Electroforesis en gel bidimensional

La electroforesis bidimensional en gel , abreviada como 2-DE o electroforesis 2-D , es una forma de electroforesis en gel comúnmente utilizada para analizar proteínas . Las mezclas de proteínas se separan según dos propiedades en dos dimensiones en geles 2D. La 2-DE fue introducida independientemente en 1969 por Macko y Stegemann ^{[ 1 ]} (trabajando con proteínas de patata) y Dale y Latner ^{[ 2 ]} (trabajando con suero).

La electroforesis bidimensional (2D) comienza con la electroforesis en la primera dimensión y luego separa las moléculas perpendicularmente a la primera para crear un electroferograma en la segunda dimensión. En la electroforesis en la primera dimensión, las moléculas se separan linealmente según su punto isoeléctrico. En la segunda dimensión, las moléculas se separan a 90 grados del primer electroferograma según su masa molecular. Dado que es improbable que dos moléculas sean similares en dos propiedades distintas, la separación molecular es más eficaz en la electroforesis bidimensional que en la unidimensional.

Las dos dimensiones en las que se separan las proteínas utilizando esta técnica pueden ser el punto isoeléctrico , la masa del complejo proteico en el estado nativo o la masa de la proteína .

• La separación por punto isoeléctrico se denomina enfoque isoeléctrico . Para ello, se aplica un gradiente de pH a un gel y un potencial eléctrico a través del mismo, de modo que un extremo se vuelve más positivo que el otro. A cualquier valor de pH distinto de su punto isoeléctrico, las proteínas estarán cargadas. Si tienen carga positiva, serán atraídas hacia el extremo más negativo del gel, y si tienen carga negativa, hacia el extremo más positivo. Las proteínas aplicadas en la primera dimensión se desplazarán a lo largo del gel y se acumularán en su punto isoeléctrico; es decir, el punto en el que la carga total de la proteína es cero (carga neutra).
• La separación por masa de complejos proteicos se realiza mediante PAGE nativa , en la que las proteínas permanecen en su estado nativo y se separan en el campo eléctrico según su masa y la masa de sus complejos, respectivamente. Para obtener una separación por tamaño y no por carga neta, como en IEF, se transfiere una carga adicional a las proteínas mediante el uso de azul brillante de Coomassie o dodecilsulfato de litio. El conocimiento de los complejos proteicos es importante para el análisis del funcionamiento de las proteínas en una célula , ya que las proteínas actúan principalmente juntas en complejos para ser completamente funcionales. El análisis de esta organización suborgánula de la célula requiere técnicas que conserven el estado nativo de los complejos proteicos .
• La separación por masa se realiza comúnmente mediante SDS-PAGE . El SDS desnaturaliza las proteínas, disgrega la mayoría de los complejos y equilibra aproximadamente la relación masa-carga. El SDS debe utilizarse como segunda dimensión, perpendicular a la anterior, ya que disgrega los complejos (lo que imposibilita la PAGE nativa) y equilibra la relación masa-carga (lo que imposibilita la IEF).

El resultado es un gel con proteínas dispersas en su superficie. Estas proteínas pueden detectarse mediante diversos métodos, pero las tinciones más comunes son la de plata y la de azul brillante de Coomassie. En el primer caso, se aplica un coloide de plata al gel. La plata se une a los grupos cisteína de la proteína. La plata se oscurece al exponerla a la luz ultravioleta. La cantidad de plata se relaciona con la oscuridad y, por lo tanto, con la cantidad de proteína en una ubicación determinada del gel. Esta medición solo proporciona cantidades aproximadas, pero es suficiente para la mayoría de los fines. La tinción de plata es 100 veces más sensible que la de azul brillante de Coomassie, con un rango de linealidad 40 veces mayor. ^{[ 3 ]}

Otras moléculas, además de las proteínas, pueden separarse mediante electroforesis bidimensional. En los ensayos de superenrollamiento , el ADN enrollado se separa en la primera dimensión y se desnaturaliza mediante un intercalador de ADN (como el bromuro de etidio o la cloroquina, menos carcinogénica ) en la segunda. Esto es comparable a la combinación de PAGE nativa/SDS-PAGE en la separación de proteínas.

En proteómica cuantitativa , estas herramientas analizan principalmente biomarcadores cuantificando proteínas individuales y mostrando la separación entre uno o más puntos de proteína en una imagen escaneada de un gel 2-DE. Además, comparan puntos entre geles de muestras similares para mostrar, por ejemplo, diferencias proteómicas entre las etapas tempranas y avanzadas de una enfermedad. Si bien esta tecnología se utiliza ampliamente, su inteligencia aún no se ha perfeccionado. Por ejemplo, algunos programas informáticos pueden coincidir en la cuantificación y el análisis de puntos de proteína bien definidos y separados, pero ofrecen resultados y tendencias de análisis diferentes con puntos menos definidos y menos separados. ^{[ 5 ]} Se han publicado estudios comparativos para orientar a los investigadores sobre el mejor software para su análisis. ^{[ 6 ]}

Los desafíos para el análisis automático basado en software incluyen puntos incompletamente separados (superpuestos) (menos definidos o separados), puntos débiles/ruido (por ejemplo, "puntos fantasma"), diferencias de ejecución entre geles (por ejemplo, la proteína migra a diferentes posiciones en diferentes geles), puntos no coincidentes/no detectados, lo que lleva a valores faltantes , ^{[ 7 ]} puntos no coincidentes, errores en la cuantificación (varios puntos distintos pueden ser detectados erróneamente como un solo punto por el software y partes de un punto pueden ser excluidas de la cuantificación) y diferencias en los algoritmos del software y, por lo tanto, tendencias de análisis.

Las listas de selección generadas pueden utilizarse para la digestión automatizada en gel de manchas de proteínas y la posterior identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas . El análisis por espectrometría de masas permite identificar mediciones de masa precisas, así como la secuenciación de péptidos con masas atómicas que oscilan entre 1000 y 4000. ^{[ 8 ]}

• electroforesis diferencial en gel
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• Manual de principios y métodos de electroforesis bidimensional