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Cribado de dos híbridos

Descripción general del ensayo de doble híbrido, que comprueba las interacciones entre dos proteínas, denominadas aquí Cebo y Presa . A. El gen del factor de transcripción Gal4 ...

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Descripción general del ensayo de doble híbrido, que comprueba las interacciones entre dos proteínas, denominadas aquí Cebo y Presa . A. El gen del factor de transcripción Gal4 produce una proteína de dos dominios ( BD y AD ) esencial para la transcripción del gen reportero ( LacZ ). B , C. Se preparan dos proteínas de fusión: Gal4BD+Cebo y Gal4AD+Presa . Ninguna de ellas suele ser suficiente para iniciar la transcripción (del gen reportero) por sí sola. D. Cuando se producen ambas proteínas de fusión y la parte Cebo de la primera proteína de fusión interactúa con la parte Presa de la segunda, se produce la transcripción del gen reportero.

El cribado de dos híbridos (originalmente conocido como sistema de dos híbridos de levadura o Y2H ) es una técnica de biología molecular utilizada para descubrir interacciones proteína-proteína (PPI) [ 1 ] e interacciones proteína-ADN [ 2 ] [ 3 ] mediante la prueba de interacciones físicas (como la unión) entre dos proteínas o una sola proteína y una molécula de ADN , respectivamente.

La premisa de la prueba es la activación de uno o más genes reporteros corriente abajo mediante la unión de un factor de transcripción a una secuencia activadora corriente arriba (UAS). Para el cribado de doble híbrido, el factor de transcripción se divide en dos fragmentos separados, llamados dominio de unión al ADN (DBD o a menudo también abreviado como BD) y dominio activador (AD). El BD es el dominio responsable de la unión a la UAS y el AD es el dominio responsable de la activación de la transcripción . [ 1 ] [ 2 ] El Y2H es, por lo tanto, un ensayo de complementación de fragmentos de proteínas .

Historia

Desarrollada por Stanley Fields y Ok-Kyu Song en 1989, la técnica se diseñó originalmente para detectar interacciones proteína-proteína utilizando el activador transcripcional Gal4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae . La proteína Gal4 activaba la transcripción de un gen implicado en la utilización de galactosa, que constituía la base de la selección. [ 4 ] Desde entonces, el mismo principio se ha adaptado para describir muchos métodos alternativos, incluyendo algunos que detectan interacciones proteína-ADN o interacciones ADN-ADN , así como métodos que utilizan diferentes organismos huéspedes como Escherichia coli o células de mamíferos en lugar de levadura. [ 3 ] [ 5 ]

Premisa básica

La clave del sistema de doble híbrido reside en que, en la mayoría de los factores de transcripción eucariotas , los dominios de activación y unión son modulares y pueden funcionar cerca uno del otro sin unión directa. [ 6 ] Esto significa que, aunque el factor de transcripción se divida en dos fragmentos, aún puede activar la transcripción cuando ambos fragmentos están conectados indirectamente.

El método de cribado más común es el ensayo de doble híbrido de levadura. En este método, el investigador sabe dónde se encuentra cada presa en el medio de cultivo (placas de agar). En la última década, se han analizado millones de interacciones potenciales en diversos organismos mediante sistemas de cribado de alto rendimiento (a menudo con robots), y se han detectado y clasificado miles de interacciones en bases de datos como BioGRID . [ 7 ] [ 8 ] Este sistema suele utilizar una cepa de levadura modificada genéticamente en la que falta la biosíntesis de ciertos nutrientes (generalmente aminoácidos o ácidos nucleicos ). Al cultivarse en medios que carecen de estos nutrientes, la levadura no sobrevive. Esta cepa mutante de levadura puede modificarse para incorporar ADN extraño en forma de plásmidos . En el cribado de doble híbrido de levadura, se introducen simultáneamente plásmidos cebo y presa separados en la cepa mutante de levadura, o bien se utiliza una estrategia de apareamiento para obtener ambos plásmidos en una misma célula huésped. [ 9 ]

El segundo método de alto rendimiento es el de cribado de bibliotecas. En este método, las células que contienen el cebo y la presa se cruzan aleatoriamente. Tras el cruce y la selección de las células supervivientes en un medio selectivo, el científico secuencia los plásmidos aislados para determinar qué presa (secuencia de ADN) interactúa con el cebo utilizado. Este método presenta una menor reproducibilidad y tiende a generar una mayor cantidad de falsos positivos en comparación con el método de matriz. [ 9 ]

