Ensayo

Dependiendo de si un ensayo solo considera un único punto temporal o lecturas cronometradas tomadas en múltiples puntos temporales, un ensayo puede ser:

1. Un ensayo de punto final , en el que se realiza una única medición después de un período de incubación fijo; o
2. Un ensayo cinético consiste en realizar mediciones repetidas durante un intervalo de tiempo fijo. Los resultados de un ensayo cinético pueden visualizarse numéricamente (por ejemplo, como un parámetro de pendiente que representa la tasa de cambio de la señal a lo largo del tiempo) o gráficamente (por ejemplo, como una gráfica de la señal medida en cada punto temporal). En los ensayos cinéticos, tanto la magnitud como la forma de la respuesta medida a lo largo del tiempo proporcionan información importante.
3. Un ensayo de alto rendimiento puede ser un ensayo de punto final o un ensayo cinético, generalmente realizado en una plataforma automatizada en formatos de microplacas de 96, 384 o 1536 pocillos ( cribado de alto rendimiento ). Dichos ensayos permiten analizar un gran número de compuestos o analitos, o realizar lecturas biológicas funcionales en respuesta a un estímulo o a los compuestos que se estén analizando. ^{[ 6 ]}

Dependiendo de la cantidad de objetivos o analitos que se estén midiendo:

1. Los ensayos habituales son ensayos simples o de un solo objetivo , que suele ser lo predeterminado a menos que se denominen ensayos multiplex.
2. Los ensayos multiplex se utilizan para medir simultáneamente la presencia, concentración, actividad o calidad de múltiples analitos en una sola prueba. El advenimiento de la multiplexación permitió realizar pruebas de muestras rápidas y eficientes en muchos campos, incluyendo inmunología, citoquímica, genética/genómica, farmacocinética y toxicología. ^{[ 7 ]}

Según la calidad del resultado obtenido, los ensayos se pueden clasificar en:

1. Ensayos cualitativos , es decir, ensayos que generalmente dan solo un aprobado o suspenso, o positivo o negativo o algún tipo de grado cualitativo pequeño en lugar de una cantidad exacta.
2. Los ensayos semicuantitativos , es decir, los ensayos que proporcionan un resultado aproximado en lugar de una cantidad exacta de la sustancia, suelen tener más de dos niveles de significancia que los dos resultados posibles (positivo o negativo). Por ejemplo, se utilizan puntuaciones en una escala de 1+ a 4+ para las pruebas de grupo sanguíneo basadas en la aglutinación de glóbulos rojos en respuesta a los reactivos de tipificación (anticuerpos contra los antígenos del grupo sanguíneo).
3. Los ensayos cuantitativos , es decir, los ensayos que proporcionan una medida numérica precisa y exacta de la cantidad de una sustancia en una muestra, son ejemplos de ensayos utilizados en laboratorios de coagulación para la enfermedad hemorrágica hereditaria más común, la enfermedad de Von Willebrand . En estos ensayos, se mide la cantidad de VWF presente en una muestra de sangre mediante un inmunoensayo .
4. Los ensayos funcionales , es decir, aquellos que intentan cuantificar la actividad de una sustancia activa en lugar de solo su cantidad, son ejemplos de ensayos funcionales. El ensayo del cofactor de ristocetina , equivalente al ensayo del antígeno VWF, mide la actividad funcional del VWF presente en el plasma del paciente mediante la adición de plaquetas fijadas con formalina y el aumento gradual de la cantidad de ristocetina, un fármaco que se administra mientras se mide la aglutinación de las plaquetas fijadas. Un ensayo similar, pero con un propósito diferente, se denomina agregación plaquetaria inducida por ristocetina (RIPA), que evalúa la respuesta de las plaquetas endógenas vivas del paciente a la ristocetina (exógena) y al VWF (generalmente endógeno).

Dependiendo del sustrato general sobre el que se aplique el principio de ensayo:

1. Bioensayo : cuando la respuesta es la actividad biológica de objetos vivos. Ejemplos:
   1. in vivo , organismo completo (por ejemplo, ratón u otro sujeto al que se le inyectó un fármaco)
   2. Parte del cuerpo ex vivo (por ejemplo, la pata de una rana)
   3. órgano ex vivo (por ejemplo, corazón de un perro)
   4. Parte ex vivo de un órgano (por ejemplo, un segmento de intestino).
   5. tejido (por ejemplo, lisado de Limulus)
   6. célula (por ejemplo, plaquetas)
2. Ensayo de unión de ligando: se realiza cuando un ligando (generalmente una molécula pequeña) se une a un receptor (generalmente una proteína grande).
3. Inmunoensayo cuando la respuesta es una reacción de unión antígeno-anticuerpo.

