rayos X para autorradiografía, lo que produce una serie de bandas oscuras, cada una correspondiente a un fragmento de ADN radiomarcado, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia. ^{[ 41 ]}

Este método está prácticamente obsoleto a partir de 2023. ^{[ 73 ]}

El método de terminación de cadena desarrollado por Frederick Sanger y sus colaboradores en 1977 pronto se convirtió en el método de elección, debido a su relativa facilidad y fiabilidad. ^{[ 51 ] [ 74 ]} Cuando se inventó, el método de terminación de cadena utilizaba menos productos químicos tóxicos y menores cantidades de radiactividad que el método de Maxam y Gilbert. Debido a su relativa facilidad, el método de Sanger pronto se automatizó y fue el método utilizado en la primera generación de secuenciadores de ADN .

La secuenciación de Sanger fue el método predominante desde la década de 1980 hasta mediados de la década de 2000. Durante ese período, se produjeron grandes avances en la técnica, como el marcaje fluorescente, la electroforesis capilar y la automatización general. Estos desarrollos permitieron una secuenciación mucho más eficiente, lo que conllevó una reducción de costes. El método de Sanger, en su forma de producción en masa, es la tecnología que produjo el primer genoma humano en 2001, dando inicio a la era de la genómica . Sin embargo, más adelante en la década, llegaron al mercado enfoques radicalmente diferentes, lo que redujo el coste por genoma de 100 millones de dólares en 2001 a 10 000 dólares en 2011. ^{[ 75 ]}

El objetivo de la secuenciación por síntesis (SBS) es determinar la secuencia de una muestra de ADN detectando la incorporación de un nucleótido por una ADN polimerasa . Se utiliza una polimerasa modificada genéticamente para sintetizar una copia de una sola hebra de ADN y se monitoriza la incorporación de cada nucleótido. El principio de la secuenciación por síntesis en tiempo real se describió por primera vez en 1993 ^{[ 76 ],} y posteriormente se publicaron mejoras algunos años más tarde. ^{[ 77 ]} Las partes clave son muy similares para todas las realizaciones de SBS e incluyen (1) amplificación del ADN (para mejorar la señal subsiguiente) y unión del ADN a secuenciar a un soporte sólido (una excepción es PacBio SMRT ), (2) generación de ADN monocatenario en el soporte sólido, (3) incorporación de nucleótidos utilizando una polimerasa modificada y (4) detección en tiempo real de la incorporación de nucleótidos. Los pasos 3 y 4 se repiten y la secuencia se ensambla a partir de las señales obtenidas en el paso 4. Este principio de secuenciación por síntesis en tiempo real se ha utilizado para casi todos los instrumentos de secuenciación masiva en paralelo , incluidos 454 , PacBio , IonTorrent , Illumina y MGI . ^{[ 78 ]}

La secuenciación de escopeta es un método de secuenciación diseñado para el análisis de secuencias de ADN de más de 1000 pares de bases, incluyendo cromosomas completos. Este método requiere que el ADN objetivo se divida en fragmentos aleatorios. Tras secuenciar los fragmentos individuales mediante el método de terminación de cadena , las secuencias se pueden reconstruir a partir de sus regiones superpuestas. ^{[ 89 ]} Este método se utilizó ampliamente en el Proyecto Genoma Humano . ^{[ 90 ]}

Otro enfoque utiliza mediciones de las corrientes de tunelización eléctrica a través de ADN monocatenario a medida que se mueve a través de un canal. Dependiendo de su estructura electrónica, cada base afecta la corriente de tunelización de manera diferente, ^{[ 149 ]} lo que permite diferenciar entre diferentes bases. ^{[ 150 ]}

El uso de corrientes de tunelización tiene el potencial de secuenciar órdenes de magnitud más rápido que los métodos de corriente iónica y ya se ha logrado la secuenciación de varios oligómeros de ADN y microARN. ^{[ 151 ]}

La secuenciación por hibridación es un método no enzimático que utiliza una micromatriz de ADN . Una única muestra de ADN cuya secuencia se desea determinar se marca con fluorescencia y se hibrida con una matriz que contiene secuencias conocidas. Las señales de hibridación intensas en un punto específico de la matriz identifican su secuencia en el ADN que se está secuenciando. ^{[ 152 ]}

Este método de secuenciación utiliza las características de unión de una biblioteca de moléculas cortas de ADN monocatenario (oligonucleótidos), también llamadas sondas de ADN, para reconstruir una secuencia de ADN objetivo. Los híbridos no específicos se eliminan mediante lavado y el ADN objetivo se eluye. ^{[ 153 ]} Los híbridos se reorganizan de manera que se pueda reconstruir la secuencia de ADN. La ventaja de este tipo de secuenciación es su capacidad para capturar un gran número de objetivos con una cobertura homogénea. ^{[ 154 ]} Por lo general, se requiere una gran cantidad de reactivos químicos y ADN inicial. Sin embargo, con la llegada de la hibridación en solución, se necesita mucho menos equipo y reactivos químicos. ^{[ 153 ]}