Los plásmidos se diseñan para producir una proteína en la que el fragmento del dominio de unión al ADN (BD) se fusiona a una proteína, mientras que otro plásmido se diseña para producir una proteína en la que el fragmento del dominio de activación (AD) se fusiona a otra proteína. La proteína fusionada al BD se denomina proteína cebo y suele ser una proteína conocida que el investigador utiliza para identificar nuevos socios de unión. La proteína fusionada al AD se denomina proteína presa y puede ser una proteína conocida o una biblioteca de proteínas conocidas o desconocidas. En este contexto, una biblioteca puede consistir en una colección de secuencias codificantes de proteínas que representan todas las proteínas expresadas en un organismo o tejido en particular, o puede generarse mediante la síntesis de secuencias de ADN aleatorias. [ 3 ] Independientemente de su origen, posteriormente se incorporan a la secuencia codificante de proteínas de un plásmido, que luego se transfecta en las células elegidas para el método de cribado. [ 3 ] Esta técnica, cuando se utiliza una biblioteca, supone que cada célula se transfecta con no más de un plásmido y que, por lo tanto, cada célula finalmente expresa no más de un miembro de la biblioteca de proteínas.

Si las proteínas cebo y presa interactúan (es decir, se unen), entonces el dominio AD y el dominio BD del factor de transcripción se conectan indirectamente, acercando el dominio AD al sitio de inicio de la transcripción y permitiendo la transcripción del gen o genes reporteros. Si las dos proteínas no interactúan, no se produce la transcripción del gen reportero. De esta manera, una interacción exitosa entre las proteínas fusionadas se vincula con un cambio en el fenotipo celular. [ 1 ]

El reto de separar las células que expresan proteínas que interactúan con sus proteínas de fusión correspondientes de aquellas que no lo hacen, se aborda en la siguiente sección.

Dominios fijos

En cualquier estudio, algunos de los dominios proteicos, los que se investigan, se variarán según los objetivos del estudio, mientras que otros dominios, los que no se investigan, se mantendrán constantes. Por ejemplo, en un estudio de doble híbrido para seleccionar dominios de unión al ADN, el dominio de unión al ADN (BD) se variará, mientras que las dos proteínas que interactúan, el cebo y la presa, deben mantenerse constantes para mantener una unión fuerte entre el BD y el AD. Hay varios dominios entre los que elegir el BD, el cebo, la presa y el AD, si estos se van a mantener constantes. En las investigaciones de interacción proteína-proteína, el BD puede elegirse de cualquiera de los muchos dominios de unión al ADN fuertes, como Zif268 . [ 2 ] Una elección frecuente de dominios de cebo y presa son los residuos 263-352 de la Gal11P de levadura con una mutación N342V [ 2 ] y los residuos 58-97 de la Gal4 de levadura, [ 2 ] respectivamente. Estos dominios pueden utilizarse tanto en técnicas de selección basadas en levaduras como en bacterias y se sabe que se unen fuertemente entre sí. [ 1 ] [ 2 ]

El AD elegido debe ser capaz de activar la transcripción del gen reportero, utilizando la maquinaria de transcripción propia de la célula. Por lo tanto, la variedad de AD disponibles para su uso en técnicas basadas en levaduras puede no ser adecuada para su uso en sus análogos bacterianos. El AD derivado del virus del herpes simple, VP16, y el AD Gal4 de levadura se han utilizado con éxito en levaduras [ 1 ] , mientras que una porción de la subunidad α de la ARN polimerasa de E. coli se ha utilizado en métodos basados ​​en E. coli . [ 2 ] [ 3 ]

Si bien los dominios de activación potente pueden permitir una mayor sensibilidad hacia las interacciones más débiles, por el contrario, un dominio de activación más débil puede proporcionar una mayor rigurosidad.

Construcción de plásmidos de expresión

Para realizar un análisis de doble híbrido o alguna de sus técnicas derivadas, es necesario incorporar varias secuencias genéticas modificadas a la célula huésped. Las consideraciones y los métodos empleados en la construcción e introducción de estas secuencias varían según las necesidades del ensayo y el organismo elegido como modelo experimental.

