Citogenética

Los cromosomas fueron observados por primera vez en células vegetales por Carl Nägeli en 1842. Su comportamiento en células animales ( de salamandra ) fue descrito por Walther Flemming , descubridor de la mitosis , en 1882. El nombre fue acuñado por otro anatomista alemán, von Waldeyer , en 1888.

La siguiente etapa tuvo lugar después del desarrollo de la genética a principios del siglo XX, cuando se apreció que el conjunto de cromosomas (el cariotipo ) era el portador de los genes. Levitsky parece haber sido el primero en definir el cariotipo como la apariencia fenotípica de los cromosomas somáticos , en contraste con su contenido genético . ^{[ 2 ] [ 3 ]} La investigación sobre el cariotipo humano llevó muchos años para resolver la pregunta más básica: ¿cuántos cromosomas contiene una célula humana diploide normal? ^{[ 4 ]} En 1912, Hans von Winiwarter informó 47 cromosomas en las espermatogonias y 48 en las oogonias , concluyendo un mecanismo de determinación del sexo XX/XO . ^{[ 5 ]} En 1922, Painter no estaba seguro de si el número diploide de los humanos era 46 o 48, inclinándose inicialmente por 46. ^{[ 6 ]} Posteriormente revisó su opinión de 46 a 48, e insistió correctamente en que los humanos tienen un sistema de determinación del sexo XX/XY . ^{[ 7 ]} Considerando sus técnicas, estos resultados fueron bastante notables. En los libros de ciencia, el número de cromosomas humanos se mantuvo en 48 durante más de treinta años. Se necesitaban nuevas técnicas para corregir este error. Joe Hin Tjio, que trabajaba en el laboratorio de Albert Levan ^{, [ 8 ] [ 9 ]} fue el responsable de encontrar el enfoque:

1. Utilizando células en cultivo
2. Pretratar las células en una solución hipotónica , lo que las hincha y dispersa los cromosomas.
3. Detención de la mitosis en metafase mediante una solución de colchicina.
4. Al aplastar la preparación sobre el portaobjetos, se fuerza a los cromosomas a alinearse en un solo plano.
5. Recortar una microfotografía y ordenar el resultado para formar un cariograma indiscutible.

No fue hasta 1956 que se aceptó generalmente que el cariotipo del hombre incluía solo 46 cromosomas. ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]} Los grandes simios tienen 48 cromosomas. El cromosoma 2 humano se formó por la fusión de cromosomas ancestrales, lo que redujo el número. ^{[ 13 ]}

Barbara McClintock comenzó su carrera como citogenetista del maíz . En 1931, McClintock y Harriet Creighton demostraron que la recombinación citológica de cromosomas marcados se correlacionaba con la recombinación de rasgos genéticos ( genes ). McClintock, mientras estaba en la Institución Carnegie , continuó estudios previos sobre los mecanismos de rotura y fusión cromosómica en el maíz. Identificó un evento particular de rotura cromosómica que siempre ocurría en el mismo locus del cromosoma 9 del maíz, al que denominó locus " Ds" o de "disociación". ^{[ 14 ]} McClintock continuó su carrera en citogenética estudiando la mecánica y la herencia de los cromosomas rotos y circulares del maíz. Durante su trabajo citogenético, McClintock descubrió los transposones , un hallazgo que finalmente la llevó al Premio Nobel en 1983.

En la década de 1930, Dobzhansky y sus colaboradores recolectaron Drosophila pseudoobscura y D.  persimilis de poblaciones silvestres en California y estados vecinos. Utilizando la técnica de Painter ^{[ 15 ]} , estudiaron los cromosomas politénicos y descubrieron que las poblaciones silvestres presentaban polimorfismo en cuanto a inversiones cromosómicas . Todas las moscas tienen una apariencia similar, independientemente de las inversiones que presenten: este es un ejemplo de polimorfismo críptico.

Rápidamente se acumularon pruebas que demostraban que la selección natural era la responsable. Utilizando un método inventado por L'Héritier y Teissier, Dobzhansky crió poblaciones en jaulas de población , lo que permitió la alimentación, la cría y el muestreo, evitando al mismo tiempo el escape. Esto tuvo la ventaja de eliminar la migración como posible explicación de los resultados. Las poblaciones que contienen inversiones con una frecuencia inicial conocida pueden mantenerse en condiciones controladas. Se descubrió que los distintos tipos de cromosomas no fluctúan al azar, como ocurriría si fueran selectivamente neutros, sino que se ajustan a ciertas frecuencias en las que se estabilizan. Para cuando Dobzhansky publicó la tercera edición de su libro en 1951 ^{[ 16 ],} estaba convencido de que los morfos cromosómicos se mantenían en la población por la ventaja selectiva de los heterocigotos, como ocurre con la mayoría de los polimorfismos . ^{[ 17 ] [ 18 ]}

El lirio es un organismo predilecto para el estudio citológico de la meiosis, ya que sus cromosomas son grandes y cada etapa morfológica de la meiosis se puede identificar fácilmente al microscopio. Hotta, Chandley et al. ^{[ 19 ]} presentaron evidencia de un patrón común de cortes de ADN y síntesis de reparación en células meióticas masculinas de lirios y roedores durante las etapas de zigoteno-paquiteno de la meiosis, cuando se presume que ocurre el entrecruzamiento. La presencia de un patrón común entre organismos tan distantes filogenéticamente como el lirio y el ratón llevó a los autores a concluir que la organización del entrecruzamiento meiótico, al menos en eucariotas superiores, probablemente tiene una distribución universal.

