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Fluoróforo

Una célula humana marcada con fluoróforo Un fluoróforo (o fluorocromo , de forma similar a un cromóforo ) es un compuesto químico fluorescente que puede reemitir luz al ser exci...

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Una célula humana marcada con fluoróforo

Un fluoróforo (o fluorocromo , de forma similar a un cromóforo ) es un compuesto químico fluorescente que puede reemitir luz al ser excitado por ella. Los fluoróforos suelen contener varios grupos aromáticos combinados , o moléculas planas o cíclicas con varios enlaces π . [ 1 ]

Los fluoróforos se utilizan a veces solos, como trazadores en fluidos, como colorantes para teñir ciertas estructuras, como sustratos de enzimas o como sondas o indicadores (cuando su fluorescencia se ve afectada por factores ambientales como la polaridad o los iones). De forma más general, se unen covalentemente a macromoléculas , sirviendo como marcadores (o colorantes, o etiquetas, o reporteros) para reactivos afines o bioactivos ( anticuerpos , péptidos, ácidos nucleicos). Los fluoróforos se utilizan especialmente para teñir tejidos, células o materiales en diversos métodos analíticos, como la imagen y la espectroscopia de fluorescencia .

La fluoresceína , a través de su derivado isotiocianato reactivo con aminas , el isotiocianato de fluoresceína (FITC), ha sido uno de los fluoróforos más populares. Desde el marcaje de anticuerpos, sus aplicaciones se han extendido a los ácidos nucleicos gracias a la carboxifluoresceína . Otros fluoróforos históricamente comunes son los derivados de la rodamina (TRITC), la cumarina y la cianina . [ 2 ] Las nuevas generaciones de fluoróforos, muchos de los cuales son patentados, suelen tener un mejor rendimiento, siendo más fotoestables, más brillantes o menos sensibles al pH que los colorantes tradicionales con excitación y emisión comparables. [ 3 ] [ 4 ]

Fluorescencia

El fluoróforo absorbe energía luminosa de una longitud de onda específica y la reemite a una longitud de onda mayor. Las longitudes de onda absorbidas , la eficiencia de transferencia de energía y el tiempo antes de la emisión dependen tanto de la estructura del fluoróforo como de su entorno químico, ya que la molécula en su estado excitado interactúa con las moléculas circundantes. Las longitudes de onda de máxima absorción (≈ excitación) y emisión (por ejemplo, Absorción/Emisión = 485  nm/517  nm) son los términos típicos que se utilizan para referirse a un fluoróforo dado, pero puede ser importante considerar todo el espectro. El espectro de excitación puede ser una banda muy estrecha o más ancha, o puede estar completamente más allá de un nivel de corte. El espectro de emisión suele ser más nítido que el espectro de excitación, y tiene una longitud de onda mayor y, por consiguiente, una energía menor. Las energías de excitación abarcan desde el ultravioleta hasta el espectro visible , y las energías de emisión pueden continuar desde la luz visible hasta la región del infrarrojo cercano .

Las principales características de los fluoróforos son:

  • Longitud de onda máxima de excitación y emisión (expresada en nanómetros (nm)): corresponde al pico en los espectros de excitación y emisión (generalmente un pico en cada caso).
  • Coeficiente de absorción molar (en mol −1 cm −1 ): relaciona la cantidad de luz absorbida, a una longitud de onda determinada, con la concentración de fluoróforo en solución.
  • Rendimiento cuántico : eficiencia de la energía transferida de la luz incidente a la fluorescencia emitida (el número de fotones emitidos por cada fotón absorbido).
  • Tiempo de vida (en picosegundos): duración del estado excitado de un fluoróforo antes de que regrese a su estado fundamental. Se refiere al tiempo que tarda una población de fluoróforos excitados en decaer a 1/ e (≈0,368) de la cantidad original.
  • Desplazamiento de Stokes : la diferencia entre las longitudes de onda de máxima excitación y máxima emisión.
  • Fracción oscura : la proporción de moléculas no activas en la emisión de fluorescencia. En el caso de los puntos cuánticos , la microscopía de molécula única prolongada mostró que entre el 20 % y el 90 % de todas las partículas nunca emiten fluorescencia. [ 5 ] Por otro lado, las nanopartículas de polímeros conjugados (Pdots) prácticamente no muestran fracción oscura en su fluorescencia. [ 6 ] Las proteínas fluorescentes pueden tener una fracción oscura debido al plegamiento incorrecto de la proteína o a la formación defectuosa del cromóforo. [ 7 ]

Estas características determinan otras propiedades, como el fotoblanqueo o la fotorresistencia (pérdida de fluorescencia tras la excitación continua con luz). Deben considerarse otros parámetros, como la polaridad de la molécula fluorófora, su tamaño y forma (por ejemplo, para el patrón de fluorescencia polarizada ), y otros factores que pueden modificar el comportamiento de los fluoróforos.

Los fluoróforos también pueden utilizarse para atenuar la fluorescencia de otros colorantes fluorescentes o para transmitir su fluorescencia a longitudes de onda aún mayores .

