Mapeo de la arquitectura del genoma

El comando process_nps de GAMtools permite realizar el mapeo. Este mapea los datos de secuencia sin procesar de los perfiles nucleares. GAMtools también ofrece la opción de realizar controles de calidad en los perfiles nucleares. Esta opción se habilita añadiendo el parámetro -c/--do-qc al comando anterior. Al habilitar el control de calidad, GAMtools intentará excluir los perfiles nucleares de baja calidad.

El comando gamtools process_nps de GAMtools se utiliza para mapear datos de secuencias sin procesar de perfiles nucleares (PN) y generar una tabla de segregación. El control de calidad se puede habilitar con la opción -c o --do-qc para excluir los PN de baja calidad.

El comando GAMtools para este paso es:

gamtools process_nps --do-qc -g <ARCHIVO_GENÓMICO> <ARCHIVO_FASTQ> [<ARCHIVO_FASTQ> ...] 

Tras el mapeo, GAMtools cuenta el número de lecturas de cada perfil nuclear que se solapan con las ventanas genómicas, utilizando un tamaño de ventana predeterminado de 50  kb. Este paso se realiza mediante el mismo comando process_nps y genera una tabla de segregación que indica la presencia o ausencia de cada ventana en todos los perfiles.

El comando de GAMtools para este proceso es `matrix` . El archivo de entrada es la tabla de segregación calculada a partir del paso de llamada de ventanas. GAMtools calcula estas matrices utilizando el desequilibrio de ligamiento normalizado, lo que significa que analiza cuántas veces cada par de ventanas es detectado por el mismo NP y luego normaliza los resultados en función de cuántas veces cada ventana fue detectada por todos los NP. La siguiente figura muestra un ejemplo de un mapa de calor de matriz de proximidad generado con GAMtools.

El comando GAMtools para este paso es:

gamtools matrix [OPCIONES] -s <ARCHIVO_SEGREGACIÓN> -r <REGIÓN> [<REGIÓN> ...] 

El comando compaction de GAMtools se puede usar para calcular una estimación de la compactación de la cromatina. La compactación es un valor asignado a un gen que representa su tamaño. El nivel de compactación es inversamente proporcional al volumen del locus. Se dice que los loci genómicos con un volumen bajo tienen un alto nivel de compactación, y los loci con un volumen alto tienen un bajo nivel de compactación. Como se muestra en la figura, se espera que los loci con un bajo nivel de compactación sean interceptados con mayor frecuencia por las secciones de criosección. GAMtools usa esta información para asignar un valor de compactación a cada locus en función de su frecuencia de detección en muchos perfiles nucleares. La tasa de compactación de estos loci no es estática y cambia continuamente a lo largo de la vida de la célula. Se cree que los loci genómicos se descompactan cuando ese gen está activo. Esto permite a un investigador hacer suposiciones sobre qué genes están activos actualmente en una célula, utilizando los resultados de los datos de GAMtools. También se cree que un locus con baja compactación está relacionado con la actividad transcripcional . La complejidad temporal del comando de compactación es O ( m × n ), donde m es el número de ventanas genómicas y n es el número de perfiles nucleares.

El comando GAMtools para este paso es:

compactación de gamtools [OPCIONES] -s <ARCHIVO_SEGREGACIÓN> -o <ARCHIVO_SALIDA> 

GAMtools se puede usar para calcular la posición radial de los NP. La posición radial de un NP es una medida de qué tan cerca o lejos está ese NP del ecuador o centro del núcleo. Los NP que están cerca del centro del núcleo se consideran ecuatoriales, mientras que los NP que están más cerca del borde del núcleo se consideran apicales. El comando de GAMtools para calcular la posición radial es radial_pos . Esto requiere que haya generado previamente una tabla de segregación. La posición radial se estima a partir del tamaño promedio de los NP que contienen una región de cromatina determinada. La cromatina que está más cerca de la periferia generalmente estará intersectada por NP más pequeños y apicales, mientras que la cromatina central estará intersectada por NP más grandes y ecuatoriales.