Existen dos grandes categorías de bibliotecas híbridas: bibliotecas aleatorias y bibliotecas basadas en ADNc. Una biblioteca de ADNc está constituida por el ADNc producido mediante la transcripción inversa del ARNm recolectado de células específicas de determinados tipos celulares. Esta biblioteca puede ligarse a una construcción de manera que se una al BD o AD que se utiliza en el ensayo. [ 1 ] Una biblioteca aleatoria utiliza longitudes de ADN de secuencia aleatoria en lugar de estas secciones de ADNc. Existen varios métodos para la producción de estas secuencias aleatorias, incluida la mutagénesis de casete . [ 2 ] Independientemente del origen de la biblioteca de ADN, esta se liga en el lugar apropiado del plásmido/fagemido correspondiente utilizando las endonucleasas de restricción adecuadas . [ 2 ]

Consideraciones específicas sobre E. coli

Al colocar las proteínas híbridas bajo el control de promotores lac inducibles por IPTG , se expresan únicamente en medios suplementados con IPTG. Además, al incluir diferentes genes de resistencia a antibióticos en cada construcción genética, se previene fácilmente el crecimiento de células no transformadas mediante el cultivo en medios que contienen los antibióticos correspondientes. Esto es particularmente importante para los métodos de contraselección en los que la falta de interacción es necesaria para la supervivencia celular. [ 2 ]

El gen reportero puede insertarse en el genoma de E. coli insertándolo primero en un episoma , un tipo de plásmido con la capacidad de incorporarse al genoma de la célula bacteriana [ 2 ] con un número de copias de aproximadamente una por célula. [ 10 ]

Los fagemidos de expresión híbrida pueden ser electroporados en células de E. coli XL-1 Blue que, tras la amplificación e infección con el fago auxiliar VCS-M13 , producirán una reserva de fagos de la biblioteca. Cada uno de estos fagos contendrá un miembro monocatenario de la biblioteca de fagemidos. [ 2 ]

Recuperación de información sobre proteínas

Una vez realizada la selección, se debe determinar la estructura primaria de las proteínas que presentan las características adecuadas. Esto se logra recuperando las secuencias codificantes de proteínas (tal como se insertaron originalmente) de las células que muestran el fenotipo apropiado.

E. coli

El fagemido utilizado para transformar células de E. coli puede recuperarse de las células seleccionadas infectándolas con el fago auxiliar VCS-M13. Las partículas de fago resultantes contienen los fagemidos monocatenarios y se utilizan para infectar células XL-1 Blue. [ 2 ] Posteriormente, se recolectan los fagemidos bicatenarios de estas células XL-1 Blue, invirtiendo esencialmente el proceso utilizado para producir el fago de la biblioteca original. Finalmente, las secuencias de ADN se determinan mediante secuenciación dideoxi . [ 2 ]

Controlar la sensibilidad

El represor Tet-R derivado de Escherichia coli puede utilizarse junto con un gen reportero convencional y controlarse mediante tetraciclina o doxiciclina (inhibidores de Tet-R). De este modo, la expresión de Tet-R se controla mediante el sistema estándar de doble híbrido, pero a su vez, Tet-R controla (reprime) la expresión de un gen reportero previamente mencionado, como HIS3 , a través de su promotor Tet-R. Posteriormente, se puede utilizar tetraciclina o sus derivados para regular la sensibilidad de un sistema que utilice Tet-R. [ 1 ]

La sensibilidad también puede controlarse variando la dependencia de las células respecto a sus genes reporteros. Por ejemplo, esto puede verse afectado alterando la concentración de histidina en el medio de cultivo para las células dependientes de his3 y alterando la concentración de estreptomicina para las células dependientes de aadA . [ 2 ] [ 3 ] La dependencia del gen de selección también puede controlarse aplicando un inhibidor del gen de selección a una concentración adecuada. El 3-amino-1,2,4-triazol (3-AT), por ejemplo, es un inhibidor competitivo del producto del gen HIS3 y puede utilizarse para titular el nivel mínimo de expresión de HIS3 necesario para el crecimiento en medios deficientes en histidina. [ 2 ]

La sensibilidad también puede modularse variando el número de secuencias operadoras en el ADN reportero.