Dependiendo de la naturaleza del sistema de amplificación de señal, los ensayos pueden ser de numerosos tipos, por mencionar algunos:

1. Ensayo enzimático : Las enzimas pueden analizarse mediante su actividad altamente repetitiva sobre un gran número de sustratos, cuando la pérdida de un sustrato o la formación de un producto puede tener un atributo medible como el color o la absorbancia a una longitud de onda o luz determinada, o la electroquimioluminiscencia o la actividad eléctrica/redox.
2. Sistemas de detección de luz que pueden utilizar amplificación, por ejemplo, mediante un fotodiodo , un tubo fotomultiplicador o un dispositivo de carga acoplada refrigerado .
3. Sustratos marcados con radioisótopos, como los que se utilizan en radioinmunoensayos y ensayos de diálisis de equilibrio, y que pueden detectarse mediante amplificación en contadores gamma o placas de rayos X , o en fosfoimágenes.
4. Ensayos de reacción en cadena de la polimerasa que amplifican una secuencia diana de ADN (o ARN) en lugar de la señal.
5. Métodos combinados Los ensayos pueden utilizar una combinación de los métodos anteriores y otros métodos de amplificación para mejorar la sensibilidad. Por ejemplo, el inmunoensayo ligado a enzimas o EIA, ensayo inmunoenzimático .

Dependiendo de la naturaleza del sistema de detección, los ensayos pueden basarse en:

1. Recuento de colonias o colonias virtuales : por ejemplo, mediante la multiplicación de bacterias o la proliferación de células.
2. Fotometría / espectrofotometría: Consiste en medir la absorbancia de una longitud de onda específica de luz al pasar a través de una cubeta con una muestra líquida a una distancia fija, y compararla con una muestra en blanco y con patrones que contienen cantidades graduadas del compuesto objetivo. Si la luz emitida es de una longitud de onda visible específica, se denomina colorimetría ; o bien, puede implicar el uso de una longitud de onda específica, por ejemplo, mediante un láser , y la emisión de señales fluorescentes de otra longitud de onda específica, que se detectan mediante filtros ópticos de longitud de onda muy específica.
3. La transmitancia de la luz puede utilizarse para medir, por ejemplo, la desaparición de la opacidad de un líquido causada por partículas en suspensión debido a la disminución del número de grumos durante una reacción de aglutinación plaquetaria .
4. La turbidimetría consiste en medir la opacidad de la luz transmitida directamente a través de una muestra líquida mediante detectores colocados perpendicularmente a la fuente de luz.
5. La nefelometría utiliza la medición de la cantidad de dispersión de luz que se produce cuando un haz de luz atraviesa la solución para determinar el tamaño, la concentración y/o la distribución del tamaño de las partículas en la muestra. ^{[ 8 ]}
6. Reflectometría: Proceso mediante el cual se evalúa el color de la luz reflejada por una muestra o reactivo (generalmente seco), por ejemplo, las lecturas automatizadas de las tiras reactivas para análisis de orina.
7. Mediciones viscoelásticas, por ejemplo, viscometría, elastografía (por ejemplo, tromboelastografía ).
8. Ensayos de recuento: por ejemplo, contadores de células o partículas mediante citometría de flujo óptica, o contadores de células basados ​​en el principio de Coulter /impedancia.
9. Ensayos de imagen que implican análisis de imágenes manual o mediante software:
   1. Citometría : Proceso mediante el cual un procesador de imágenes evalúa las estadísticas del tamaño de las células.
10. La detección eléctrica, por ejemplo, mediante amperometría , voltametría o culombimetría, puede utilizarse directa o indirectamente para muchos tipos de mediciones cuantitativas.
11. Otros ensayos basados ​​en propiedades físicas pueden utilizar
    1. Osmómetro
    2. Viscosímetro
    3. Electrodos selectivos de iones
    4. Pruebas sindrómicas

Los ensayos para estudiar las interacciones de las proteínas con el ADN incluyen:

• ATAC-seq
• Inmunoprecipitación de cromatina
  • ChIP-exo
  • ChIP-on-chip
  • ChIP-seq
  • CORTE Y FUGA
  • CORTAR Y ETIQUETAR
• Captura de la conformación cromosómica
  • ChIA-PET (también inmunoprecipitación de cromatina)
  • HiChIP (también inmunoprecipitación de cromatina)
  • Hi-C
• DamID
• Ensayo de huella de ADNasa
• Secuenciación de ADN
• Secuencia FAIRE
• Ensayo de unión al filtro
• ensayo de desplazamiento de gel
• MNasa-seq