Para estimar el tamaño de cada NP, GAMtools analiza el número de ventanas que cada NP detectó, ya que se puede asumir que los NP que detectaron más ventanas tienen un mayor volumen. Esto es muy similar al método utilizado para estimar la compactación de la cromatina. La figura de la derecha ilustra cómo GAMtools analiza la tasa de detección de cada NP para estimar el volumen y determinar la compactación o la posición radial. Si observamos el primer NP, vemos que intersecta las tres ventanas, por lo que podemos estimar que es uno de los NP más grandes. El segundo NP intersecta dos de las tres ventanas, por lo que podemos estimar que es más pequeño que el primero. El tercer NP solo intersecta una de las tres ventanas, por lo que podemos estimar que es el NP más pequeño. Ahora que tenemos una estimación del tamaño de cada NP, podemos estimar la posición radial. Si asumimos que los núcleos pulposos (NP) más grandes son más ecuatoriales, entonces encontramos que el primer NP es el más ecuatorial, el segundo NP es el segundo más ecuatorial y el tercer NP es el más apical.

El comando GAMtools para este paso es:

gamtools radial_pos [OPCIONES] -s <ARCHIVO_SEGREGACIÓN> -o <ARCHIVO_SALIDA> 

Aquí hay un pseudocódigo que ilustra cómo se podría calcular la posición radial de una lista de sintagmas nominales:

// Supongamos que tenemos una matriz 2D llamada data donde las filas corresponden a los NP y las columnas corresponden a las ventanas, entonces si data[1][2] es 1, eso significa que el NP 1 contiene la ventana 2. // Utilice esta variable para llevar un registro del mayor número de ventanas detectadas por un único NP. VENTANA MÁXIMA = 0 // Usa este array para llevar un registro del número de ventanas detectadas por cada NP, para que podamos determinar posteriormente la posición radial. SEA RADIAL_POS = [] // Recorrer todos los NP PARA NP DESDE 1 HASTA NUM_NPS: DEJE QUE WINCOUNT = 0 // Contar el número de ventanas que vio cada NP PARA WIN DESDE 1 HASTA NUM_WINDOWS: SI ( datos[NP][WIN] == 1 ) CONTADOR DE VICTORIAS = CONTADOR DE VICTORIAS + 1 // Comprueba si el NP actual ha visto la mayor cantidad de ventanas SI WINCOUNT > MAXWINDOW: VENTANA MÁXIMA = NÚMERO DE VICTORIAS // Agrega el conteo para el NP actual al array RADIAL_POS.APPEND( WINCOUNT ) // Divide el número de ventanas que vio cada NP por el mayor número de ventanas que vio cualquier NP para obtener una estimación de la posición radial. PARA NP DESDE 1 HASTA NUM_NPS: RADIAL_POS[NP] = RADIAL_POS[NP] / MAXWINDOW 

Este pseudocódigo creará una lista de posiciones radiales que van de 0 a 1 que proporcionan una estimación de la posición radial, donde 1 es la más ecuatorial y 0 la más apical. La complejidad temporal de este pseudocódigo es O(n * m), donde n es el número de NP y m es el número de ventanas. El primer bucle for realiza n iteraciones y tiene un bucle for interno que realiza m iteraciones, lo que significa que la complejidad temporal de ese bucle for es O(n * m). El segundo bucle for tiene n iteraciones, por lo que tiene una complejidad temporal O(n). Por lo tanto, la complejidad temporal total de este código es O(n * m + n), que se puede reducir a O(n * m).

El modelo SLICE se basa en la hipótesis de que la probabilidad de que loci no interactuantes se encuentren dentro del mismo perfil nuclear es predecible. Esta probabilidad depende de la distancia entre dichos loci. El modelo SLICE considera un par de loci como de dos tipos: uno interactuante y otro no interactuante. De acuerdo con la hipótesis, las proporciones de los estados de los perfiles nucleares pueden predecirse mediante análisis matemático. Al derivar una función de la probabilidad de interacción, estos datos GAM también pueden utilizarse para identificar interacciones prominentes y explorar la sensibilidad del modelo GAM.

SLICE considera que un par de loci pueden interactuar o no interactuar en toda la población celular. El primer paso de este cálculo es describir un único locus. Un par de loci, A y B , pueden tener dos estados posibles: uno es que A y B no interactúen entre sí. El otro es que sí interactúen. El primer problema es si se puede encontrar un único locus en un perfil nuclear.

