Nucleótido

Los nucleótidos son moléculas orgánicas compuestas por una base nitrogenada, un azúcar pentosa y un fosfato . Sirven como unidades monoméricas de los polímeros de ácidos nucleicos : el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN), ambos biomoléculas esenciales para todas las formas de vida en la Tierra. Los nucleótidos se obtienen a través de la dieta y también se sintetizan a partir de nutrientes comunes en el hígado . ^{[ 1 ]}

Los nucleótidos están compuestos por tres subunidades moleculares: una nucleobase , un azúcar de cinco carbonos ( ribosa o desoxirribosa ) y un grupo fosfato formado por uno a tres fosfatos . Las cuatro nucleobases del ADN son guanina , adenina , citosina y timina (G, A, C y T); en el ARN, se utiliza uracilo (U) en lugar de timina.

Los nucleótidos también desempeñan un papel central en el metabolismo a nivel celular fundamental. Proporcionan energía química —en forma de nucleósido trifosfatos , adenosín trifosfato (ATP), guanosín trifosfato (GTP), citidina trifosfato (CTP) y uridina trifosfato (UTP)— en toda la célula para las numerosas funciones celulares que requieren energía, entre las que se incluyen: síntesis de aminoácidos , proteínas y membranas celulares , movimiento de la célula y sus partes (tanto interna como intercelularmente), división celular, etc. ^{[ 2 ]} Además, los nucleótidos participan en la señalización celular ( monofosfato de guanosina cíclico o cGMP y monofosfato de adenosina cíclico o cAMP) y se incorporan a importantes cofactores de reacciones enzimáticas (p. ej., coenzima A , FAD , FMN , NAD y NADP ⁺ ).

En bioquímica experimental , los nucleótidos pueden ser radiomarcados utilizando radionúclidos para obtener radionucleótidos.

Los 5-nucleótidos también se utilizan en potenciadores del sabor como aditivos alimentarios para realzar el sabor umami , a menudo en forma de extracto de levadura. ^{[ 3 ]}

Un nucleótido se compone de tres subunidades químicas distintivas: una molécula de azúcar de cinco carbonos, una nucleobase ( ambas juntas se denominan nucleósido ) y un grupo fosfato . Cuando las tres están unidas, un nucleótido también se denomina "nucleósido monofosfato ", "nucleósido difosfato " o "nucleósido trifosfato ", según la cantidad de fosfatos que componen el grupo fosfato. ^{[ 4 ]}

En los ácidos nucleicos , los nucleótidos contienen una base púrica o pirimídica (es decir, la molécula de nucleobase, también conocida como base nitrogenada) y se denominan ribonucleótidos si el azúcar es ribosa, o desoxirribonucleótidos si el azúcar es desoxirribosa. Moléculas individuales de fosfato conectan repetidamente las moléculas del anillo de azúcar en dos monómeros de nucleótidos adyacentes, uniendo así los monómeros de nucleótidos de un ácido nucleico extremo con extremo en una larga cadena. Estas uniones de cadenas de moléculas de azúcar y fosfato crean una cadena principal para una hélice simple o doble . En cualquier cadena, la orientación química ( direccionalidad ) de las uniones de cadena va del extremo 5' al extremo 3' ( léase : extremo 5' al extremo 3'), refiriéndose a los cinco sitios de carbono en las moléculas de azúcar en los nucleótidos adyacentes. En una doble hélice, las dos hebras están orientadas en direcciones opuestas, lo que permite el apareamiento de bases y la complementariedad entre los pares de bases, todo lo cual es esencial para replicar o transcribir la información codificada que se encuentra en el ADN.

Los ácidos nucleicos son macromoléculas poliméricas formadas por nucleótidos, las unidades monoméricas de los ácidos nucleicos . Las bases púricas adenina y guanina , y la base pirimídica citosina, se encuentran tanto en el ADN como en el ARN, mientras que las bases pirimídicas timina (en el ADN) y uracilo (en el ARN) se encuentran solo en uno de ellos. La adenina forma un par de bases con la timina mediante dos enlaces de hidrógeno, mientras que la guanina se aparea con la citosina mediante tres enlaces de hidrógeno.

Además de ser bloques de construcción para la formación de polímeros de ácidos nucleicos, los nucleótidos individuales desempeñan funciones en el almacenamiento y suministro de energía celular, la señalización celular, como fuente de grupos fosfato utilizados para modular la actividad de proteínas y otras moléculas de señalización, y como cofactores enzimáticos , llevando a cabo con frecuencia reacciones redox . Los nucleótidos cíclicos de señalización se forman mediante la unión del grupo fosfato dos veces a la misma molécula de azúcar , uniendo los grupos hidroxilo 5' y 3' del azúcar. ^{[ 2 ]} Algunos nucleótidos de señalización difieren de la configuración estándar de un solo grupo fosfato, al tener múltiples grupos fosfato unidos a diferentes posiciones en el azúcar. ^{[ 5 ]} Los cofactores de nucleótidos incluyen una gama más amplia de grupos químicos unidos al azúcar a través del enlace glucosídico , incluyendo nicotinamida y flavina , y en este último caso, el azúcar ribosa es lineal en lugar de formar el anillo que se observa en otros nucleótidos.