A finales de la década de 1960, Torbjörn Caspersson desarrolló una técnica de tinción fluorescente con quinacrina (bandeo Q) que reveló patrones de bandas únicos para cada par de cromosomas. Esto permitió diferenciar pares de cromosomas de tamaño similar mediante patrones de bandas horizontales distintos. Los patrones de bandas se utilizan actualmente para dilucidar los puntos de ruptura y los cromosomas constituyentes implicados en las translocaciones cromosómicas . Las deleciones e inversiones dentro de un cromosoma individual también pueden identificarse y describirse con mayor precisión mediante una nomenclatura de bandas estandarizada. El bandeo G (que utiliza tripsina y tinción de Giemsa/Wright) se desarrolló simultáneamente a principios de la década de 1970 y permite visualizar los patrones de bandas mediante un microscopio de campo claro.

Los diagramas que identifican los cromosomas según sus patrones de bandas se conocen como idiogramas . Estos mapas se convirtieron en la base para que tanto la citogenética como la oncología se integraran rápidamente en el laboratorio clínico, donde el cariotipado permitió a los científicos detectar alteraciones cromosómicas. Posteriormente, se ampliaron las técnicas para permitir el cultivo de amniocitos libres recuperados del líquido amniótico y el desarrollo de técnicas de elongación para todo tipo de cultivos, lo que posibilita una mayor resolución en el análisis de bandas.

En la década de 1980, se produjeron avances en la citogenética molecular . Si bien las sondas marcadas con radioisótopos se habían hibridado con ADN desde 1969, se empezó a utilizar sondas marcadas con fluorescencia. La hibridación de estas sondas a preparaciones cromosómicas mediante técnicas existentes se conoció como hibridación fluorescente in situ (FISH). ^{[ 22 ]} Este cambio aumentó significativamente el uso de técnicas de hibridación, ya que las sondas marcadas con fluorescencia son más seguras. Los avances posteriores en la micromanipulación y el examen de cromosomas dieron lugar a la técnica de microdisección cromosómica, mediante la cual se podían aislar, clonar y estudiar con mayor detalle las aberraciones en la estructura cromosómica.

El análisis cromosómico rutinario ( cariotipado ) consiste en el análisis de cromosomas metafásicos marcados con tripsina seguida de tinción con Giemsa , tinción de Leishmann o una combinación de ambas. Esto genera patrones de bandas únicos en los cromosomas. Se desconoce el mecanismo molecular y la razón de estos patrones, aunque probablemente estén relacionados con la sincronización de la replicación y el empaquetamiento de la cromatina.

En los laboratorios de citogenética se utilizan varias técnicas de bandeo cromosómico. El bandeo con quinacrina (bandeo Q) fue el primer método de tinción utilizado para producir patrones de bandeo específicos. Este método requiere un microscopio de fluorescencia y ya no se utiliza tan ampliamente como el bandeo de Giemsa (bandeo G). El bandeo inverso, o bandeo R, requiere tratamiento térmico e invierte el patrón habitual en blanco y negro que se observa en los bandeos G y Q. Este método es particularmente útil para teñir los extremos distales de los cromosomas. Otras técnicas de tinción incluyen el bandeo C y las tinciones de la región organizadora nucleolar (tinciones NOR  ). Estos últimos métodos tiñen específicamente ciertas porciones del cromosoma. El bandeo C tiñe la heterocromatina constitutiva , que generalmente se encuentra cerca del centrómero, y la tinción NOR  resalta los satélites y los tallos de los cromosomas acrocéntricos .

El bandeo de alta resolución implica la tinción de los cromosomas durante la profase o la metafase temprana (prometafase), antes de que alcancen su máxima condensación. Debido a que los cromosomas en profase y prometafase están más extendidos que los cromosomas en metafase, el número de bandas observables para todos los cromosomas ( bandas por conjunto haploide , bph; "nivel de bandas") aumenta de aproximadamente 300 a 450 hasta 800. Esto permite la detección de anomalías menos evidentes que normalmente no se observan con el bandeo convencional. ^{[ 23 ]}

La hibridación fluorescente in situ (FISH, por sus siglas en inglés) se refiere al uso de una sonda marcada con fluorescencia para hibridar con preparaciones celulares citogenéticas.

Además de las preparaciones estándar, la técnica FISH también se puede realizar en:

• frotis de médula ósea
• frotis de sangre
• preparaciones de tejido incluidas en parafina
• muestras de tejido disociadas enzimáticamente
• médula ósea no cultivada
• amniocitos no cultivados
• Preparaciones de citocentrifugación