La expresión matemática es:

Probabilidad de un solo locus:${\displaystyle v_{0},v_{1}}$ - <${\displaystyle v_{1}}$> probabilidad de que el locus se encuentre en un perfil nuclear. - <${\displaystyle v_{0}}$>${\displaystyle =1-}$<${\displaystyle v_{1}}$> probabilidad de que el locus no se encuentre en un perfil nuclear. - <${\displaystyle v_{1}}$>=${\displaystyle V_{NP}/V_{núcleo}}$

Como se muestra en la ecuación anterior, el volumen del núcleo es un valor necesario para el cálculo. Los radios de estos perfiles nucleares se pueden usar para estimar el radio nuclear. La predicción de SLICE para el radio coincide con las simulaciones de Monte Carlo (se actualizará más información sobre este paso una vez que se obtenga la licencia de la figura en el artículo del autor original). Con el resultado del radio estimado, se puede estimar la probabilidad de que dos loci se encuentren en un estado no interactivo y la probabilidad de que estos dos loci se encuentren en un estado interactivo.

Aquí está la expresión matemática de no interacción:

<${\displaystyle u_{i}}$>,i = 0, 1, 2 representa: encontrar 0, 1 o 2 loci de un par de loci que no interactúan. Dos loci en un estado que no interactúa:${\displaystyle u_{i}}$${\displaystyle <u_{0}>=<v_{0}^{2}>,<u_{1}>=<v_{1}v_{0}>,<u_{2}>=<v_{1}^{2}>}$ Aquí está la expresión matemática de la interacción: Estimación del estado de interacción de dos loci:${\displaystyle t_{i}}$probabilidad ${\displaystyle <t_{2}>}$~${\displaystyle <v_{1}>}$,${\displaystyle <t_{1}>}$~0,${\displaystyle <t_{0}>}$~${\displaystyle <v_{0}>=1-<v_{1}>}$

Con los resultados de procesos anteriores, la probabilidad de ocurrencia de un par de loci en un perfil nuclear se puede calcular mediante un método estadístico. Un par de loci puede existir en tres estados diferentes. Cada uno de ellos tiene una probabilidad de${\displaystyle P_{i},i=0,1,2}$ Probabilidad de ocurrencia de pares de loci en perfiles nucleares individuales:${\ Displaystyle P_ {2}, P_ {1}, P_ {0}}$${\displaystyle P_{2}}$: probabilidad de que dos pares de loci estén en estado de interacción; ${\displaystyle P_{1}}$: probabilidad de que uno interactúe con el otro, pero el otro no interactúe; ${\displaystyle P_{0}}$: probabilidad de que los dos no interactúen. Análisis estadístico SLICE ${\displaystyle N_{0,0}/N=<t_{0}^{2}>P_{2}+<t_{0}u_{0}>P_{1}+<u_{0}^{2}>P_{0}}$${\displaystyle N_{2,0}/N=N_{0,2}=<t_{1}^{2}>P_{2}+<t_{1}u_{1}>P_{1}+<u_{1}^{2}>P_{0}}$${\displaystyle N_{i,j}}$Representación: el número i corresponde a A. El número j corresponde a B. (i y j son iguales a 0, 1 o 2 loci).

En el mapeo de la arquitectura del genoma (GAM), la eficiencia de detección se refiere a la probabilidad de que un locus genómico se observe dentro de un perfil nuclear (PN). Esta probabilidad depende de varios factores, incluyendo la geometría del núcleo y el grado de compactación de la cromatina. Las regiones genómicas ubicadas cerca de la periferia nuclear o altamente condensadas tienen menos probabilidades de ser interceptadas por las secciones orientadas aleatoriamente utilizadas en GAM. Por el contrario, los loci que se encuentran en una posición más central o en un estado descondensado se detectan con mayor facilidad. Dado que no todos los loci presentes en una sección nuclear se observan de forma fiable, el modelo SLICE (Inferencia Estadística de Cosegregación) incorpora la eficiencia de detección para tener en cuenta limitaciones como el seccionamiento incompleto o la pérdida de ADN. Esto ayuda a distinguir entre la ausencia real de una señal y la imposibilidad de detectarla.

Para evaluar la eficiencia de detección, investigadores que estudian células madre embrionarias de ratón (mESC) generaron mapas de contacto de todo el genoma a partir de más de 400 perfiles nucleares de alta calidad. Estos estudios examinaron la detección en varias resoluciones, como 30 kb, y encontraron que se requerían aproximadamente 400 000 lecturas mapeadas únicas por NP para detectar más del 80 % de las ventanas positivas. En promedio, cada NP capturó alrededor del 6 al 4 % del genoma, lo que concuerda con las expectativas basadas en el volumen nuclear. La validación con FISH ( hibridación in situ con fluorescencia ) confirmó que se podían detectar eficazmente regiones tan pequeñas como 40 kb. Para mejorar la precisión, se aplicó una normalización estadística para reducir los sesgos causados ​​por factores como el contenido de GC, la mapeabilidad y la variabilidad en las tasas de detección, produciendo matrices GAM con menos artefactos que los datos Hi-C tradicionales.