Los nucleótidos pueden sintetizarse por diversos medios, tanto in vitro como in vivo .

In vitro, se pueden utilizar grupos protectores durante la producción de nucleótidos en el laboratorio. Un nucleósido purificado se protege para crear un fosforamidito , que luego se puede utilizar para obtener análogos que no se encuentran en la naturaleza y/o para sintetizar un oligonucleótido .

In vivo, los nucleótidos pueden sintetizarse de novo o reciclarse a través de vías de recuperación . ^{[ 1 ]} Los componentes utilizados en la síntesis de novo de nucleótidos se derivan de precursores biosintéticos del metabolismo de carbohidratos y aminoácidos , y de amoníaco y dióxido de carbono. Recientemente también se ha demostrado que el metabolismo celular del bicarbonato puede ser regulado por la señalización de mTORC1 . ^{[ 6 ]} El hígado es el principal órgano de síntesis de novo de los cuatro nucleótidos. La síntesis de novo de pirimidinas y purinas sigue dos vías diferentes. Las pirimidinas se sintetizan primero a partir de aspartato y carbamoilfosfato en el citoplasma a la estructura de anillo precursora común, el ácido orótico, al cual se une covalentemente una unidad de ribosa fosforilada. Las purinas, sin embargo, se sintetizan primero a partir del molde de azúcar sobre el cual ocurre la síntesis del anillo. Cabe mencionar que la síntesis de los nucleótidos de purina y pirimidina se lleva a cabo mediante diversas enzimas en el citoplasma celular, no dentro de un orgánulo específico . Los nucleótidos se degradan de tal manera que las partes útiles pueden reutilizarse en reacciones de síntesis para crear nuevos nucleótidos.

Síntesis de ribonucleótidos de pirimidina

La síntesis de las pirimidinas citidina trifosfato (CTP) y uridina trifosfato (UTP) ocurre en el citoplasma y comienza con la formación de carbamoil fosfato a partir de glutamina y CO₂ _. A continuación, la aspartato carbamoiltransferasa cataliza una reacción de condensación entre aspartato y carbamoil fosfato para formar ácido carbamoil aspártico , que se cicla en ácido 4,5-dihidroorótico por acción de la dihidroorotasa . Este último se convierte en orotato por acción de la dihidroorotato oxidasa . La reacción neta es:

( S ) -Dihidroorotato + O₂ _{→ Orotato} + _H₂O₂

El orotato está unido covalentemente a una unidad de ribosa fosforilada. El enlace covalente entre la ribosa y la pirimidina se produce en la posición C ₁ ^{[ 7 ]} de la unidad de ribosa , que contiene un pirofosfato , y en N ₁ del anillo de pirimidina. La orotato fosforribosiltransferasa (PRPP transferasa) cataliza la reacción neta que produce orotidina 5'-monofosfato (OMP):

Orotato + 5-Fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato (PRPP) → Orotidina 5'-fosfato + Pirofosfato

El orotidina 5'-monofosfato es descarboxilado por la orotidina-5'-fosfato descarboxilasa para formar uridina monofosfato (UMP). La PRPP transferasa cataliza tanto la ribosilación como la descarboxilación, formando UMP a partir del ácido orótico en presencia de PRPP. A partir del UMP se derivan otros nucleótidos de pirimidina. El UMP es fosforilado por dos quinasas a uridina trifosfato (UTP) mediante dos reacciones secuenciales con ATP. Primero, se produce el difosfato a partir de UDP, que a su vez se fosforila a UTP. Ambos pasos se impulsan mediante la hidrólisis de ATP.

ATP + UMP → ADP + UDP

UDP + ATP → UTP + ADP

Posteriormente, el CTP se forma mediante la aminación del UTP por la actividad catalítica de la CTP sintetasa . La glutamina es el donante de NH₃ _y la reacción también se ve impulsada por la hidrólisis del ATP:

UTP + Glutamina + ATP + H ₂ O → CTP + ADP + _Pi

El monofosfato de citidina (CMP) se deriva del trifosfato de citidina (CTP) con la consiguiente pérdida de dos fosfatos. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

Síntesis de ribonucleótidos de purina

Los átomos que se utilizan para construir los nucleótidos de purina provienen de diversas fuentes:

La síntesis de novo de nucleótidos de purina , mediante la cual estos precursores se incorporan al anillo de purina, se produce a través de una ruta de 10 pasos hasta el intermediario de ramificación IMP , el nucleótido de la base hipoxantina . Posteriormente, el AMP y el GMP se sintetizan a partir de este intermediario mediante rutas separadas de dos pasos. Por lo tanto, las unidades de purina se forman inicialmente como parte de los ribonucleótidos, en lugar de como bases libres .