Proteínas no fusionadas

Una tercera proteína, no de fusión, puede coexpresarse con dos proteínas de fusión. Dependiendo de la investigación, la tercera proteína puede modificar una de las proteínas de fusión o mediar o interferir en su interacción. [ 1 ]

La coexpresión de la tercera proteína puede ser necesaria para la modificación o activación de una o ambas proteínas de fusión. Por ejemplo, S. cerevisiae no posee tirosina quinasa endógena . Si una investigación involucra una proteína que requiere fosforilación de tirosina , la quinasa debe proporcionarse en forma de un gen de tirosina quinasa. [ 1 ]

La proteína no fusionada puede mediar la interacción uniéndose simultáneamente a ambas proteínas fusionadas, como en el caso de la dimerización del receptor dependiente del ligando. [ 1 ]

Para una proteína con un socio interactuante, su homología funcional con otras proteínas puede evaluarse suministrando la tercera proteína en forma no fusionada, la cual puede o no competir con la proteína de fusión por su socio de unión. La unión entre la tercera proteína y la otra proteína de fusión interrumpirá la formación del complejo de activación de la expresión del gen reportero y, por lo tanto, reducirá la expresión del gen reportero, lo que dará lugar al cambio distintivo en el fenotipo. [ 1 ]

Sistema de doble híbrido de levadura con ubiquitina dividida

Una limitación de los sistemas clásicos de doble híbrido de levadura es que se limitan a proteínas solubles. Por lo tanto, es imposible utilizarlos para estudiar las interacciones proteína-proteína entre proteínas de membrana integrales insolubles . El sistema de ubiquitina dividida proporciona un método para superar esta limitación. [ 11 ] En el sistema de ubiquitina dividida, dos proteínas de membrana integrales que se van a estudiar se fusionan a dos fragmentos de ubiquitina diferentes : un fragmento de ubiquitina C-terminal ("Cub", residuos 35-76) y un fragmento de ubiquitina N-terminal ("Nub", residuos 1-34). Estas proteínas fusionadas se denominan cebo y presa, respectivamente. Además de estar fusionada a una proteína de membrana integral, el fragmento Cub también está fusionado a un factor de transcripción (FT) que puede ser escindido por proteasas específicas de ubiquitina . Tras la interacción cebo-presa, los fragmentos Nub y Cub se ensamblan, reconstituyendo la ubiquitina dividida. La molécula de ubiquitina dividida reconstituida es reconocida por proteasas específicas de ubiquitina, que escinden el factor de transcripción, permitiéndole inducir la transcripción de genes reporteros . [ 12 ]

Ensayo de doble híbrido fluorescente

Zolghadr y colaboradores presentaron un sistema híbrido doble fluorescente que utiliza dos proteínas híbridas fusionadas a diferentes proteínas fluorescentes, así como a LacI, el represor lac . La estructura de las proteínas de fusión es la siguiente: FP2-LacI-cebo y FP1-presa, donde las proteínas cebo y presa interactúan y acercan las proteínas fluorescentes (FP1 = GFP , FP2 = mCherry ) al sitio de unión de la proteína LacI en el genoma de la célula huésped. [ 13 ] El sistema también puede utilizarse para la detección de inhibidores de las interacciones proteína-proteína. [ 14 ]

Sistemas enzimáticos de doble híbrido: KISS

Si bien el sistema Y2H original utilizaba un factor de transcripción reconstituido, otros sistemas crean actividades enzimáticas para detectar interacciones proteína-proteína (PPI). Por ejemplo, el sensor de sustrato de quinasa ("KISS"), un método de doble híbrido en mamíferos, se diseñó para mapear las PPI intracelulares. En este sistema, una proteína cebo se fusiona a una porción de TYK2 que contiene una quinasa , y una proteína presa se acopla a un fragmento del receptor de citocinas gp130 . Cuando el cebo y la presa interactúan, TYK2 fosforila los sitios de unión de STAT3 en la quimera presa, lo que finalmente conduce a la activación de un gen reportero . [ 15 ]

