Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Microscopía crioelectrónica

Titán Krios en la Universidad de Leeds La microscopía electrónica criogénica ( crio-EM ) es una técnica de microscopía electrónica de transmisión aplicada a muestras enfriadas a...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita
Titán Krios en la Universidad de Leeds

La microscopía electrónica criogénica ( crio-EM ) es una técnica de microscopía electrónica de transmisión aplicada a muestras enfriadas a temperaturas criogénicas . Desarrollada en la década de 1970, los avances en la tecnología de detectores y el software permiten obtener imágenes de estructuras biomoleculares con resolución casi atómica. [ 1 ] Este método se ha convertido en una alternativa popular a la cristalografía de rayos X o la espectroscopia de RMN en biología estructural . [ 2 ]

Al escanear muestras biológicas, la estructura de la muestra se preserva incrustándolas en hielo vítreo . Se aplica una solución acuosa de la muestra a una rejilla y se congela por inmersión en etano líquido o en una mezcla de etano y propano líquidos . [ 3 ]

El Premio Nobel de Química de 2017 fue otorgado a Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson "por desarrollar la criomicroscopía electrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución". [ 4 ] Nature Methods también nombró a la crio-EM como el "Método del Año" en 2015. [ 5 ]

Historia

Desarrollo temprano

En la década de 1960, la microscopía electrónica de transmisión de muestras biológicas se vio limitada por el daño causado por la radiación de los haces de electrones de alta energía. Los científicos plantearon la hipótesis de que examinar las muestras a bajas temperaturas reduciría el daño por radiación inducido por el haz. [ 6 ] Tanto el helio líquido (−269 °C o 4 K o −452 °F ) como el nitrógeno líquido (−195,79 °C o 77 K o −320 °F) se consideraron criógenos, [ 7 ] sin embargo, nunca se logró una alta estabilidad. En 1980, Erwin Knapek y Jacques Dubochet publicaron comentarios sobre el daño por haz a temperaturas criogénicas, compartiendo observaciones que:      

Se descubrió que los cristales delgados montados sobre una película de carbono eran entre 30 y 300 veces más resistentes al haz a 4  K que a temperatura ambiente... La mayoría de nuestros resultados pueden explicarse asumiendo que la crioprotección en la región de 4  K depende en gran medida de la temperatura. [ 8 ]

Sin embargo, estos resultados no se reprodujeron. Dos años después se publicaron enmiendas, [ 9 ] junto con un comentario en Nature , [ 10 ] indicando que la resistencia del haz era menos significativa de lo previsto. La protección obtenida a 4  K fue más cercana a "diez veces mayor para muestras estándar de L- valina " que lo que se había afirmado anteriormente. [ 10 ] Si bien las muestras de crio-EM se recolectan rutinariamente a temperaturas de nitrógeno líquido, [ 11 ] se ha continuado trabajando para comprender el comportamiento de las muestras a temperaturas de helio líquido. [ 12 ] [ 13 ] [ 11 ]

En 1981, científicos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular informaron del primer criomicroscopía electrónica exitoso. [ 14 ] Los investigadores rociaron agua pura sobre una película de carbono hidrofílica que se sumergió rápidamente en criógeno (propano líquido o etano líquido enfriado a 77  K). La fina capa de hielo amorfo formada en la película tenía menos de 1  μm de espesor y un patrón de difracción de electrones confirmó la presencia de hielo amorfo/vítreo. En 1984, el grupo demostró el potencial de la criomicroscopía electrónica en biología estructural mediante el análisis de adenovirus tipo 2 vitrificado , bacteriófago T4 , virus del bosque de Semliki , bacteriófago CbK y virus de la estomatitis vesicular . [ 15 ] El artículo marcó el origen de la criomicroscopía electrónica, y la técnica se ha convertido en una práctica habitual en laboratorios de todo el mundo.

La energía de los electrones utilizados para la obtención de imágenes (80–300 kV) puede romper enlaces covalentes en muestras orgánicas y biológicas. [ 16 ] La obtención de imágenes de muestras biológicas requiere minimizar la exposición a los electrones. Las bajas exposiciones requieren que se seleccionen, alineen y promedien imágenes de miles o millones de moléculas congeladas para obtener mapas de alta resolución, utilizando software especializado. La introducción en 2012 de detectores de electrones directos y mejores algoritmos computacionales mejoró significativamente las características estructurales. [ 17 ]

avances recientes

Los detectores de electrones directos y los algoritmos de imagen más potentes permiten determinar estructuras macromoleculares con una resolución casi atómica. [ 18 ] Las macromoléculas visualizadas incluyen virus , ribosomas , mitocondrias , canales iónicos y complejos enzimáticos . A partir de 2018, la crio-EM se pudo aplicar a estructuras tan pequeñas como la hemoglobina (64 kDa ) [ 19 ] con resoluciones de hasta 1,8 Å . [ 20 ] En 2019, las estructuras de crio-EM crecieron hasta el 2,5 % de las estructuras depositadas en el Protein Data Bank . [ 21 ] [ 22 ] La crio-EM se puede utilizar para la criotomografía electrónica (crio-ET), creando reconstrucciones 3D de muestras a partir de imágenes 2D inclinadas. 