• Ensayo de ácido bicinchonínico (ensayo BCA)
• Ensayo de proteínas de Bradford
• Ensayo de proteínas de Lowry ^{[ 9 ]}
• Ensayo de secreción

• Inmunoprecipitación
  • CLIP-seq
  • RIP-ChIP
• secuencias nucleares incompletas (GRO-seq/cap, PRO-seq/cap, CoPRO, ChRO-seq)
• Análisis de ribosomas (Ribo-seq)

Un ensayo de recuento celular puede determinar el número de células vivas, el número de células muertas o la proporción de un tipo de célula con respecto a otro, como por ejemplo, la enumeración y tipificación de glóbulos rojos frente a diferentes tipos de glóbulos blancos . Esto se mide mediante diversos métodos físicos (transmisión de luz, cambio de corriente eléctrica). Otros métodos utilizan análisis bioquímicos de la estructura o fisiología celular (tinciones). Otra aplicación es el seguimiento de cultivos celulares ( ensayos de proliferación o citotoxicidad celular ). Un ensayo de citotoxicidad mide la toxicidad de un compuesto químico para las células.

• Ensayo MTT
• Kit de recuento celular-8 (ensayo de viabilidad celular basado en WST-8)
• Ensayo de SRB ( sulforodamina B )
• Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo®
• Instrumentos y métodos de recuento celular: tecnología de recuento celular CASY , contador Coulter , detección de impedancia eléctrica célula-sustrato.
• Ensayos de viabilidad celular : método de resazurina , prueba de ATP , ensayo de homodímero de etidio (detección de células muertas o moribundas), análisis bacteriológico del agua , ensayos clonogénicos , ...

• Bisfenol F
• Pruebas de toxicidad acuática

• Un ensayo MBAS detecta la presencia de tensioactivos aniónicos en el agua mediante una reacción de coloración azulada.

Se han desarrollado numerosos ensayos celulares para evaluar parámetros específicos o la respuesta de las células ( biomarcadores , fisiología celular). Las técnicas utilizadas para estudiar las células incluyen  :

• Ensayos de reportero utilizando, por ejemplo, luciferasa , ensayos de señalización de calcio utilizando coelenterazina , CFSE o calceína.
• Inmunotinción de células en portaobjetos mediante microscopía ( inmunohistoquímica o fluorescencia ), en microplacas mediante fotometría, incluyendo ELISpot (y su variante FluoroSpot ) para cuantificar células B o células antígeno-específicas, y en solución mediante citometría de flujo.
• Técnicas de biología molecular como microarrays de ADN , hibridación in situ , combinadas con PCR , genómica computacional y transfección ; fraccionamiento celular o inmunoprecipitación.
• Ensayos de migración , ensayo de quimiotaxis
• ensayos de secreción
• Ensayos de apoptosis como el ensayo de fragmentación del ADN , el ensayo de Nicoletti , los ensayos de actividad de caspasas y la tinción con anexina V.
• El ensayo de quimiosensibilidad mide la cantidad de células tumorales que mueren a causa de un fármaco contra el cáncer.
• El ensayo de tetrámeros detecta la presencia de células T específicas de antígeno.
• Ensayo de protección con gentamicina , ensayo de supervivencia o ensayo de invasión para evaluar la capacidad de los patógenos (bacterias) para invadir células eucariotas.
• Ensayo de metástasis
• Enhancer-FACS-seq , la técnica que utiliza un proceso de clasificación celular antes de la secuenciación del ADN.

• Ensayo de petróleo crudo

El ensayo de titulación viral basado en HPCE utiliza un sistema patentado de electroforesis capilar de alto rendimiento para determinar el título de baculovirus .

El ensayo Trofile se utiliza para determinar el tropismo del VIH .

El ensayo de placa viral sirve para calcular la cantidad de virus presentes en una muestra. En esta técnica, se cuenta el número de placas virales formadas por un inóculo viral, a partir del cual se puede determinar la concentración real del virus.

Mediante la técnica ELISA se puede detectar una amplia gama de secreciones celulares (por ejemplo, un anticuerpo o una citocina específicos) . El número de células que secretan esas sustancias particulares se puede determinar mediante una técnica relacionada, el ensayo ELISPOT .

• Pruebas para detectar drogas ilegales
• Ensayo de unión de radioligandos

Las bases de datos de bioactividad correlacionan estructuras u otra información química con los resultados de bioactividad obtenidos de bioensayos en la literatura, patentes y programas de cribado.

Las bases de datos de protocolos correlacionan los resultados de los bioensayos con sus metadatos sobre las condiciones experimentales y los diseños de los protocolos.