Cribado de doble híbrido mediante secuenciación

Se han desarrollado varias estrategias en las que los positivos de doble híbrido se identifican mediante secuenciación de ADN , generalmente después de la selección utilizando un gen reportero . Una variante de este enfoque se describió recientemente como Liquid Y2H-Seq . [ 16 ] Tras la demostración de Stanley Fields y colegas de que los ensayos de activación transcripcional podían utilizarse para detectar interacciones proteína-proteína y examinar bibliotecas para nuevos socios de unión, la utilidad práctica del método se estableció rápidamente. En 1993, Vojtek et al. realizaron el primer cribado de doble híbrido exitoso para identificar una nueva interacción, descubriendo que la GTPasa Ras se une físicamente a la quinasa RAF, una proteína previamente conocida por funcionar genéticamente aguas abajo de Ras. [ 17 ] Un hito posterior ocurrió en la Universidad Johns Hopkins , donde Anton Yuryev identificó dos nuevas familias de proteínas que interactúan con el dominio C-terminal (CTD) de la ARN polimerasa II. Estas familias se caracterizaron por dominios de interacción con el CTD (CID) altamente homólogos, lo que proporcionó evidencia estructural de la importancia funcional de las interacciones. Dado que estas proteínas también mostraron homología con factores de empalme conocidos, este descubrimiento sugirió que el CTD funciona para vincular físicamente la transcripción génica y el procesamiento del ARNm en eucariotas. Posteriormente, Yuryev amplió la metodología proponiendo una técnica para identificar interacciones funcionales mediante la selección de socios de unión específicos de isoforma, demostrada utilizando las tres isoformas de la quinasa RAF. [ 18 ]

Variantes híbridas de uno, tres y uno-dos

Híbrido único

La variante de un híbrido de esta técnica está diseñada para investigar las interacciones proteína-ADN y utiliza una única proteína de fusión en la que el dominio de activación (AD) está unido directamente al dominio de unión. El dominio de unión puede estar constituido por una biblioteca y, por lo tanto, puede seleccionarse para proteínas que se unan a una secuencia diana deseada (que se inserta en la región promotora de un gen reportero). En un sistema de selección positiva, se selecciona un dominio de unión que se une con éxito al UAS y permite la transcripción. [ 1 ]

Cabe señalar que la selección de dominios de unión al ADN no necesariamente se realiza mediante un sistema de un híbrido, sino que también puede realizarse mediante un sistema de dos híbridos en el que se varía el dominio de unión y se mantienen constantes las proteínas cebo y presa. [ 2 ] [ 3 ]

Los ensayos de un híbrido pueden utilizarse para investigar las propiedades de activación transcripcional de las proteínas. Esto se realizó en un ensayo a gran escala de proteínas de levadura fusionadas a un dominio de unión al ADN , donde la proteína fusionada simplemente activaba la transcripción de un gen reportero . Esto reveló 451 activadores transcripcionales en levadura, incluyendo 132 activadores potentes. [ 19 ]

Híbrido triple

Descripción general del ensayo de tres híbridos.

Las interacciones ARN-proteína se han investigado mediante una variante de triple híbrido de la técnica de doble híbrido. En este caso, una molécula de ARN híbrida sirve para unir los dos dominios de fusión de proteínas, que no están diseñados para interactuar entre sí, sino con la molécula de ARN intermediaria (a través de sus dominios de unión a ARN). [ 1 ] Las técnicas que involucran proteínas no fusionadas que realizan una función similar, como se describe en la sección anterior sobre "proteínas no fusionadas", también pueden denominarse métodos de triple híbrido.

Híbrido uno-dos

El uso simultáneo de los métodos de uno y dos híbridos (es decir, la interacción simultánea proteína-proteína y proteína-ADN) se conoce como un enfoque de uno-dos híbridos y se espera que aumente la rigurosidad del cribado. [ 1 ]

organismo huésped

Aunque teóricamente cualquier célula viva podría usarse como base para un análisis de doble híbrido, existen consideraciones prácticas que determinan cuál se elige. La línea celular elegida debe ser relativamente barata y fácil de cultivar, y suficientemente robusta para soportar la aplicación de los métodos y reactivos de investigación. [ 1 ] Esto último es especialmente importante para realizar estudios de alto rendimiento . Por lo tanto, la levadura S. cerevisiae ha sido el principal organismo huésped para estudios de doble híbrido. Sin embargo, no siempre es el sistema ideal para estudiar proteínas interactuantes de otros organismos. [ 20 ] Las células de levadura a menudo no tienen las mismas modificaciones postraduccionales, tienen un uso de codones diferente o carecen de ciertas proteínas que son importantes para la expresión correcta de las proteínas. Para hacer frente a estos problemas, se han desarrollado varios sistemas de doble híbrido novedosos. Dependiendo del sistema utilizado, se utilizan placas de agar o un medio de cultivo específico para cultivar las células y permitir la selección para la interacción. El método más común es el de placa de agar, donde las células se siembran en un medio selectivo para ver si se produce la interacción. Las células que no tienen proteínas de interacción no deberían sobrevivir en este medio selectivo. [ 7 ] [ 21 ]