En la síntesis de IMP participan seis enzimas. Tres de ellas son multifuncionales:

• GART (reacciones 2, 3 y 5)
• PAICS (reacciones 6 y 7)
• ATIC (reacciones 9 y 10)

La vía metabólica comienza con la formación de PRPP . La enzima PRPS1 activa el R5P , que se forma principalmente por la vía de las pentosas fosfato , transformándolo en PRPP mediante su reacción con ATP . Esta reacción es inusual, ya que un grupo pirofosforilo se transfiere directamente del ATP al carbono ₁ del R5P y el producto presenta la configuración α en dicho carbono. Esta reacción también se comparte con las vías de síntesis de triptófano , histidina y nucleótidos de pirimidina . Al ser un punto clave en el metabolismo y requerir mucha energía, esta reacción está altamente regulada.

En la primera reacción exclusiva de la biosíntesis de nucleótidos de purina, la PPAT cataliza el desplazamiento del grupo pirofosfato (PP _i ) del PRPP por un nitrógeno amida donado por glutamina (N), glicina (N&C), aspartato (N), ácido fólico (C ₁ ) o CO ₂ . Este es el paso determinante en la síntesis de purinas. La reacción ocurre con la inversión de la configuración alrededor del carbono ₁ de la ribosa , formando así β - 5-fosforibosilamina (5-PRA) y estableciendo la forma anomérica del futuro nucleótido.

A continuación, se incorpora una glicina mediante hidrólisis de ATP, y el grupo carboxilo forma un enlace amina con el NH₂ _previamente introducido. Posteriormente, se añade una unidad de un carbono de la coenzima N₁₀ del ácido fólico, _el formil-THF, al grupo amino de la glicina sustituida, seguido del cierre del anillo de imidazol. Luego, se transfiere un segundo grupo NH₂ _de la glutamina al primer carbono de la unidad de glicina. Simultáneamente, se añade una carboxilación al segundo carbono de la unidad de glicina. Este nuevo carbono se modifica mediante la adición de una tercera unidad de NH₂ _, esta vez transferida de un residuo de aspartato. Finalmente, se añade una segunda unidad de un carbono del formil-THF al grupo nitrógeno y el anillo se cierra covalentemente para formar el precursor común de purinas, el monofosfato de inosina (IMP).

El monofosfato de inosina se convierte en monofosfato de adenosina en dos pasos. Primero, la hidrólisis de GTP impulsa la adición de aspartato al IMP por acción de la adenilosuccinato sintasa, sustituyendo el oxígeno carbonílico por un nitrógeno y formando el intermediario adenilosuccinato. Posteriormente, se elimina el fumarato, formando el monofosfato de adenosina. Este paso es catalizado por la adenilosuccinato liasa.

El monofosfato de inosina se convierte en monofosfato de guanosina mediante la oxidación del IMP, formando xantilato, seguido de la inserción de un grupo amino en C2 _. El NAD ⁺ es el aceptor de electrones en la reacción de oxidación. La transferencia del grupo amida desde la glutamina se produce por la hidrólisis del ATP.

La medición precisa de los grupos intracelulares de desoxinucleósido trifosfato (dNTP) es fundamental para comprender la replicación, reparación y metabolismo celular del ADN, ya que los desequilibrios en estos grupos pueden provocar un aumento de las tasas de mutación o inestabilidad genómica. Los enfoques analíticos modernos se basan principalmente en la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) para lograr una alta sensibilidad y especificidad. Más allá de los métodos tradicionales, las técnicas avanzadas como LC-MS/MS con espectrómetros de masas de triple cuadrupolo (utilizando monitorización de reacciones múltiples, MRM) y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) —incluidos analizadores Orbitrap o de tiempo de vuelo (TOF)— permiten la cuantificación simultánea de los cuatro dNTP incluso a partir de muestras biológicas limitadas. Los recientes avances metodológicos han introducido ensayos especializados, como el ensayo de fluorescencia basado en la ADN polimerasa, que proporciona una alternativa sensible y no radiactiva para medir los niveles de dNTP en varios tipos de células ^{[ 10 ]} . Además, el perfilado integral basado en MS se ha vuelto esencial para estudiar cómo las alteraciones del pool de dNTP contribuyen a enfermedades como el cáncer y los trastornos mitocondriales. Más allá de los dNTP canónicos, también existen variantes no canónicas como dUTP y derivados de dCTP metilados dentro del pool de nucleótidos. Su cuantificación es compleja pero esencial para comprender la inestabilidad genómica. Los ensayos enzimáticos recientes, que utilizan hidrolasas selectivas (por ejemplo, dUTPasa o Dcd:dut micobacteriano), permiten la detección fluorescente altamente sensible de estas especies, proporcionando una alternativa a las técnicas especializadas de LC-MS ^{[ 11 ]} .