Para determinar qué ventanas genómicas representan realmente señales, se agregaron lecturas de secuenciación en ventanas con tamaños que oscilaban entre 10 kb y 1 Mb. Posteriormente, los investigadores modelaron el número de lecturas por NP utilizando una combinación de distribuciones binomial negativa y lognormal. Con base en este modelo, se estableció un umbral para cada NP: las ventanas se etiquetaron como positivas si el número de lecturas mapeadas superaba significativamente lo esperado debido únicamente al ruido de secuenciación. Esta combinación de rigor estadístico y corrección de la eficiencia de detección dentro del marco SLICE proporciona interpretaciones más precisas y biológicamente significativas de los datos GAM.

La figura 3 de la publicación original ilustra este modelo de eficiencia de detección y frecuencia de cosegregación entre ventanas genómicas. ^{[ 11 ]}

Basándose en la eficiencia de detección y las probabilidades definidas previamente${\displaystyle u_{0}}$,${\displaystyle u_{1}}$, y${\displaystyle u_{2}}$SLICE estima la probabilidad de que un par de loci genómicos interactúen. Estos valores representan las probabilidades de detectar cero, uno o ambos loci en un perfil nuclear cuando los loci no interactúan: ^{[ 1 ]}

${\displaystyle u_{0}=v_{0}^{2}}$: probabilidad de que no se detecte ninguno de los loci

${\ Displaystyle u_ {1} = 2v_ {1} v_ {0}}$: probabilidad de que se detecte solo un locus

${\ Displaystyle u_ {2} = v_ {1} ^ {2}}$: probabilidad de que se detecten ambos loci

Al comparar estas probabilidades esperadas bajo el modelo sin interacción con los datos de cosegregación observados, SLICE infiere la probabilidad de interacción de cada par de loci. La inferencia estadística tiene en cuenta la eficiencia de detección y permite a los investigadores distinguir los contactos de cromatina reales de las codetecciones coincidentes debidas al corte nuclear.

Cada paso del cálculo descrito anteriormente se muestra y explica en la tabla siguiente.

Una vez completados los pasos de cálculo anteriores, los valores de ligamiento normalizados se organizan en una matriz simétrica . Para un conjunto específico de 81 ventanas genómicas, esto da como resultado una matriz de 81 x 81. Esta dimensión surge porque cada ventana se compara consigo misma y con todas las demás para calcular el conjunto completo de valores de ligamiento normalizados. A medida que se calcula el ligamiento de cada par, el valor se inserta en su fila y columna correspondientes. Por ejemplo, el valor de ligamiento entre la primera y la segunda ventana se coloca en la intersección de la primera columna y la segunda fila, así como de la segunda columna y la primera fila. Para facilitar la interpretación, esta matriz se suele visualizar como un mapa de calor bidimensional , como se muestra a continuación.

Al analizar el mapa de calor generado , la intensidad del color de cada bloque indica la fuerza del enlace. En el ejemplo del mapa de calor , la leyenda muestra que el valor máximo de enlace de 1,0 corresponde al rojo oscuro. Estos valores más altos aparecen prominentemente a lo largo de la línea diagonal, lo que representa la autointeracción donde cada ventana genómica se compara consigo misma. Las entradas fuera de la diagonal , que transitan del amarillo claro (que indica un bajo enlace) a tonos más oscuros de naranja y rojo, ilustran la probabilidad de cosegregación y proximidad física entre ventanas distintas. ^{[ 13 ]} Además, las bandas claras en blanco que se cruzan cerca del centro del mapa (alrededor de la ventana 44) indican regiones donde los datos fueron filtrados o no se pudieron mapear. Visualizar la matriz de enlace normalizada como un mapa de calor proporciona una base clara para analizar los contactos cromosómicos , lo que permite utilizar los datos para un modelado arquitectónico 3D más avanzado. ^{[ 14 ]}

Una vez que las relaciones entre pares de ventanas genómicas se han resumido en una matriz de enlace normalizada, esta se puede convertir en una representación gráfica. Cada ventana genómica se trata como un nodo, y se añade una arista no dirigida entre dos ventanas cuando su enlace normalizado supera un umbral predefinido.