La década de 2010 vio avances drásticos en las cámaras electrónicas, incluyendo detectores de electrones directos, causando una "revolución de la resolución" [ 23 ] empujando la barrera de resolución por debajo del límite crucial de ~2-3  Å para resolver la posición y orientación de los aminoácidos. [ 24 ]

Richard Henderson ( Laboratorio de Biología Molecular del MRC , Cambridge, Reino Unido) formó un consorcio con ingenieros del Laboratorio Rutherford Appleton y científicos de la Sociedad Max Planck para financiar y desarrollar un primer prototipo. Posteriormente, el consorcio se asoció con el fabricante de microscopios electrónicos FEI para lanzar y comercializar el nuevo diseño. Casi al mismo tiempo, Gatan Inc., de Pleasanton, California, presentó un detector similar diseñado por Peter Denes ( Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley ) y David Agard ( Universidad de California, San Francisco ). Un tercer tipo de cámara fue desarrollado por Nguyen-Huu Xuong en la empresa Direct Electron ( San Diego, California ). [ 23 ]

Los avances recientes en andamios de imagen basados ​​en proteínas ayudan con el sesgo de orientación de la muestra y el límite de tamaño. Aunque el tamaño mínimo para crio-EM sigue sin determinarse, las proteínas más pequeñas que ~50  kDa generalmente tienen una relación señal-ruido (SNR) demasiado baja para resolver partículas de proteína, lo que hace que la reconstrucción 3D sea difícil o imposible. [ 25 ] [ 26 ] Se han informado múltiples técnicas para mejorar la SNR al determinar las estructuras de proteínas pequeñas. [ 27 ] [ 28 ] Basados ​​en DARPins de alta afinidad , nanobodies , fragmentos de anticuerpos , [ 29 ] estos métodos se unen rígidamente a la proteína objetivo y, por lo tanto, aumentan el tamaño efectivo de la partícula e introducen simetría para mejorar la SNR para la reconstrucción del mapa de crio-EM. Una ventaja de la crio-EM sobre la cristalización es que requiere mucho menos material de muestra. Esto hace que sea más fácil determinar las estructuras de proteínas que no se pueden aislar con alto rendimiento.

Premio Nobel de Química 2017

En reconocimiento al impacto que la crio-EM ha tenido en la bioquímica, tres científicos, Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson, fueron galardonados con el Premio Nobel de Química "por desarrollar la crio-microscopía electrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución". [ 4 ]

Técnicas

Modo de microscopía electrónica

Microscopía electrónica de transmisión criogénica

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) es una variante de la microscopía electrónica de transmisión en la que las muestras se enfrían hasta -196 grados Celsius para preservar la estructura nativa del compuesto. Esto permite un análisis de la estructura de las proteínas a nivel casi atómico [ 30 ] . Coloquialmente, el término "microscopía electrónica criogénica" o su abreviatura "crio-EM" se refiere por defecto a la microscopía electrónica de transmisión criogénica, ya que la gran mayoría de las crio-EM se realizan en microscopios electrónicos de transmisión, en lugar de microscopios electrónicos de barrido [ 31 ] .

Criomicroscopía electrónica de transmisión (Cryo-TEM) y crio-ET correlativas.

En 2019, se utilizaron criomicroscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) y crio-ET correlativas para observar nanotubos de túnel (TNT) en células neuronales. [ 32 ]

Criomicroscopía electrónica de barrido

La criomicroscopía electrónica de barrido (crio-SEM) es una técnica de microscopía electrónica de barrido . Las muestras se congelan con nitrógeno líquido o etano líquido, minimizando así cualquier daño causado por la formación de cristales de hielo y el efecto Leidenfrost , y maximizando la retención de agua. Las muestras se mantienen al vacío o en un gas inerte para evitar la rápida formación de cristales inducida por la exposición atmosférica. En este paso, las muestras pueden romperse y sublimarse para permitir el escaneo de estructuras internas. Dado que las muestras congeladas no son conductoras, se suelen recubrir con una fina capa de metal conductor para reducir el daño causado por el haz y mejorar la resolución de la imagen. A continuación, las muestras se colocan dentro del microscopio electrónico de barrido para su escaneo. [ 33 ]

Técnica de uso y análisis de datos

Criotomografía electrónica

En la criotomografía electrónica (crio-ET), se toman muchas imágenes de una muestra desde diferentes ángulos utilizando un mecanismo de inclinación. Las imágenes se combinan para crear un modelo 3D (mapa) con  una resolución de ~1–4 nm. [ 34 ]

Análisis de partículas individuales

Flujo de trabajo de análisis de partículas individuales

El análisis de partículas individuales (SPA) es el método típico para obtener  modelos de biomoléculas con resolución casi atómica (<1 nm). En SPA, se busca en una amplia colección de imágenes de crio-EM copias de la molécula objetivo. Estas copias se clasifican en "clases", que son agrupaciones según la orientación de la partícula. A cada clase y sus partículas se les asigna una posición relativa dentro de la molécula original. Entre los programas utilizados para este proceso se encuentran RELION [ 35 ] y CryoSPARC [ 36 ] . La principal innovación con respecto a la crio-ET es la combinación de imágenes de objetos similares para alcanzar resoluciones más altas [ 37 ] .