Las teorías sobre el origen de la vida requieren el conocimiento de las vías químicas que permiten la formación de los componentes básicos de la vida en condiciones prebióticas plausibles. La hipótesis del mundo de ARN sostiene que en la sopa primordial existían ribonucleótidos libres , las moléculas fundamentales que se combinan en serie para formar ARN . Moléculas complejas como el ARN debieron surgir de moléculas pequeñas cuya reactividad estaba regida por procesos fisicoquímicos. El ARN está compuesto por nucleótidos de purina y pirimidina , ambos necesarios para una transferencia de información fiable y, por lo tanto, para la evolución darwiniana . Becker et al. demostraron cómo los nucleósidos de pirimidina pueden sintetizarse a partir de moléculas pequeñas y ribosa , impulsados ​​únicamente por ciclos húmedo-seco. ^{[ 12 ]} Los nucleósidos de purina pueden sintetizarse mediante una vía similar. Los 5'-monofosfatos y difosfatos también se forman selectivamente a partir de minerales que contienen fosfato, lo que permite la formación simultánea de polirribonucleótidos con bases tanto de purina como de pirimidina. De este modo, se puede establecer una red de reacciones hacia los bloques de construcción de ARN de purina y pirimidina a partir de moléculas atmosféricas o volcánicas simples. ^{[ 12 ]}

Un par de bases no naturales (UBP) es una subunidad (o nucleobase ) de ADN diseñada que se crea en un laboratorio y no se encuentra en la naturaleza. ^{[ 13 ]} Ejemplos incluyen d5SICS y dNaM . Estos nucleótidos artificiales que contienen nucleobases hidrofóbicas presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS–dNaM) o par de bases en el ADN. ^{[ 14 ] [ 15 ]} Se ha inducido a E. coli a replicar un plásmido que contiene UBP a través de múltiples generaciones. ^{[ 16 ]} Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético expandido a generaciones posteriores. ^{[ 14 ] [ 17 ]}

Las aplicaciones de los nucleótidos sintéticos son muy variadas e incluyen el diagnóstico de enfermedades, el tratamiento o la medicina de precisión.

1. Agentes antivirales o antirretrovirales: varios derivados de nucleótidos se han utilizado en el tratamiento contra la infección por hepatitis y VIH . ^{[ 18 ] [ 19 ]} Ejemplos de inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos directos ( ITIN ) incluyen tenofovir disoproxil , tenofovir alafenamida y sofosbuvir . Por otro lado, agentes como mericitabina , lamivudina , entecavir y telbivudina deben primero someterse a metabolización por fosforilación para activarse.
2. Oligonucleótidos antisentido (ASO): los oligonucleótidos sintéticos se han utilizado en el tratamiento de enfermedades hereditarias raras, ya que pueden unirse a transcritos de ARN específicos y, en última instancia, modular la expresión de proteínas. La atrofia muscular espinal , la esclerosis lateral amiotrófica , la hipercolesterolemia familiar homocigótica y la hiperoxaluria primaria tipo 1 son susceptibles de tratamiento con terapia basada en ASO. ^{[ 20 ]} La aplicación de oligonucleótidos representa una nueva frontera en la medicina de precisión y el manejo de afecciones que actualmente no tienen tratamiento.
3. ARN guía sintético (ARNg): se pueden utilizar nucleótidos sintéticos para diseñar ARNg , que son esenciales para el correcto funcionamiento de tecnologías de edición genética como CRISPR-Cas9 .

El nucleótido (abreviado "nt") es una unidad de longitud común para los ácidos nucleicos monocatenarios, de forma similar a como el par de bases es una unidad de longitud para los ácidos nucleicos bicatenarios. ^{[ 21 ]}

La IUPAC ha designado los símbolos para los nucleótidos. ^{[ 22 ]} Además de las cinco bases (A, G, C, T/U), a menudo se utilizan bases degeneradas, especialmente para el diseño de cebadores de PCR . Estos códigos de nucleótidos se enumeran aquí. Algunas secuencias de cebadores también pueden incluir el carácter "I", que codifica el nucleótido no estándar inosina . La inosina se encuentra en los ARNt y se empareja con adenina, citosina o timina. Sin embargo, este carácter no aparece en la siguiente tabla porque no representa una degeneración. Si bien la inosina puede cumplir una función similar a la de la degeneración "H", es un nucleótido real, en lugar de una representación de una mezcla de nucleótidos que cubre cada posible emparejamiento necesario.