En el ejemplo que se muestra aquí, este umbral se establece en el tercer cuartil (Q3) de los valores de enlace normalizados. Dado que una ventana genómica no está conectada consigo misma, las entradas diagonales se establecen en 0. Por lo tanto, la matriz de adyacencia resultante es simétrica, lo que concuerda con un grafo no dirigido. Esta representación gráfica puede utilizarse posteriormente para análisis como la medición de la centralidad y la detección de comunidades.

Una vez establecida la matriz de adyacencia, las ventanas pueden evaluarse utilizando diversas medidas de centralidad . Las diferentes medidas de centralidad que pueden utilizarse para interpretar la matriz son la centralidad de intermediación , la centralidad de cercanía , la centralidad de vector propio y la centralidad de grado . Cada una de estas medidas puede resaltar diferentes áreas de la red y diferentes funciones estructurales de las ventanas genómicas dentro de ella. ^{[ 15 ]}

La centralidad de intermediación se calcula considerando las rutas más cortas entre pares de nodos y determinando cuántas de estas rutas pasan por el nodo observado, excluyendo los casos en los que este es un nodo final. Esta medida puede ayudar a identificar nodos que conectan diferentes partes de una red. ^{[ 16 ]}

La centralidad de cercanía se calcula sumando todos los nodos de una red menos uno y dividiendo ese número por la suma de las distancias más cortas a cada uno de los nodos del grafo. Se basa en las distancias de ruta más corta desde un nodo a todos los demás nodos de la red y puede ayudar a identificar los nodos que, en promedio, están más cerca del resto del grafo. Véase la Figura 1 adjunta para un ejemplo. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

La centralidad de vector propio mide no solo cuántas conexiones tiene un nodo, sino también si está conectado a otros nodos altamente conectados. De esta manera, puede ayudar a identificar nodos que se encuentran en partes más influyentes o altamente interconectadas de la red. ^{[ 19 ] [ 20 ]}

La centralidad de grado se calcula dividiendo el número de aristas conectadas a un nodo entre el número total de nodos menos uno:

${\displaystyle C_{D}(i)={\frac {\sum _{j=1}^{n}a_{ij}}{n-1}}}$

dónde${\displaystyle a_{ij}}$representa si el nodo${\displaystyle i}$está conectado al nodo${\displaystyle j}$en la matriz de adyacencia y${\displaystyle n}$es el número total de nodos en el grafo. El numerador cuenta el número total de conexiones del nodo.${\displaystyle i}$y el denominador escala el valor por el número máximo posible de vecinos. Véase la Figura 2 adjunta para un ejemplo de este cálculo. ^{[ 21 ]}

La centralidad de un nodo puede ser un buen indicador de su potencial para influir en el conjunto de datos, en función de su posición y conexiones dentro de la red.

Una vez calculados los valores de centralidad, es posible inferir subconjuntos relacionados de los datos. Estos subconjuntos relacionados se denominan "comunidades": grupos de nodos que están más estrechamente vinculados entre sí que con el resto de la red. ^{[ 22 ]} Si bien la detección de comunidades se utiliza comúnmente en el análisis de redes sociales y el mapeo de conexiones sociales, ^{[ 23 ]} también puede aplicarse a problemas como las interacciones genómicas.

Un método relativamente sencillo basado en grafos para aproximar comunidades consiste en identificar varios nodos significativos mediante medidas de centralidad, como la centralidad de grado, y luego construir comunidades a su alrededor. En un análisis sencillo basado en grafos de la red de interacción de Hist1, los cinco nodos con la mayor centralidad de grado se trataron como centros, y cada comunidad se definió como un centro junto con sus vecinos conectados directamente. Si un nodo estaba conectado a más de un centro, se le asignaba a la comunidad del centro con el que tenía el vínculo normalizado más fuerte. Este tipo de aproximación puede ayudar a identificar grupos de ventanas genómicas con patrones de interacción local relativamente fuertes y puede resaltar posibles interacciones de cromatina u otras relaciones que merecen un estudio más profundo.

Las comunidades resultantes pueden visualizarse como subgrafos centrados en ventanas centrales o como patrones locales en un mapa de calor de adyacencia. La vista de subgrafos resalta la estructura de nodos centrales y vecinos de la comunidad, mientras que la vista de mapa de calor muestra la misma comunidad en forma de matriz y destaca qué ventanas genómicas están conectadas dentro de la subred seleccionada.