Tamaño (peso molecular)

La mayoría de los fluoróforos son moléculas orgánicas pequeñas de 20 a 100 átomos (200 a 1000 Dalton ; el peso molecular puede ser mayor dependiendo de las modificaciones injertadas y las moléculas conjugadas), pero también existen fluoróforos naturales mucho más grandes que son proteínas : la proteína verde fluorescente (GFP) tiene 27 kDa , y varias ficobiliproteínas (PE, APC...) tienen ≈240 kDa. En 2020, se afirmó que el fluoróforo más pequeño conocido era el 3-hidroxiisonicotinaldehído , un compuesto de 14 átomos y solo 123 Da. [ 8 ]

Las partículas fluorescentes como los puntos cuánticos (de 2 a 10  nm de diámetro, de 100 a 100 000 átomos) también se consideran fluoróforos. [ 9 ]

El tamaño del fluoróforo podría obstaculizar estéricamente la molécula marcada y afectar la polaridad de la fluorescencia.

Familias

Fluorescencia de diferentes sustancias bajo luz ultravioleta. El verde corresponde a la fluoresceína , el rojo a la rodamina B , el amarillo a la rodamina 6G , el azul a la quinina y el morado a una mezcla de quinina y rodamina 6G. Las soluciones tienen una concentración aproximada del 0,001 % en agua.

Las moléculas fluoróforas pueden utilizarse solas o como motivo fluorescente de un sistema funcional. Según su complejidad molecular y los métodos de síntesis, las moléculas fluoróforas se pueden clasificar generalmente en cuatro categorías: proteínas y péptidos, compuestos orgánicos pequeños, oligómeros y polímeros sintéticos, y sistemas multicomponentes. [ 10 ] [ 11 ]

Las proteínas fluorescentes GFP, YFP y RFP (verde, amarilla y roja, respectivamente) pueden unirse a otras proteínas específicas para formar una proteína de fusión , sintetizada en las células tras la transfección de un plásmido portador adecuado.

Los fluoróforos orgánicos no proteicos pertenecen a las siguientes familias químicas principales:

Estos fluoróforos emiten fluorescencia debido a electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida. Por ejemplo, el benceno , uno de los hidrocarburos aromáticos más simples, se excita a 254  nm y emite a 300  nm. [ 12 ] Esto distingue a los fluoróforos de los puntos cuánticos, que son nanopartículas semiconductoras fluorescentes .

Se pueden unir a proteínas mediante grupos funcionales específicos, como grupos amino ( éster activo , carboxilato , isotiocianato , hidrazina ), grupos carboxilo ( carbodiimida ), tiol ( maleimida , bromuro de acetilo ) y azida orgánica (mediante química click o de forma no específica ( glutaraldehído )).

Además, pueden estar presentes varios grupos funcionales para alterar sus propiedades, como la solubilidad, o conferir propiedades especiales, como el ácido borónico que se une a azúcares o múltiples grupos carboxilo para unirse a ciertos cationes. Cuando el colorante contiene un grupo donador de electrones y un grupo aceptor de electrones en extremos opuestos del sistema aromático, este colorante probablemente será sensible a la polaridad del entorno ( solvatocrómico ), por lo que se le llama sensible al entorno. A menudo, los colorantes se utilizan dentro de las células, que son impermeables a las moléculas cargadas; como resultado de esto, los grupos carboxilo se convierten en un éster, que es eliminado por esterasas dentro de las células, por ejemplo, fura-2AM y fluoresceína-diacetato .

Las siguientes familias de colorantes son grupos de marcas registradas y no necesariamente comparten similitudes estructurales.

Los núcleos de las células endoteliales de la arteria pulmonar bovina se tiñeron de azul con DAPI , las mitocondrias de rojo con MitoTracker Red CMXRos y la actina F de verde con faloidina Alexa Fluor 488, y se observaron con un microscopio de fluorescencia.

Ejemplos de fluoróforos que se encuentran con frecuencia

Colorantes reactivos y conjugados

Abreviaturas:

Colorantes de ácidos nucleicos

colorantes para la función celular

Proteínas fluorescentes

proteínas fluorescentes avanzadas

StayGold y mStayGold son proteínas fluorescentes avanzadas que han contribuido significativamente al campo de la microscopía de células vivas. StayGold, conocida por su alta fotoestabilidad y brillo, fue diseñada originalmente como una proteína fluorescente dimérica, que, si bien era eficaz, planteaba desafíos relacionados con la agregación y la precisión del marcaje. [ 15 ] Para abordar estas limitaciones, mStayGold se diseñó como una variante monomérica, mejorando su utilidad en el marcaje preciso de proteínas. mStayGold exhibe una fotoestabilidad superior, manteniendo la fluorescencia en condiciones de alta irradiancia y demostrando un mayor brillo en comparación con su variante anterior StayGold. Además, madura más rápido, lo que permite una obtención de imágenes más rápida después de la transfección. Estos avances hacen de mStayGold una herramienta versátil para una variedad de aplicaciones, incluyendo el seguimiento de moléculas individuales y la obtención de imágenes de alta resolución de procesos celulares dinámicos, ampliando así las capacidades de las proteínas fluorescentes en la investigación biológica. [ 16 ]