Cuando se combina con el conocimiento de la progresión temporal, el resultado es la criomicroscopía electrónica de transmisión resuelta en el tiempo para capturar la cinética de los cambios estructurales en macromoléculas biológicas. [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]

Comparaciones con la cristalografía de rayos X

Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X ha sido la técnica más popular para determinar las estructuras 3D de las moléculas biológicas. [ 41 ] Sin embargo, las mejoras mencionadas en la crio-EM han aumentado su popularidad como herramienta para examinar los detalles de las moléculas biológicas. Desde 2010, los depósitos anuales de estructuras de crio-EM han superado a los de la cristalografía de rayos X. [ 42 ] Aunque la cristalografía de rayos X tiene depósitos totales drásticamente mayores debido a una historia más larga, se proyecta que los depósitos totales de ambos métodos se superen alrededor de 2035. [ 42 ]

La resolución de la cristalografía de rayos X está limitada por la homogeneidad del cristal, [ 43 ] y lograr que las moléculas biológicas con condiciones de cristalización ideales desconocidas alcancen un estado cristalino puede ser muy laborioso, llegando en casos extremos a tomar meses o incluso años. [ 44 ] Por el contrario, la preparación de muestras en crio-EM puede requerir varias rondas de selección y optimización para superar problemas como la agregación de proteínas y las orientaciones preferidas, [ 45 ] [ 46 ] pero no requiere que la muestra forme un cristal, sino que las muestras para crio-EM se congelan rápidamente y se examinan en sus estados casi nativos. [ 47 ]

Según Proteopedia , la resolución media alcanzada por la cristalografía de rayos X (a fecha de 19 de mayo de 2019) en el Protein Data Bank es de 2,05 Å , [ 43 ] y la resolución más alta alcanzada registrada (a fecha de 30 de septiembre de 2022) es de 0,48 Å. [ 48 ] A fecha de 2020, la mayoría de las estructuras proteicas determinadas por crio-EM ( análisis de partícula única ) tienen una resolución inferior de 3-4 Å. [ 49 ] Sin embargo, a fecha de 2020, la mejor resolución de crio-EM se ha registrado en 1,22 Å, [ 46 ] lo que la convierte en una competidora en resolución en algunos casos. 

Cristalografía electrónica

De forma similar a la cristalografía de rayos X, utilizada para determinar la estructura cristalina de moléculas de diferentes tamaños (desde moléculas pequeñas hasta grandes complejos biomoleculares) mediante el patrón de difracción de rayos X, los electrones también pueden producir un patrón de difracción electrónica a partir de un cristal. El trabajo en esta área tiene una larga historia que se remonta a los primeros trabajos, como la determinación de las posiciones de los átomos de hidrógeno en cristales de NH₄Cl por W. E. Laschkarew e I. D. Usykin en 1933. [ 50 ]

La crio-EC se suele realizar con cristales 3D, pero también se ha utilizado en el análisis de cristales bidimensionales y en el análisis de filamentos o tubos helicoidales.

La difracción de electrones en microcristales (MicroED) es una variante de la cristalografía electrónica que trabaja con cristales mil millones de veces más pequeños que los que requiere la difracción de rayos X. Se ha utilizado para determinar la estructura de biomoléculas grandes (proteínas, ácidos nucleicos y sus complejos). [ 51 ] También resulta muy útil para estudiar moléculas pequeñas, desde péptidos hasta compuestos más simples. [ 52 ]

Manipulación de muestras para obtención de imágenes

(Esta sección no se aplica a la cristalografía electrónica).

Muestras biológicas

Película delgada

El material biológico se extiende sobre una rejilla de microscopía electrónica y se conserva en estado criohidratado mediante congelación rápida, generalmente en etano líquido a una temperatura cercana a la del nitrógeno líquido. Al mantener las muestras a la temperatura del nitrógeno líquido o inferior, se pueden introducir en el alto vacío de la columna del microscopio electrónico . La mayoría de las muestras biológicas son extremadamente radiosensibles , por lo que deben analizarse con técnicas de baja dosis (la baja temperatura de la criomicroscopía electrónica de transmisión proporciona un factor de protección adicional contra el daño por radiación).

En consecuencia, las imágenes presentan un ruido extremo . Para algunos sistemas biológicos, es posible promediar las imágenes para aumentar la relación señal-ruido y obtener información de alta resolución sobre la muestra mediante la técnica conocida como análisis de partícula única . Este enfoque generalmente requiere que los elementos que se promedian sean idénticos, aunque ahora se puede estudiar cierta heterogeneidad conformacional limitada (por ejemplo, en el ribosoma ). Se han logrado reconstrucciones tridimensionales a partir de imágenes de criomicroscopía electrónica de transmisión (CryoTEM) de complejos proteicos y virus con resolución subnanométrica o casi atómica, lo que permite obtener nuevos conocimientos sobre la estructura y la biología de estos grandes ensamblajes.

El análisis de estructuras ordenadas de proteínas, como cristales bidimensionales de proteínas transmembrana o estructuras helicoidales de proteínas, también permite un tipo de promedio que proporciona información de alta resolución sobre la muestra. Esta técnica se denomina cristalografía electrónica.