S. cerevisiae (levadura)

La levadura S. cerevisiae fue el organismo modelo utilizado durante el inicio de la técnica de doble híbrido. Se la conoce comúnmente como el sistema Y2H. Posee varias características que la convierten en un organismo robusto para albergar la interacción, incluyendo la capacidad de formar estructuras proteicas terciarias, pH interno neutro, mayor capacidad para formar enlaces disulfuro y glutatión en estado reducido, entre otros factores amortiguadores citosólicos, para mantener un ambiente interno propicio. [ 1 ] El modelo de levadura puede manipularse mediante técnicas no moleculares y se conoce la secuencia completa de su genoma. [ 1 ] Los sistemas de levadura toleran diversas condiciones de cultivo y productos químicos agresivos que no podrían aplicarse a los cultivos de tejidos de mamíferos. [ 1 ]

Se han creado varias cepas de levadura específicamente para ensayos Y2H, por ejemplo, Y187 [ 22 ] y AH109 [ 23 ] , ambas producidas por Clontech . También se han utilizado las cepas de levadura R2HMet y BK100 [ 24 ] .

Candida albicans

C. albicans es una levadura con una característica particular: traduce el codón CUG a serina en lugar de leucina. Debido a este uso diferente de codones, es difícil usar el sistema modelo S. cerevisiae como Y2H para comprobar las interacciones proteína-proteína usando genes de C. albicans . Para proporcionar un entorno más nativo,se desarrolló un sistema de doble híbrido (C2H) de C. albicans . Con este sistema, las interacciones proteína-proteína se pueden estudiar en la propia C. albicans . [ 25 ] [ 26 ] Una adición reciente fue la creación de un sistema de alto rendimiento. [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]

E. coli

Los métodos de doble híbrido bacteriano (B2H o BTH) se suelen realizar en E. coli y presentan algunas ventajas sobre los sistemas basados ​​en levaduras. Por ejemplo, la mayor eficiencia de transformación y la mayor velocidad de crecimiento permiten el uso de bibliotecas más grandes (superiores a 10⁸ ) . [ 2 ] La ausencia de requisitos para incluir una señal de localización nuclear en la secuencia de proteínas y la capacidad de estudiar proteínas que serían tóxicas para la levadura también pueden ser factores importantes a considerar al elegir un organismo de fondo experimental. [ 2 ]

La actividad de metilación de ciertas proteínas ADN metiltransferasas de E. coli puede interferir con la selección de algunas proteínas de unión al ADN. Si se prevé esto, el uso de una cepa de E. coli deficiente en una metiltransferasa específica puede ser una solución obvia. [ 2 ] El B2H puede no ser ideal para estudiar las interacciones proteína-proteína eucariotas (por ejemplo, proteínas humanas), ya que las proteínas pueden no plegarse como en las células eucariotas o pueden carecer de otros procesos.

Células de mamíferos

En los últimos años se ha diseñado un sistema de doble híbrido de mamíferos (M2H) para estudiar las interacciones proteína-proteína de mamíferos en un entorno celular que imita fielmente el entorno proteico nativo. [ 30 ] En este sistema se utilizan células de mamíferos transfectadas transitoriamente para encontrar interacciones proteína-proteína. [ 31 ] [ 32 ] El uso de una línea celular de mamíferos para estudiar las interacciones proteína-proteína de mamíferos ofrece la ventaja de trabajar en un contexto más nativo. [ 5 ] Las modificaciones postraduccionales, la fosforilación, la acilación y la glicosilación son similares. La localización intracelular de las proteínas también es más precisa en comparación con el uso de un sistema de doble híbrido de levadura. [ 33 ] [ 34 ] Con el sistema de doble híbrido de mamíferos también es posible estudiar las señales de entrada. [ 35 ] Otra gran ventaja es que los resultados se pueden obtener en 48 horas después de la transfección. [ 5 ]