Abreviaturas:

Aplicaciones

Los fluoróforos tienen una importancia particular en el campo de la bioquímica y los estudios de proteínas , por ejemplo, en inmunofluorescencia , análisis celular, [ 17 ] inmunohistoquímica , [ 3 ] [ 18 ] y sensores de moléculas pequeñas . [ 19 ] [ 20 ]

Polímeros fluorescentes

Los fluoróforos se han utilizado con polímeros de diferentes maneras y para muchos tipos de aplicaciones en diferentes campos como la bioquímica , la química analítica , la ciencia de los materiales y la nanoquímica . Por ejemplo, los agentes RAFT peptídicos marcados con 5,6-carboxifluoresceína se han utilizado para sintetizar poliacrilamida , poliacrilato y poliestireno con posibles aplicaciones para el análisis de la captación celular de polímeros de diferentes tamaños [ 21 ] . Las poliolefinas fluorescentes , como el polietileno fluorescente , se han sintetizado y explorado como materiales debido a sus posibles aplicaciones en sondas fluorescentes, LED , dispositivos de almacenamiento y cifrado de información , imágenes celulares, clasificación de plásticos y cuantificación de plástico reciclado [ 22 ] .

Usos fuera de las ciencias biológicas

tinte marino fluorescente

Los tintes fluorescentes tienen un amplio uso en la industria, conocidos como "colores neón", tales como:

Véase también

Referencias

  1. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). «Capítulo 3: Tintes y fluorocromos» . Microscopía de fluorescencia en ciencias de la vida . Bentham Science Publishers. pp. 61–95 . ISBN  978-1-68108-519-7Consultado el 24 de diciembre de 2017 .
  2. ↑ Rietdorf J (2005). Técnicas microscópicas . Avances en ingeniería bioquímica/biotecnología. Berlín: Springer. págs. 246–249 . ISBN  3-540-23698-8. Consultado el 13 de diciembre de 2008 .
  3. 1 2 Tsien RY; Waggoner A (1995). "Fluoróforos para microscopía confocal" . En Pawley JB (ed.). Manual de microscopía confocal biológica . Nueva York: Plenum Press. págs. 267–74 . ISBN  0-306-44826-2. Consultado el 13 de diciembre de 2008 .
  4. ↑ Lakowicz, JR (2006). Principios de espectroscopia de fluorescencia (3.ª ed.). Springer. pág. 954. ISBN   978-0-387-31278-1.
  5. ↑ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Wang X, Grimes AF, English DS, Berti L, Mattoussi H (2011). "Estudios de colocalización de moléculas individuales arrojan luz sobre la idea de puntos cuánticos individuales totalmente emisores versus oscuros". Small . 7 (14): 2101– 2108. Bibcode : 2011Small...7.2101P . doi : 10.1002/smll.201100802 . PMID 21710484 . 
  6. ↑ Koner AL, Krndija D, Hou Q, Sherratt DJ, Howarth M (2013). "Las nanopartículas de polímeros conjugados con terminación hidroxilo tienen una fracción brillante cercana a la unidad y revelan la dependencia del colesterol de los nanodominios de IGF1R" . ACS Nano . 7 (2): 1137– 1144. Bibcode : 2013ACSNa...7.1137K . doi : 10.1021/ nn3042122 . PMC 3584654. PMID 23330847 .  
  7. ↑ Garcia-Parajo MF, Segers-Nolten GM, Veerman JA, Greve J, van Hulst NF (2000). "Dinámica en tiempo real impulsada por la luz de la emisión de fluorescencia en moléculas individuales de proteína fluorescente verde" . PNAS . 97 ( 13): 7237– 7242. Bibcode : 2000PNAS...97.7237G . doi : 10.1073/pnas.97.13.7237 . PMC 16529. PMID 10860989 .  
  8. ↑ Cozens, Tom (16 de diciembre de 2020). "Una molécula fluorescente rompe el récord de tamaño para tintes emisores de luz verde" . chemistryworld.com . Consultado el 3 de diciembre de 2021 .
  9. ↑ Li Z, Zhao X, Huang C, Gong X (2019). "Avances recientes en la fabricación ecológica de concentradores solares luminiscentes utilizando puntos cuánticos no tóxicos como fluoróforos". J. Mater. Chem. C . 7 (40): 12373– 12387. doi : 10.1039/C9TC03520F . S2CID 203003761 . 
  10. ↑ Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013), "Fluoróforos y sus aplicaciones como sondas moleculares en células vivas", Curr. Org. Chem. , 17 (6): 564– 579, doi : 10.2174/1385272811317060003
  11. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). «Capítulo 4 Marcadores fluorescentes» . Microscopía de fluorescencia en ciencias de la vida . Bentham Science Publishers. págs. 96–134 . ISBN  978-1-68108-519-7Consultado el 24 de diciembre de 2017 .
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  • La base de datos de colorantes fluorescentes
  • Tabla de fluorocromos
  • El Manual de Sondas Moleculares : un recurso exhaustivo sobre la tecnología de fluorescencia y sus aplicaciones.