Secciones vítreas

The thin film method is limited to thin specimens (typically < 500 nm) because the electrons cannot cross thicker samples without multiple scattering events. Thicker specimens can be vitrified by plunge freezing (cryofixation) in ethane (up to tens of μm in thickness) or more commonly by high pressure freezing (up to hundreds of μm). They can then be cut in thin sections (40 to 200 nm thick) with a diamond knife in a cryoultramicrotome at temperatures lower than −135 °C (devitrification temperature). The sections are collected on an electron microscope grid and are imaged in the same manner as specimen vitrified in thin film. This technique is called transmission electron cryomicroscopy of vitreous sections (CEMOVIS) or transmission electron cryomicroscopy of frozen-hydrated sections.

Material specimens

In addition to allowing vitrified biological samples to be imaged, cryoTEM can also be used to image material specimens that are too volatile in vacuum to image using standard, room temperature electron microscopy. For example, vitrified sections of liquid-solid interfaces can be extracted for analysis by cryoTEM,[53] and sulfur, which is prone to sublimation in the vacuum of electron microscopes, can be stabilized and imaged in cryoTEM.[54]

Image processing in cryo-TEM

Even though in the majority of approaches in electron microscopy one tries to get the best resolution image of the material, it is not always the case in cryo-TEM. Besides all the benefits of high resolution images, the signal to noise ratio remains the main hurdle that prevents assigning orientation to each particle. For example, in macromolecule complexes, there are several different structures that are being projected from 3D to 2D during imaging and if they are not distinguished the result of image processing will be a blur. That is why the probabilistic approaches become more powerful in this type of investigation.[55] There are two popular approaches that are widely used nowadays in cryo-EM image processing, the maximum likelihood approach that was discovered in 1998[56] and relatively recently adapted Bayesian approach.[57]

El método de estimación de máxima verosimilitud proviene de la estadística. En este método, se suman todas las orientaciones posibles de las partículas para obtener la distribución de probabilidad resultante. Podemos compararlo con una estimación típica de mínimos cuadrados, donde las partículas obtienen orientaciones exactas por imagen. [ 58 ] De esta manera, las partículas de la muestra obtienen orientaciones "aproximadas" después de los cálculos, ponderadas por las probabilidades correspondientes. Todo el proceso es iterativo y, con cada iteración, el modelo mejora. Las condiciones óptimas para crear un modelo que represente fielmente la estructura real se dan cuando los datos no presentan demasiado ruido y las partículas no tienen una dirección preferencial. La principal desventaja del método de máxima verosimilitud es que el resultado depende de la estimación inicial y la optimización del modelo a veces puede estancarse en un mínimo local. [ 59 ]

El enfoque bayesiano que se utiliza actualmente en la criomicroscopía electrónica de transmisión (crio-TEM) es empírico por naturaleza. Esto significa que la distribución de partículas se basa en el conjunto de datos original. De manera similar, en el método bayesiano habitual existe una probabilidad previa fija que se modifica tras la observación de los datos. La principal diferencia con la estimación de máxima verosimilitud reside en un término de reconstrucción especial que ayuda a suavizar los mapas resultantes y a reducir el ruido durante la reconstrucción. [ 58 ] El suavizado de los mapas se produce al asumir que la probabilidad previa sigue una distribución gaussiana y al analizar los datos en el espacio de Fourier. Dado que se establece la conexión entre el conocimiento previo y el conjunto de datos, se reduce la probabilidad de errores humanos, lo que potencialmente aumenta la objetividad de la reconstrucción de imágenes. [ 57 ]

Con la aparición de nuevos métodos de obtención de imágenes y reconstrucción de imágenes mediante criomicroscopía electrónica de transmisión (crio-TEM), surgen nuevas soluciones de software que ayudan a automatizar el proceso. Tras la implementación del enfoque bayesiano empírico en el programa informático de código abierto RELION (REgularized LIkelihood OptimizatioN) para la reconstrucción 3D, [ 60 ] [ 61 ] el programa se popularizó en el campo de la crio-TEM. Ofrece una gama de correcciones que mejoran la resolución de las imágenes reconstruidas, permite implementar scripts versátiles utilizando el lenguaje Python y ejecuta las tareas habituales de clasificación de modelos 2D/3D o creación de modelos de novo . [ 62 ] [ 63 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Cheng Y, Grigorieff N, Penczek PA, Walz T (abril de 2015). "Una introducción a la criomicroscopía electrónica de partícula única" . Cell . 161 ( 3): 438– 449. Bibcode : 2015Cell..161..438C . doi : 10.1016/j.cell.2015.03.050 . PMC 4409659. PMID 25910204 .  
  2. ↑ Stoddart C (1 de marzo de 2022). "Biología estructural: cómo las proteínas obtuvieron su primer plano" . Knowable Magazine . doi : 10.1146/knowable-022822-1 . S2CID 247206999. Consultado el 25 de marzo de 2022 . 
  3. ↑ Tivol WF, Briegel A, Jensen GJ (octubre de 2008). "Un criógeno mejorado para la congelación por inmersión" . Microscopía y Microanálisis . 14 (5): 375– 379. Bibcode : 2008MiMic..14..375T . doi : 10.1017/S1431927608080781 . PMC 3058946. PMID 18793481 .  
  4. 1 2 "El Premio Nobel de Química 2017" . NobelPrize.org . Consultado el 30 de septiembre de 2022 .
  5. ↑ Doerr A (enero de 2017). "Tomografía crioelectrónica". Nature Methods . 14 (1): 34. doi : 10.1038/nmeth.4115 . ISSN 1548-7091 . S2CID 27162203 .  
  6. ↑ Dubochet J, Knapek E (abril de 2018). " Altibajos en la criomicroscopía electrónica temprana" . PLOS Biology . 16 (4) e2005550. doi : 10.1371/journal.pbio.2005550 . PMC 5929567. PMID 29672565 .  
  7. ↑ Venables JA (1963). "Plataforma basculante refrigerada con helio líquido para microscopio electrónico". Review of Scientific Instruments . 34 (5): 582– 583. Bibcode : 1963RScI...34..582V . doi : 10.1063/1.1718509 .
  8. ↑ Knapek E, Dubochet J (agosto de 1980). "El daño del haz a los materiales orgánicos se reduce considerablemente en la criomicroscopía electrónica". Journal of Molecular Biology . 141 (2): 147– 161. doi : 10.1016/0022-2836(80)90382-4 . PMID 7441748 . 
  9. ↑ Lepault, J.; Dubochet, J.; Dietrich, I.; Knapek, E.; Zeitler, E. (enero de 1983). "Enmienda a: Daños por haz de electrones en muestras orgánicas a temperatura de helio líquido". Journal of Molecular Biology . 163 (3): 511. doi : 10.1016/0022-2836(83)90073-6 .
  10. 1 2 Newmark P (30 de septiembre de 1982). "Microscopía de criotransmisión: esperanzas desvaneciéndose" . Nature . 299 (5882): 386– 387. Bibcode : 1982Natur.299..386N . doi : 10.1038/299386c0 .
  11. 1 2 Dickerson, JL; Naydenova, K; Peet, MJ; Wilson, H; Nandy, B; McMullan, G; Morrison, R; Russo, CJ (29 de abril de 2025). "Reducción de los efectos del daño por radiación en crio-EM utilizando temperaturas de helio líquido" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 122 (17) e2421538122. Bibcode : 2025PNAS..12221538D . doi : 10.1073/pnas.2421538122 . PMC 12054821. PMID 40261934 .  
  12. ↑ Pfeil-Gardiner, Olivia; Mills, Deryck J.; Vonck, Janet; Kuehlbrandt, Werner (1 de noviembre de 2019). " Un estudio comparativo de crio-EM de partícula única con enfriamiento por nitrógeno líquido y helio líquido" . IUCrJ . 6 (6): 1099– 1105. Bibcode : 2019IUCrJ...6.1099P . doi : 10.1107/S2052252519011503 . PMC 6830223. PMID 31709065 .  
  13. ↑ Dickerson, Joshua L; Russo, Christopher J (25 de julio de 2025). "Una teoría física para la crio-EM a temperaturas de helio líquido". Microscopy and Microanalysis . 31 (Suplemento_1) ozaf048.514. doi : 10.1093/mam/ozaf048.514 .
  14. ↑ Dubochet J, McDowall AW (diciembre de 1981). "Vitrificación de agua pura para microscopía electrónica" . Journal of Microscopy . 124 (3): 3– 4. doi : 10.1111/j.1365-2818.1981.tb02483.x .
  15. ↑ Adrian M, Dubochet J, Lepault J, McDowall AW (marzo de 1984). "Microscopía crioelectrónica de virus" . Nature . 308 (5954): 32–36 . Bibcode : 1984Natur.308...32A . doi : 10.1038 / 308032a0 . PMID 6322001. S2CID 4319199 .  
  16. ↑ Garman, Elspeth F.; Owen, Robin Leslie (1 de enero de 2006). "Criocongelación y daño por radiación en la cristalografía macromolecular" . Acta Crystallographica Sección D Cristalografía Biológica . 62 (1): 32– 47. doi : 10.1107/S0907444905034207 . ISSN 0907-4449 . PMID 16369092 .  
  17. ↑ Callaway E (septiembre de 2015). "La revolución no se cristalizará: un nuevo método recorre la biología estructural" . Nature . 525 (7568): 172–4 . Bibcode : 2015Natur.525..172C . doi : 10.1038/525172a . PMID 26354465 . 
  18. ↑ Murata K, Wolf M (feb. 2018). "Microscopía crioelectrónica para el análisis estructural de macromoléculas biológicas dinámicas" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects . 1862 (2): 324– 334. doi : 10.1016/j.bbagen.2017.07.020 . PMID 28756276 . 
  19. ↑ Khoshouei M, Radjainia M, Baumeister W, Danev R (junio de 2017). "Estructura de la hemoglobina a 3,2 Å determinada mediante crio-EM con la placa de fase Volta" . Nature Communications . 8 16099. Bibcode : 2017NatCo...816099K . doi : 10.1038/ncomms16099 . PMC 5497076. PMID 28665412 .  
  20. ^ Merk A, Bartesaghi A, Banerjee S, Falconieri V, Rao P, Davis MI, Pragani R, Boxer MB, Earl LA, Milne JL, Subramaniam S (junio de 2016). "Romper las barreras de resolución Cryo-EM para facilitar el descubrimiento de fármacos" . Celúla . 165 (7): 1698–1707 . Bibcode : 2016Cell..165.1698M . doi : 10.1016/j.cell.2016.05.040 . PMC 4931924 . PMID 27238019 .  
  21. ↑ "Distribución de datos PDB por método experimental y tipo molecular" . www.rcsb.org . Consultado el 3 de diciembre de 2019 .
  22. ↑ "Estadísticas de PDB: Crecimiento de estructuras a partir de experimentos 3DEM publicados por año" . www.rcsb.org . Consultado el 22 de diciembre de 2018 .
  23. 1 2 Kühlbrandt, Werner (2014-03-28). "La revolución de la resolución" . Science . 343 ( 6178): 1443– 1444. Bibcode : 2014Sci...343.1443K . doi : 10.1126/science.1251652 . ISSN 0036-8075 . PMID 24675944. S2CID 35524447 .   
  24. ↑ Kuster, Daniel J.; Liu, Chengyu; Fang, Zheng; Ponder, Jay W.; Marshall, Garland R. (2015-04-20). " Estructuras cristalinas de alta resolución de hélices proteicas reconciliadas con enlaces de hidrógeno de tres centros y electrostática multipolar" . PLOS ONE . 10 (4) e0123146. Bibcode : 2015PLoSO..1023146K . doi : 10.1371/journal.pone.0123146 . ISSN 1932-6203 . PMC 4403875. PMID 25894612 .   
  25. ↑ Henderson, Richard (mayo de 1995). "El potencial y las limitaciones de los neutrones, electrones y rayos X para la microscopía de resolución atómica de moléculas biológicas sin teñir". Quarterly Reviews of Biophysics . 28 (2): 171– 193. doi : 10.1017/s003358350000305x . PMID 7568675 . 
  26. ↑ Herzik, Mark A.; Wu, Mengyu; Lander, Gabriel C. (2019-03-04). "Determinación de la estructura de alta resolución de complejos sub-100 kDa utilizando crio-EM convencional" . Nature Communications . 10 (1): 1032. Bibcode : 2019NatCo..10.1032H . doi : 10.1038/s41467-019-08991-8 . ISSN 2041-1723 . PMC 6399227. PMID 30833564 .   
  27. ↑ Wentinck, Koen; Gogou, Christos; Meijer, Dimphna H. (2022). "Aumento del peso molecular: Determinación de la estructura de proteínas sub-100-kDa mediante crio-EM" . Current Research in Structural Biology . 4 : 332–337 . doi : 10.1016/j.crstbi.2022.09.005 . PMC 9562432. PMID 36248264 .  
  28. ↑ Gilman, Morgan SA; Skiba, Meredith A. (15 de agosto de 2025). "Joyas ocultas ponen las proteínas en perspectiva". Nature Chemical Biology . 22 (1): 9– 10. doi : 10.1038/s41589-025-01959-4 . PMID 40817134 . 
  29. ↑
  30. ↑ "Microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryoTEM)" . Centro de Microscopía Electrónica . Consultado el 27 de junio de 2026 .
  31. ^ Fatale, Vivek; Famta, Paras; Srinivasarao, Dadi A.; Vambhurkar, Ganesh; Jainista, Naitik; Pandey, Giriraj; Kolipaka, Tejaswini; Khairnar, Pooja; Shah, Saurabh; Singh, Shashi Bala; Raghuvanshi, Rajeev Singh; Srivastava, Saurabh (octubre de 2023). "Nanoterapia basada en membranas de neutrófilos: cambio de paradigma propicio en el tratamiento del cáncer" . Ciencias de la vida . 331 122021. doi : 10.1016/j.lfs.2023.122021 . PMID 37582468 . 
  32. ↑ Sartori-Rupp A, Cordero Cervantes D, Pepe A, Gousset K, Delage E, Corroyer-Dulmont S, et al. (enero de 2019). "La criomicroscopía electrónica correlativa revela la estructura de los TNT en células neuronales" . Nature Communications . 10 (1) 342. Bibcode : 2019NatCo..10..342S . doi : 10.1038/ s41467-018-08178-7 . PMC 6341166. PMID 30664666 .   
  33. ↑ Wightman, Raymond (2022-04-20). "Una visión general de las técnicas de microscopía electrónica de barrido criogénica para la obtención de imágenes de plantas" . Plants . 11 ( 9): 1113. Bibcode : 2022Plnts..11.1113W . doi : 10.3390/plants11091113 . ISSN 2223-7747 . PMC 9106016. PMID 35567113 .   
  34. ↑ Bäuerlein, Felix JB; Baumeister, Wolfgang (2021-10-01). "Hacia la proteómica visual de alta resolución" . Journal of Molecular Biology . De la secuencia de proteínas a la estructura a velocidad de la luz: cómo Alphafold impacta la biología. 433 (20) 167187. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN 0022-2836 . PMID 34384780 .  
  35. ↑ Scheres, Sjors HW (diciembre de 2012). "RELION: Implementación de un enfoque bayesiano para la determinación de la estructura mediante crio-EM" . Journal of Structural Biology . 180 (3): 519– 530. doi : 10.1016/j.jsb.2012.09.006 . PMC 3690530. PMID 23000701 .  
  36. ↑ Punjani, Ali; Rubinstein, John L; Fleet, David J; Brubaker, Marcus A (marzo de 2017). "cryoSPARC: algoritmos para la determinación rápida y no supervisada de la estructura por crio-EM" . Nature Methods . 14 (3): 290–296 . doi : 10.1038/nmeth.4169 . ISSN 1548-7091 . PMID 28165473 .  
  37. ↑ Cheng Y (agosto de 2018). "Criomicroscopía electrónica de partícula única: ¿cómo llegó hasta aquí y hacia dónde irá?" . Science . 361 ( 6405): 876– 880. Bibcode : 2018Sci...361..876C . doi : 10.1126/science.aat4346 . PMC 6460916. PMID 30166484 .  
  38. ↑ Fu Z, Kaledhonkar S, Borg A, Sun M, Chen B, Grassucci RA, Ehrenberg M, Frank J (diciembre de 2016). " Intermediarios clave en el reciclaje de ribosomas visualizados mediante microscopía crioelectrónica resuelta en el tiempo" . Structure . 24 (12): 2092–2101 . doi : 10.1016/j.str.2016.09.014 . PMC 5143168. PMID 27818103 .  
  39. ↑ Feng X, Fu Z, Kaledhonkar S, Jia Y, Shah B, Jin A, Liu Z, Sun M, Chen B, Grassucci RA, Ren Y, Jiang H, Frank J, Lin Q (abril de 2017). "Un método rápido y eficaz de pulverización-inmersión microfluídica para crio-EM de partícula única de alta resolución" . Structure . 25 ( 4): 663–670.e3. doi : 10.1016/j.str.2017.02.005 . PMC 5382802. PMID 28286002 .  
  40. ↑ Chen B, Kaledhonkar S, Sun M, Shen B, Lu Z, Barnard D, Lu TM, Gonzalez RL, Frank J (junio de 2015). " Dinámica estructural de la asociación de subunidades ribosómicas estudiada mediante microscopía electrónica criogénica resuelta en el tiempo con mezcla y pulverización" . Structure . 23 (6): 1097–105 . doi : 10.1016/j.str.2015.04.007 . PMC 4456197. PMID 26004440 .  
  41. ↑ Smyth MS, Martin JH (febrero de 2000). "Cristalografía de rayos X" . Molecular Pathology . 53 (1): 8– 14. doi : 10.1136/mp.53.1.8 . PMC 1186895. PMID 10884915 .  
  42. 1 2 Chiu, Wah; Schmid, Michael F.; Pintilie, Grigore D.; Lawson, Catherine L. (enero de 2021). " Evolución de la estandarización y difusión de estructuras y datos de crio-EM conjuntamente por la comunidad, PDB y EMDB" . Journal of Biological Chemistry . 296 100560. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100560 . ISSN 0021-9258 . PMC 8050867. PMID 33744287 .   
  43. 1 2 "Resolución - Proteopedia, la vida en 3D" . proteopedia.org . Consultado el 27 de octubre de 2020 .
  44. ↑ Callaway E (febrero de 2020). "La crio-EM revolucionaria está conquistando la biología estructural" . Nature . 578 (7794): 201. Bibcode : 2020Natur.578..201C . doi : 10.1038/d41586-020-00341-9 . PMID 32047310 . 
  45. ↑ Lyumkis, Dmitry (29-03-2019). "Desafíos y oportunidades en el análisis de partículas individuales mediante crio-EM" . Journal of Biological Chemistry . 294 (13): 5181– 5197. doi : 10.1074/jbc.rev118.005602 . ISSN 0021-9258 . PMC 6442032. PMID 30804214 .   
  46. 1 2 Nakane T, Kotecha A, Sente A, McMullan G, Masiulis S, Brown PM, et al. (noviembre de 2020). "Criomicroscopía electrónica de partícula única con resolución atómica" . Nature . 587 ( 7832): 152– 156. Bibcode : 2020Natur.587..152N . doi : 10.1038/s41586-020-2829-0 . PMC 7611073. PMID 33087931 .   
  47. ↑ Wang HW, Wang JW (enero de 2017). "Cómo se complementan la criomicroscopía electrónica y la cristalografía de rayos X" . Protein Science . 26 (1): 32–39 . doi : 10.1002/pro.3022 . PMC 5192981. PMID 27543495 .  
  48. ↑ Schmidt A, Teeter M, Weckert E, Lamzin VS (abril de 2011). "Estructura cristalina de la pequeña proteína crambina a una resolución de 0,48 Å" . Acta Crystallographica. Sección F, Comunicaciones sobre biología estructural y cristalización . 67 ( Pt 4): 424–428 . Bibcode : 2011AcCrF..67..424S . doi : 10.1107/S1744309110052607 . PMC 3080141. PMID 21505232 .  
  49. ↑ Yip KM, Fischer N, Paknia E, Chari A, Stark H (noviembre de 2020). "Determinación de la estructura de proteínas a resolución atómica mediante crio-EM". Nature . 587 ( 7832): 157– 161. Bibcode : 2020Natur.587..157Y . doi : 10.1038/s41586-020-2833-4 . PMID 33087927. S2CID 224823207 .  
  50. ↑ Laschkarew, NOSOTROS; Usyskin, ID (1933). "Die Bestimmung der Lage der Wasserstoffionen im NH4Cl-Kristallgitter durch Elektronenbeugung" . Zeitschrift für Physik (en alemán). 85 ( 9– 10): 618– 630. Bibcode : 1933ZPhy...85..618L . doi : 10.1007/BF01331003 . ISSN 1434-6001 . S2CID 123199621 .  
  51. ^ Shi D, Nannenga BL, de la Cruz MJ, Liu J, Sawtelle S, Calero G, Reyes FE, Hattne J, Gonen T (mayo de 2016). "La recopilación de datos MicroED para cristalografía macromolecular" . Protocolos de la Naturaleza . 11 (5): 895– 904. doi : 10.1038/nprot.2016.046 . PMC 5357465 . PMID 27077331 .  
  52. ↑ Jones CG, Martynowycz MW, Hattne J, Fulton TJ, Stoltz BM, Rodriguez JA, et al. (noviembre de 2018). " El método de crio-EM MicroED como una herramienta poderosa para la determinación de la estructura de moléculas pequeñas" . ACS Central Science . 4 (11): 1587– 1592. Bibcode : 2018ACSCS...4.1587J . doi : 10.1021/acscentsci.8b00760 . PMC 6276044. PMID 30555912 .   
  53. ↑ Zachman MJ, Asenath-Smith E, Estroff LA, Kourkoutis LF (diciembre de 2016). "Preparación específica de interfaces sólido-líquido intactas mediante localización in situ sin marcadores y extracción con haz de iones criofocalizado" . Microscopía y microanálisis . 22 (6): 1338– 1349. Bibcode : 2016MiMic..22.1338Z . doi : 10.1017/S1431927616011892 . PMID 27869059 . 
  54. ↑ Levin BD, Zachman MJ, Werner JG, Sahore R, Nguyen KX, Han Y, Xie B, Ma L, Archer LA, Giannelis EP, Wiesner U, Kourkoutis LF, Muller DA (febrero de 2017). "Caracterización de cátodos de baterías de azufre y azufre nanoestructurado en microscopía electrónica sin artefactos de sublimación" . Microscopía y microanálisis . 23 (1): 155– 162. Bibcode : 2017MiMic..23..155L . doi : 10.1017/S1431927617000058 . PMID 28228169. S2CID 6801783 .  
  55. ↑ Cheng, Yifan (31 de agosto de 2018). "Criomicroscopía electrónica de partícula única: ¿Cómo llegó hasta aquí y hacia dónde irá?" . Science . 361 ( 6405): 876–880 . Bibcode : 2018Sci...361..876C . doi : 10.1126/science.aat4346 . ISSN 0036-8075 . PMC 6460916. PMID 30166484 .   
  56. ↑ Sigworth, FJ (1998). "Un enfoque de máxima verosimilitud para el refinamiento de imágenes de partículas individuales" . Journal of Structural Biology . 122 (3): 328– 339. doi : 10.1006/jsbi.1998.4014 . PMID 9774537 . 
  57. 1 2 Scheres, Sjors HW (enero de 2012). "Una visión bayesiana sobre la determinación de la estructura mediante crio-EM" . Journal of Molecular Biology . 415 (2): 406– 418. Bibcode : 2012JMBio.415..406S . doi : 10.1016 / j.jmb.2011.11.010 . PMC 3314964. PMID 22100448 .  
  58. 1 2 Nogales, Eva; Scheres, Sjors HW (mayo de 2015). "Crio-EM: una herramienta única para la visualización de la complejidad macromolecular" . Molecular Cell . 58 (4): 677– 689. Bibcode : 2015MolCe..58..677N . doi : 10.1016 / j.molcel.2015.02.019 . ISSN 1097-2765 . PMC 4441764. PMID 26000851 .   
  59. ↑ Sigworth, Fred J. (1 de febrero de 2016). "Principios del procesamiento de imágenes de partículas individuales mediante crio-EM" . Microscopy . 65 ( 1): 57– 67. doi : 10.1093/jmicro/dfv370 . ISSN 2050-5698 . PMC 4749045. PMID 26705325 .   
  60. ↑ Scheres, Sjors HW (2012-12-01). "RELION: Implementación de un enfoque bayesiano para la determinación de la estructura mediante crio-EM" . Journal of Structural Biology . 180 (3): 519– 530. doi : 10.1016/j.jsb.2012.09.006 . ISSN 1047-8477 . PMC 3690530. PMID 23000701 .   
  61. ↑ "RELION: Software de procesamiento de imágenes para microscopía crioelectrónica" . GitHub . 3dem. 27 de octubre de 2023. Consultado el 27 de octubre de 2023 .
  62. ↑ Bai, Xiao-chen; McMullan, Greg; Scheres, Sjors HW (enero de 2015). "Cómo la crio-EM está revolucionando la biología estructural". Trends in Biochemical Sciences . 40 (1): 49– 57. doi : 10.1016/j.tibs.2014.10.005 . ISSN 0968-0004 . PMID 25544475. S2CID 19727349 .   
  63. ↑ Zivanov, Jasenko; Nakane, Takanori; Forsberg, Björn O; Kimanius, Dari; Hagen, Wim JH; Lindahl, Erik; Scheres, Sjors HW (2018-11-09). Egelman, Edward H; Kuriyan, John (eds.). "Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras de crio-EM de alta resolución en RELION-3" . eLife . 7 e42166. doi : 10.7554/eLife.42166 . ISSN 2050-084X . PMC 6250425. PMID 30412051 .   
  64. ↑ Xiao, C., Fischer, MG, Bolotaulo, DM, Ulloa-Rondeau, N., Avila, GA y Suttle, CA (2017) "La reconstrucción por crio-EM de la cápside del virus Cafeteria roenbergensis sugiere una nueva vía de ensamblaje para virus gigantes". Scientific Reports , 7 : 5484. doi : 10.1038/s41598-017-05824-w .