Arabidopsis thaliana

En 2005 se desarrolló un sistema de doble híbrido en plantas. Mediante protoplastos de A. thaliana, se pueden estudiar las interacciones proteína-proteína en plantas. De esta forma, las interacciones se pueden estudiar en su contexto nativo. En este sistema, los dominios AD y BD de GAL4 están bajo el control del potente promotor 35S. La interacción se mide utilizando un gen reportero GUS. Para permitir un cribado de alto rendimiento, los vectores se hicieron compatibles con Gateway . El sistema se conoce como sistema de doble híbrido de protoplastos (P2H). [ 36 ]

Aplysia californica

La liebre de mar A. californica es un organismo modelo en neurobiología para estudiar, entre otros, los mecanismos moleculares de la memoria a largo plazo. Para estudiar las interacciones, importantes en neurología, en un entorno más natural, se ha desarrollado un sistema de dos híbridos en neuronas de A. californica . En este sistema se utilizan los genes A. GAL4 AD y BD. [ 37 ] [ 38 ]

Bombyx mori

Se desarrolló un sistema de doble híbrido de insectos (I2H) en una línea celular de gusano de seda proveniente de la larva o oruga de la polilla de seda domesticada, Bombyx mori (células BmN4). Este sistema utiliza el dominio de unión a GAL4 y el dominio de activación de NF-κB P65 de ratón. Ambos están bajo el control del promotor OpIE2. [ 39 ]

Aplicaciones

Determinación de secuencias cruciales para la interacción

Al cambiar aminoácidos específicos mediante la mutación de los pares de bases de ADN correspondientes en los plásmidos utilizados, se puede determinar la importancia de esos residuos de aminoácidos en el mantenimiento de la interacción. [ 1 ]

Después de utilizar un método basado en células bacterianas para seleccionar proteínas de unión al ADN, es necesario comprobar la especificidad de estos dominios, ya que existe un límite en la medida en que el genoma de la célula bacteriana puede actuar como un sumidero de dominios con afinidad por otras secuencias (o, de hecho, una afinidad general por el ADN). [ 2 ]

Descubrimiento de drogas y venenos

Las interacciones de señalización proteína-proteína constituyen objetivos terapéuticos adecuados debido a su especificidad y omnipresencia. El enfoque de descubrimiento aleatorio de fármacos utiliza bancos de compuestos que comprenden estructuras químicas aleatorias y requiere un método de alto rendimiento para probar estas estructuras en su objetivo previsto. [ 1 ] [ 21 ]

La célula elegida para la investigación puede ser modificada genéticamente para reflejar el aspecto molecular que el investigador pretende estudiar y luego utilizarse para identificar nuevos fármacos o agentes antipesticidas para humanos o animales. [ 1 ] [ 21 ]

Determinación de la función de las proteínas

Mediante la determinación de los socios de interacción de proteínas desconocidas, se pueden inferir las posibles funciones de estas nuevas proteínas. [ 1 ] Esto puede hacerse utilizando una sola proteína conocida frente a una biblioteca de proteínas desconocidas o, a la inversa, seleccionando de una biblioteca de proteínas conocidas utilizando una sola proteína de función desconocida. [ 1 ]

Selección de proteínas de dedo de zinc

Para seleccionar proteínas de dedos de zinc (ZFP) para ingeniería de proteínas , se han utilizado con éxito métodos adaptados de la técnica de cribado de doble híbrido. [ 2 ] [ 3 ] Una ZFP es en sí misma una proteína de unión al ADN que se utiliza en la construcción de dominios de unión al ADN personalizados que se unen a una secuencia de ADN deseada. [ 40 ]

Mediante el uso de un gen de selección con la secuencia diana deseada incluida en el UAS, y aleatorizando las secuencias de aminoácidos relevantes para producir una biblioteca de ZFP, se pueden seleccionar células que albergan una interacción ADN-ZFP con las características requeridas. Cada ZFP normalmente reconoce solo 3-4 pares de bases, por lo que para evitar el reconocimiento de sitios fuera del UAS, el ZFP aleatorizado se incorpora a un "andamio" que consta de otros dos ZFP de secuencia constante. El UAS se diseña, por lo tanto, para incluir la secuencia diana del andamio constante, además de la secuencia para la cual se selecciona un ZFP. [ 2 ] [ 3 ]

También se pueden investigar otros dominios de unión al ADN utilizando este sistema. [ 2 ]

Fortalezas

  • Las pruebas de doble híbrido son de baja tecnología; se pueden realizar en cualquier laboratorio sin necesidad de equipos sofisticados.
  • Las pruebas de doble híbrido pueden proporcionar una primera pista importante para la identificación de socios de interacción.
  • El ensayo es escalable, lo que permite analizar las interacciones entre numerosas proteínas. Además, puede automatizarse y, mediante el uso de robots, se pueden analizar muchas proteínas frente a miles de proteínas potencialmente interactivas en un tiempo relativamente corto. Se utilizan dos tipos de análisis a gran escala: el método de biblioteca y el método de matriz.
  • Los datos del sistema de doble híbrido de levadura pueden tener una calidad similar a los datos generados por el método alternativo de purificación por coafinidad seguido de espectrometría de masas (AP/MS). [ 41 ] [ 9 ]

Debilidades

  • La principal crítica aplicada al cribado de interacciones proteína-proteína mediante el sistema de doble híbrido de levadura radica en la posibilidad de un elevado número de identificaciones falsas positivas (y falsas negativas). Se desconoce la tasa exacta de resultados falsos positivos, pero estimaciones anteriores la situaban en torno al 70 %. Esto también explica, en parte, la escasa coincidencia de resultados que se observa con frecuencia al utilizar un cribado de doble híbrido (de alto rendimiento), especialmente al emplear diferentes sistemas experimentales. [ 9 ] [ 32 ]

La razón de esta alta tasa de error radica en las características de la pantalla:

  • Ciertas variantes del ensayo sobreexpresan las proteínas de fusión, lo que puede provocar concentraciones de proteínas no naturales que dan lugar a resultados positivos inespecíficos (falsos positivos).
  • Las proteínas híbridas son proteínas de fusión; es decir, las partes fusionadas pueden inhibir ciertas interacciones, especialmente si la interacción tiene lugar en el extremo N-terminal de una proteína de prueba (donde normalmente se une el dominio de unión al ADN o de activación).
  • Es posible que no se produzca una interacción en la levadura, el organismo huésped típico para la hibridación de doble híbrido en levadura (Y2H). Por ejemplo, si se analiza una proteína bacteriana en levadura, podría carecer de una chaperona para su correcto plegamiento, la cual solo está presente en su huésped bacteriano. Además, en ocasiones, una proteína de mamífero no se modifica correctamente en la levadura (por ejemplo, le falta la fosforilación ), lo que también puede generar resultados erróneos.
  • La reacción Y2H tiene lugar en el núcleo. Si las proteínas de prueba no se localizan en el núcleo (debido a que poseen otras señales de localización), es posible que dos proteínas que interactúan resulten no interactuar entre sí.
  • Algunas proteínas podrían interactuar específicamente cuando se coexpresan en la levadura, aunque en realidad nunca están presentes en la misma célula al mismo tiempo. Sin embargo, en la mayoría de los casos no se puede descartar que dichas proteínas se expresen en ciertas células o bajo ciertas circunstancias.

Cada uno de estos puntos por sí solo puede dar lugar a resultados falsos. Debido a los efectos combinados de todas las fuentes de error, el sistema de doble híbrido de levadura debe interpretarse con precaución. La probabilidad de generar falsos positivos implica que todas las interacciones deben confirmarse mediante un ensayo de alta confianza, por ejemplo, la co-inmunoprecipitación de las proteínas endógenas, lo cual es difícil para datos de interacción proteína-proteína a gran escala. Alternativamente, los datos de Y2H pueden verificarse utilizando múltiples variantes de Y2H [ 42 ] o técnicas bioinformáticas. Estas últimas comprueban si las proteínas que interactúan se expresan al mismo tiempo, comparten algunas características comunes (como anotaciones de ontología génica o ciertas topologías de red ) o tienen interacciones homólogas en otras especies. [ 43 ]

Véase también

Referencias

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  • Detalles sobre la técnica hermana del sistema híbrido doble
  • Descripción general del sistema de doble híbrido de levadura según Science Creative Quarterly.
  • Cribado de levadura de un híbrido compatible con Gateway
  • Animación en vídeo del sistema de doble híbrido de levadura.
  • Técnicas de sistemas híbridos de dos componentes en los encabezamientos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
  • Sistema de dos híbridos de levadura
  • Base de datos BioGrid con interacciones proteína-proteína
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