La espectrometría de masas puede utilizarse para determinar secuencias de ADN. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización/desorción láser asistida por matriz ( MALDI-TOF MS ) se ha investigado específicamente como un método alternativo a la electroforesis en gel para visualizar fragmentos de ADN. Con este método, los fragmentos de ADN generados por reacciones de secuenciación por terminación de cadena se comparan por masa en lugar de por tamaño. La masa de cada nucleótido es diferente de la de los demás, y esta diferencia es detectable mediante espectrometría de masas. Las mutaciones de un solo nucleótido en un fragmento se pueden detectar más fácilmente con espectrometría de masas que con electroforesis en gel únicamente. La MALDI-TOF MS puede detectar más fácilmente las diferencias entre fragmentos de ARN, por lo que los investigadores pueden secuenciar indirectamente el ADN con métodos basados ​​en espectrometría de masas, convirtiéndolo primero en ARN. ^{[ 155 ]}

La mayor resolución de los fragmentos de ADN que permiten los métodos basados ​​en espectrometría de masas (EM) es de especial interés para los investigadores en ciencias forenses, ya que pueden buscar polimorfismos de un solo nucleótido en muestras de ADN humano para identificar individuos. Estas muestras pueden estar muy degradadas, por lo que los investigadores forenses suelen preferir el ADN mitocondrial por su mayor estabilidad y sus aplicaciones en estudios de linaje. Se han utilizado métodos de secuenciación basados ​​en EM para comparar las secuencias de ADN mitocondrial humano de muestras de una base de datos del FBI ^{[ 156 ]} y de huesos encontrados en fosas comunes de soldados de la Primera Guerra Mundial ^{[ 157 ] .}

Los métodos iniciales de terminación de cadena y espectrometría de masas TOF demostraron longitudes de lectura de hasta 100 pares de bases. ^{[ 158 ]} Los investigadores no han podido superar este tamaño de lectura promedio; al igual que la secuenciación por terminación de cadena, la secuenciación de ADN basada en espectrometría de masas puede no ser adecuada para grandes proyectos de secuenciación de novo . Aun así, un estudio de 2010 utilizó lecturas de secuencia cortas y espectrometría de masas para comparar polimorfismos de un solo nucleótido en cepas patógenas de Streptococcus . ^{[ 159 ]}

En la secuenciación de Sanger microfluídica, la amplificación por termociclado de los fragmentos de ADN, así como su separación por electroforesis, se realizan en una sola oblea de vidrio (de aproximadamente 10  cm de diámetro), lo que reduce el uso de reactivos y el costo. ^{[ 160 ]} En algunos casos, los investigadores han demostrado que pueden aumentar el rendimiento de la secuenciación convencional mediante el uso de microchips. ^{[ 161 ]} Aún se requiere investigación para que esta tecnología sea efectiva.

Este método permite visualizar directamente la secuencia de moléculas de ADN mediante microscopía electrónica. Se ha demostrado la primera identificación de pares de bases de ADN dentro de moléculas de ADN intactas mediante la incorporación enzimática de bases modificadas, que contienen átomos con un número atómico mayor, así como la visualización directa y la identificación de bases marcadas individualmente dentro de una molécula de ADN sintética de 3272 pares de bases y un genoma viral de 7249 pares de bases. ^{[ 162 ]}

Este método se basa en el uso de la ARN polimerasa (RNAP), que se une a una microesfera de poliestireno . Un extremo del ADN que se va a secuenciar se une a otra microesfera, y ambas se colocan en trampas ópticas. El movimiento de la RNAP durante la transcripción acerca las microesferas y su distancia relativa cambia, lo que puede registrarse con una resolución de un solo nucleótido. La secuencia se deduce a partir de las cuatro lecturas con concentraciones reducidas de cada uno de los cuatro tipos de nucleótidos, de forma similar al método de Sanger. ^{[ 163 ]} Se realiza una comparación entre regiones y se deduce la información de la secuencia comparando las regiones de secuencia conocidas con las regiones de secuencia desconocidas. ^{[ 163 ]}

Se ha desarrollado un método para analizar conjuntos completos de interacciones proteicas mediante una combinación de pirosecuenciación 454 y un método de visualización de ARNm viral in vitro . Específicamente, este método une covalentemente las proteínas de interés a los ARNm que las codifican y luego detecta los fragmentos de ARNm mediante PCR de transcripción inversa . Posteriormente, el ARNm puede amplificarse y secuenciarse. El método combinado se denominó IVV-HiTSeq y puede realizarse en condiciones libres de células, aunque sus resultados podrían no ser representativos de las condiciones in vivo . ^{[ 164 ]}

En ocasiones, las lecturas sin procesar producidas por el secuenciador son correctas y precisas solo en una fracción de su longitud. El uso de la lectura completa puede introducir artefactos en los análisis posteriores, como el ensamblaje del genoma, la detección de SNP o la estimación de la expresión génica. Se han introducido dos clases de programas de recorte, basados ​​en algoritmos de ventana o de suma acumulada. ^{[ 173 ]} Esta es una lista parcial de los algoritmos de recorte disponibles actualmente, especificando la clase de algoritmo a la que pertenecen: