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Síntesis de péptidos

Acoplamiento de dos aminoácidos en solución. La amina no protegida de uno reacciona con el grupo carboxilo no protegido del otro para formar un enlace peptídico . En este ejempl...

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Acoplamiento de dos aminoácidos en solución. La amina no protegida de uno reacciona con el grupo carboxilo no protegido del otro para formar un enlace peptídico . En este ejemplo, el segundo grupo reactivo (amina/ácido) en cada uno de los materiales de partida lleva un grupo protector .

En química orgánica , la síntesis de péptidos es la producción de péptidos , compuestos donde múltiples aminoácidos se unen mediante enlaces amida, también conocidos como enlaces peptídicos . Los péptidos se sintetizan químicamente mediante la reacción de condensación del grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro. Generalmente, se requieren estrategias de grupos protectores para prevenir reacciones secundarias indeseables con las diversas cadenas laterales de aminoácidos. [ 1 ] La síntesis química de péptidos comienza con mayor frecuencia en el extremo carboxilo del péptido (extremo C) y avanza hacia el extremo amino ( extremo N ). [ 2 ] La biosíntesis de proteínas (péptidos largos) en organismos vivos ocurre en la dirección opuesta.

La síntesis química de péptidos puede llevarse a cabo utilizando técnicas clásicas en fase líquida, aunque en la mayoría de los entornos de investigación y desarrollo se han sustituido por métodos en fase sólida (véase más adelante). [ 3 ] La síntesis en fase líquida conserva su utilidad en la producción de péptidos pequeños para fines industriales.

La síntesis química de péptidos facilita la producción de péptidos que son difíciles de expresar en bacterias, la incorporación de aminoácidos no naturales, la modificación de la estructura principal de péptidos/proteínas y la síntesis de péptidos que contienen D-aminoácidos . [ 4 ]

Síntesis de péptidos en fase sólida

El método establecido para la producción de péptidos sintéticos se conoce como síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). [ 2 ] Iniciada por Robert Bruce Merrifield , [ 5 ] [ 6 ] la SPPS permite el ensamblaje sencillo de un péptido objetivo mediante la adición gradual de aminoácidos mientras la cadena peptídica en crecimiento se une a un soporte de resina en perlas, macroscópicamente insoluble e hinchado con disolvente. [ 7 ]

Características de los soportes sólidos

El soporte sólido consiste en pequeñas perlas de resina polimérica (~50 a 100 micras de diámetro) funcionalizadas con grupos reactivos (como grupos amina o hidroxilo) que pueden usarse para unir la cadena peptídica naciente al polímero de resina. [ 2 ] Generalmente, se utilizan moléculas de enlace para mantener unidas las cadenas peptídicas y la resina durante la síntesis. El péptido permanece unido covalentemente al soporte de resina durante toda la síntesis; después de los pasos químicos involucrados en la adición de cada aminoácido, los reactivos en exceso y los subproductos solubles pueden eliminarse mediante un simple lavado con solvente y filtración. Este enfoque evita el aislamiento cromatográfico del péptido producto después de cada paso de reacción que se requiere cuando se utiliza la síntesis convencional en fase de solución. [ 7 ] Una vez completada la síntesis del péptido, la molécula de enlace puede escindirse selectivamente para liberar el péptido.

Procedimiento general de SPPS

La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) por etapas procede del residuo de aminoácido C-terminal de la cadena peptídica diana unida covalentemente al soporte de resina. Cada aminoácido que se acoplará al extremo N-terminal de la cadena peptídica naciente unida a la resina debe protegerse en su grupo amino alfa mediante grupos protectores como Boc (lábil a los ácidos) o Fmoc (lábil a las bases), según la estrategia de protección empleada (véase más adelante). [ 1 ]

El procedimiento general de SPPS consiste en ciclos repetidos de reacciones alternas de desprotección del extremo N y de "acoplamiento" para la formación de enlaces peptídicos. La resina se lava con disolvente orgánico entre cada paso de reacción química. [ 2 ] Las reacciones en SPPS se llevan a cabo de la siguiente manera: [ 8 ]

  1. La amina N-alfa del aminoácido C-terminal del péptido objetivo está protegida con un grupo Fmoc o Boc.
  2. El aminoácido protegido se acopla con grupos amino libres unidos a perlas de resina.
  3. Se elimina el grupo de protección (véase: Esquemas de grupos de protección ).
  4. El segundo aminoácido con un grupo protector N se une al primero. Los reactivos de acoplamiento facilitan la formación del enlace peptídico.
  5. El ciclo anterior se repite hasta que se haya sintetizado la secuencia deseada.
  6. Opcionalmente, el grupo amino N -terminal se somete a un proceso de bloqueo, evitando así que los péptidos residuales unidos a la resina que no hayan reaccionado sigan reaccionando.
  7. El enlace que mantiene unidos el péptido y la resina se rompe químicamente para liberar el péptido.
  8. El producto crudo se purifica utilizando uno de los siguientes métodos:
Síntesis de péptidos en fase sólida ( PG – grupo protector)

La SPPS está limitada por los rendimientos de reacción debido a la acumulación exponencial de subproductos, y típicamente los péptidos y proteínas en el rango de 40 o 50 residuos de aminoácidos están llevando al límite la accesibilidad sintética de los productos de SPPS como moléculas homogéneas de estructura química definida. [ 2 ] La dificultad sintética también depende de la secuencia; típicamente las secuencias propensas a la agregación como los amiloides [ 12 ] son ​​difíciles de hacer. Se puede acceder a péptidos más largos utilizando enfoques como la ligación química nativa , donde dos péptidos sintéticos no protegidos pueden condensarse covalentemente en solución acuosa.

Reactivos de acoplamiento de aminoácidos

Una característica importante que ha permitido la amplia aplicación de la SPPS es la generación de rendimientos extremadamente altos en la etapa de acoplamiento. [ 2 ] En la síntesis de péptidos por etapas mediante SPPS, se requieren condiciones de formación de enlaces amida altamente eficientes porque todos los productos peptídicos unidos a la resina se transfieren al producto crudo final liberado de la resina. Para ilustrar el impacto de rendimientos de acoplamiento subóptimos para la síntesis de péptidos, considérese el caso en que cada etapa de acoplamiento tuviera al menos un 99% de rendimiento: esto resultaría en un rendimiento crudo global del 77% para un péptido de 26 aminoácidos (suponiendo un rendimiento del 100% en cada desprotección); si cada acoplamiento fuera 95% eficiente, el rendimiento global sería del 25%. [ 13 ] [ 14 ] En intentos por maximizar los rendimientos de acoplamiento, a menudo se utiliza un gran exceso de cada aminoácido (entre 2 y 10 veces) en cada reacción de acoplamiento de SPPS. La minimización de la racemización de aminoácidos durante el acoplamiento también es de vital importancia para evitar la epimerización en el producto peptídico final.

La formación de un enlace amida entre una amina y un ácido carboxílico requiere reactivos de acoplamiento para activar el grupo carboxilo del aminoácido N-alfa protegido. Existe una amplia gama de reactivos de acoplamiento, debido en parte a su eficacia variable para acoplamientos particulares, [ 15 ] [ 16 ] muchos de estos reactivos están disponibles comercialmente.

Carbodiimidas

Formación de enlaces amida mediante DIC/HOBt. [ 14 ]

Las carbodiimidas como la diciclohexilcarbodiimida (DCC) y la diisopropilcarbodiimida (DIC) se utilizan frecuentemente para la formación de enlaces amida. [ 14 ] La reacción procede a través de la formación de una O - acilisourea altamente reactiva . Este intermedio reactivo es atacado por la amina N-terminal del péptido, formando un enlace peptídico. La formación de la O - acilisourea se produce más rápidamente en disolventes no polares como el diclorometano . [ 17 ]

El DIC es particularmente útil para la SPPS, ya que, al ser líquido, se dispensa fácilmente y el subproducto de urea se elimina con facilidad mediante lavado. Por el contrario, la carbodiimida relacionada 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) se usa a menudo para acoplamientos de péptidos en solución, ya que su subproducto de urea se puede eliminar mediante lavado durante el procesamiento acuoso . [ 14 ]

HOBt
HOAt
Efecto del grupo vecino de HOAt

La activación de la carbodiimida abre la posibilidad de racemización del aminoácido activado. [ 14 ] La racemización puede evitarse con aditivos "supresores de racemización" como los triazoles 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt) y 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol (HOAt). Estos reactivos atacan el intermedio O- acilisourea para formar un éster activo , que posteriormente reacciona con el péptido para formar el enlace peptídico deseado. [ 18 ] El cianohidroxiiminoacetato de etilo (Oxyma), un aditivo para el acoplamiento de carbodiimida, actúa como una alternativa al HOAt. [ 19 ]

Sales de amidinio y fosfonio

Para evitar la epimerización a través del intermedio O-acilisourea formado al usar un reactivo de carbodiimida, se puede emplear un reactivo de amidinio o fosfonio . Estos reactivos tienen dos partes: una porción electrófila que desoxigena el ácido carboxílico ( azul ) y una porción nucleófila enmascarada ( rojo ). El ataque nucleofílico del ácido carboxílico sobre la porción electrófila de amidinio o fosfonio conduce a un intermedio de corta duración que es rápidamente atrapado por el nucleófilo no enmascarado para formar el intermedio éster activado y un subproducto de urea o fosforamida . Estos reactivos catiónicos tienen contraaniones no coordinantes como un hexafluorofosfato o un tetrafluoroborato . [ 13 ] La identidad de este anión se indica típicamente por la primera letra en el acrónimo del reactivo, aunque la nomenclatura puede ser inconsistente. Por ejemplo, H BTU es una sal de hexafluorofosfato mientras que T BTU es una sal de tetrafluoroborato. Además de HBTU y HATU, otros reactivos comunes incluyen HCTU (6-ClHOBt), TCFH (cloruro) y COMU (ciano(hidroxiimino)acetato de etilo). Los reactivos de amidinio que incorporan fragmentos de hidroxibenzotriazol pueden existir en forma N (guanadinio) o en forma O (uronio), pero la forma N es generalmente más estable. [ 20 ] Los reactivos de fosfonio incluyen BOP (HOBt), PyBOP (HOBt) y PyAOP (HOAt). [ 21 ] Aunque estos reactivos pueden conducir a los mismos intermedios éster activados que un reactivo de carbodiimida, la velocidad de activación es mayor debido a la alta electrofilicidad de estos reactivos catiónicos. [ 22 ] Los reactivos de amidinio son capaces de reaccionar con el extremo N del péptido para formar un subproducto guanidino inactivo, mientras que los reactivos de fosfonio no lo son. [ 23 ]

anhídrido del ácido propanofosfónico

Desde finales de la década de 2000, el anhídrido de ácido propanofosfónico , comercializado bajo diversos nombres como "T3P", se ha convertido en un reactivo útil para la formación de enlaces amida en aplicaciones comerciales. Convierte el oxígeno del ácido carboxílico en un grupo saliente , cuyos subproductos de acoplamiento peptídico son solubles en agua y se pueden eliminar fácilmente mediante lavado. En una comparación de rendimiento entre el anhídrido de ácido propanofosfónico y otros reactivos de acoplamiento peptídico para la preparación de un fármaco nonapeptídico, se encontró que este reactivo era superior a otros reactivos en cuanto a rendimiento y baja epimerización. [ 24 ]

Soportes sólidos

El poliestireno reticulado es el soporte sólido más común utilizado en SPPS. Esta imagen es incorrecta: el agente reticulante es meta-divinilbenceno.

Los soportes sólidos para la síntesis de péptidos se seleccionan por su estabilidad física, lo que permite la rápida filtración de líquidos. Los soportes adecuados son inertes a los reactivos y disolventes utilizados durante la SPPS y permiten la unión del primer aminoácido. [ 25 ] La hinchazón es de gran importancia porque la síntesis de péptidos tiene lugar dentro de las perlas de resina hinchadas con disolvente. [ 26 ]

El principal tipo de soporte sólido es la resina de copolímero de suspensión polimerizado (1% m-divinilo + estireno) en perlas. [ 25 ] Las mejoras en los soportes sólidos utilizados para la síntesis de péptidos aumentan su capacidad para soportar el uso repetido de TFA durante la etapa de desprotección de SPPS. [ 27 ] Se utilizan dos resinas principales, según se desee un ácido carboxílico o una amida en el extremo C. La resina Wang era, a partir de 1996, la resina más utilizada para péptidos con ácidos carboxílicos en el extremo C-terminal. [ 28 ]

Planes de protección para grupos

Como se describió anteriormente, el uso de grupos protectores en el extremo N-terminal y en las cadenas laterales es esencial durante la síntesis de péptidos para evitar reacciones secundarias indeseables, como el autoacoplamiento del aminoácido activado que conduce a la polimerización . [ 1 ] Esto competiría con la reacción de acoplamiento de péptidos prevista, lo que resultaría en un bajo rendimiento o incluso en la imposibilidad total de sintetizar el péptido deseado.

En la síntesis de péptidos en fase sólida se suelen utilizar dos esquemas principales de grupos protectores: los denominados enfoques Boc/bencilo y Fmoc/ terc- butilo. [ 2 ] La estrategia Boc/Bzl utiliza protección Boc N-terminal lábil a TFA junto con protección de cadena lateral que se elimina mediante fluoruro de hidrógeno anhidro durante la etapa de escisión final (con escisión simultánea del péptido del soporte sólido). La SPPS Fmoc/tBu utiliza protección Fmoc N-terminal lábil a base, [ 29 ] con protección de cadena lateral y un enlace de resina lábiles a ácido (la escisión ácida final se lleva a cabo mediante tratamiento con TFA). Ambos enfoques, incluyendo las ventajas y desventajas de cada uno, se describen con más detalle a continuación.

Boc/Bzl SPPS

Escisión del grupo Boc

Antes de la llegada de la SPPS, los métodos en solución para la síntesis química de péptidos se basaban en el terc -butoxicarbonilo (abreviado como 'Boc') como grupo protector α-amino N-terminal temporal. El grupo Boc se elimina con un ácido, como el ácido trifluoroacético (TFA). Esto forma un grupo amino con carga positiva en presencia de un exceso de TFA (nótese que el grupo amino no está protonado en la imagen de la derecha), que se neutraliza y se acopla al aminoácido activado entrante. [ 30 ] La neutralización puede ocurrir antes del acoplamiento o in situ durante la reacción de acoplamiento básico.

El método Boc/Bzl conserva su utilidad para reducir la agregación de péptidos durante la síntesis. [ 31 ] Además, la SPPS con Boc/bencilo puede preferirse al método Fmoc/ tert- butilo al sintetizar péptidos que contienen fragmentos sensibles a las bases (como depsipéptidos o fragmentos tioéster), ya que se requiere tratamiento con base durante el paso de desprotección de Fmoc (ver más adelante).

Los grupos protectores de cadena lateral permanentes utilizados durante la SPPS con Boc/bencilo suelen ser grupos bencilo o basados ​​en bencilo. [ 1 ] La eliminación final del péptido del soporte sólido se produce simultáneamente con la desprotección de la cadena lateral mediante fluoruro de hidrógeno anhidro por escisión hidrolítica. El producto final es una sal de fluoruro que es relativamente fácil de solubilizar. Se deben añadir agentes captadores como el cresol al HF para evitar que los cationes reactivos generen subproductos no deseados.

Fmoc/ t Bu SPPS

Ruptura del grupo Fmoc. El tratamiento de la amina protegida con Fmoc con piperidina produce la abstracción de un protón del grupo metino del sistema de anillo fluorenilo . Esto conduce a la liberación de un carbamato , que se descompone en dióxido de carbono ( CO₂ ) y la amina libre. También se genera dibenzofulveno . Esta reacción puede ocurrir debido a la acidez del protón fluorenilo , resultante de la estabilización del anión aromático formado. El subproducto dibenzofulveno puede reaccionar con nucleófilos como la piperidina (que se encuentra en gran exceso) o, potencialmente, con la amina liberada. [ 32 ]

El uso del esquema de desprotección de Fmoc N-terminal es verdaderamente ortogonal bajo condiciones de SPPS. [ 33 ] La desprotección de Fmoc es una reacción de eliminación catalizada por base que normalmente utiliza 20–50% de piperidina en DMF . [ 25 ] La funcionalidad alfa-amina revelada es, por lo tanto, neutra, y en consecuencia no se requiere neutralización de la resina peptídica, como en el caso del enfoque Boc/Bzl. Sin embargo, la falta de repulsión electrostática entre las cadenas peptídicas puede conducir a un mayor riesgo de agregación con Fmoc/ t Bu SPPS. Debido a que el grupo fluorenilo liberado es un cromóforo, la desprotección de Fmoc puede ser monitoreada por absorbancia UV de la mezcla de reacción, una estrategia que se emplea en sintetizadores de péptidos automatizados.

La capacidad del grupo Fmoc para ser escindido en condiciones básicas relativamente suaves, a la vez que es estable al ácido, permite el uso de grupos protectores de cadena lateral como Boc y tBu que pueden eliminarse en condiciones de escisión final ácidas más suaves (TFA) que las utilizadas para la escisión final en Boc/Bzl SPPS (HF). Los agentes secuestrantes como el agua y el triisopropilsilano (TIPS) se añaden comúnmente durante la escisión final para prevenir reacciones secundarias con especies catiónicas reactivas liberadas como resultado de la desprotección de la cadena lateral. Sin embargo, también se podrían utilizar muchos otros compuestos secuestrantes. [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] El péptido crudo resultante se obtiene como una sal de TFA, que es potencialmente más difícil de solubilizar que las sales de fluoruro generadas en Boc SPPS.

La síntesis de péptidos en fase sólida ( SPPS) con grupos Fmoc/ tBu es menos eficiente en términos de economía atómica , ya que el grupo fluorenilo tiene una masa mucho mayor que el grupo Boc. Además, los precios de los aminoácidos Fmoc fueron elevados hasta que, en la década de 1990, se inició el desarrollo a gran escala de uno de los primeros fármacos peptídicos sintetizados, el enfuvirtida , momento en el que la demanda del mercado ajustó los precios relativos de los aminoácidos Fmoc frente a los aminoácidos Boc.

Otros grupos protectores

Benciloxicarbonilo

El grupo (Z) es otro grupo protector de amina de tipo carbamato, descubierto por Leonidas Zervas a principios de la década de 1930 y generalmente añadido mediante reacción con cloroformiato de bencilo . [ 37 ]

Introducción del grupo protector Z mediante reacción con cloroformiato de bencilo (cloruro Z).

Se elimina en condiciones severas utilizando HBr en ácido acético , o en condiciones más suaves de hidrogenación catalítica .

Esta metodología fue utilizada por primera vez en la síntesis de oligopéptidos por Zervas y Max Bergmann en 1932. [ 38 ] Por lo tanto, se la conoció como la síntesis de Bergmann-Zervas, que se caracterizó como "trascendental" y ayudó a establecer la química de péptidos sintéticos como un campo distinto. [ 37 ] Constituyó el primer método de laboratorio útil para la síntesis controlada de péptidos, permitiendo la síntesis de péptidos previamente inalcanzables con cadenas laterales reactivas, mientras que también se evita la racemización de aminoácidos protegidos con Z. [ 37 ] [ 38 ]

El uso del método de Bergmann-Zervas siguió siendo la práctica estándar en la química de péptidos durante dos décadas completas después de su publicación, siendo reemplazado por métodos más nuevos (como el grupo protector Boc) a principios de la década de 1950. [ 37 ] Hoy en día, si bien se ha utilizado periódicamente para la protección de α-aminas, se utiliza mucho más comúnmente para la protección de cadenas laterales.

Grupos de asignación y otros grupos diversos

El grupo protector aliloxicarbonilo (alloc) se utiliza a veces para proteger un grupo amino (o un grupo ácido carboxílico o alcohol) cuando se requiere un esquema de desprotección ortogonal . También se utiliza en ocasiones al realizar la formación de péptidos cíclicos en resina, donde el péptido se une a la resina mediante un grupo funcional de cadena lateral. El grupo Alloc se puede eliminar utilizando tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) . [ 39 ]

Para aplicaciones especiales como los pasos sintéticos que involucran microarrays de proteínas , se utilizan grupos protectores a veces denominados "litográficos", que son susceptibles a la fotoquímica a una longitud de onda de luz particular y, por lo tanto, pueden eliminarse durante operaciones de tipo litográfico . [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]

Formación regioselectiva de enlaces disulfuro

La formación de múltiples disulfuros nativos sigue siendo un desafío para la síntesis de péptidos nativos mediante métodos de fase sólida. La combinación aleatoria de cadenas suele dar como resultado varios productos con enlaces disulfuro no nativos. [ 44 ] La formación gradual de enlaces disulfuro es generalmente el método preferido, y se realiza con grupos protectores tiol. [ 45 ] Diferentes grupos protectores tiol proporcionan múltiples dimensiones de protección ortogonal. Estas cisteínas protegidas ortogonalmente se incorporan durante la síntesis de fase sólida del péptido. La eliminación sucesiva de estos grupos, para permitir la exposición selectiva de grupos tiol libres, conduce a la formación de disulfuro de manera gradual. El orden de eliminación de los grupos debe considerarse de manera que solo se elimine un grupo a la vez.

Los grupos protectores de tiol utilizados en la síntesis de péptidos que requieren la formación regioselectiva posterior de enlaces disulfuro deben poseer múltiples características. [ 46 ] [ 47 ] Primero, deben ser reversibles con condiciones que no afecten las cadenas laterales no protegidas. Segundo, el grupo protector debe ser capaz de soportar las condiciones de la síntesis en fase sólida. Tercero, la eliminación del grupo protector de tiol debe ser tal que deje intactos otros grupos protectores de tiol, si se desea una protección ortogonal. Es decir, la eliminación de PG A no debe afectar a PG B. Algunos de los grupos protectores de tiol comúnmente utilizados incluyen los grupos acetamidometilo (Acm), terc -butilo (But), 3-nitro-2-piridinasulfenilo (NPYS), 2-piridinasulfenilo (Pyr) y tritilo (Trt). [ 46 ] Es importante destacar que el grupo NPYS puede reemplazar al PG Acm para producir un tiol activado. [ 48 ]

Utilizando este método, Kiso y colaboradores informaron la primera síntesis total de insulina en 1993. [ 49 ] En este trabajo, la cadena A de la insulina se preparó con los siguientes grupos protectores en sus cisteínas: CysA6(But), CysA7(Acm) y CysA11(But), dejando CysA20 sin protección. [ 49 ]

Síntesis de péptidos asistida por microondas

La síntesis de péptidos asistida por microondas se utiliza frecuentemente para ayudar a la SPPS de química Fmoc. [ 50 ] [ 51 ]

Síntesis de péptidos en fase sólida de flujo continuo

El primer artículo relacionado con la síntesis de péptidos en flujo continuo se publicó en 1986, [ 52 ] pero debido a limitaciones técnicas, no fue hasta principios de la década de 2010 cuando más grupos académicos comenzaron a utilizar el flujo continuo para la síntesis rápida de péptidos. [ 53 ] [ 54 ] Las ventajas del flujo continuo sobre los métodos tradicionales por lotes son la capacidad de calentar reactivos con un buen control de temperatura, lo que permite la velocidad de la cinética de reacción mientras se minimizan las reacciones secundarias. [ 55 ] Los tiempos de ciclo varían de 30 segundos a 6 minutos, dependiendo de las condiciones de reacción y el exceso de reactivo.

Gracias a los análisis en línea, como la espectroscopia UV/Vis y el uso de un reactor de flujo de lecho variable (VBFR) que monitoriza el volumen de resina, se puede identificar la agregación en la resina y evaluar la eficiencia de acoplamiento. [ 56 ]

Síntesis de péptidos largos

La elongación por etapas, en la que se añaden aminoácidos consecutivos uno a uno, es ideal para péptidos pequeños que contienen entre 2 y 40 (en raras ocasiones, hasta 50) residuos de aminoácidos. Para la síntesis de cadenas polipeptídicas más largas se utiliza la condensación de segmentos , en la que se acoplan segmentos peptídicos no protegidos. [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] Aunque la SPPS por etapas se utiliza a menudo para hacer cadenas peptídicas más largas, la pureza de las cadenas peptídicas largas obtenidas mediante SPPS por etapas se ve comprometida por la acumulación de subproductos unidos a la resina que se forman en cada paso. La condensación de segmentos mediante ligación química nativa se prefiere a la elongación por etapas para sintetizar cadenas peptídicas largas de estructura química definida. [ 60 ]

Un avance importante para la producción de cadenas peptídicas más largas es la ligación química , en la que las cadenas peptídicas no protegidas se condensan quimioselectivamente en solución acuosa mediante la formación de un enlace no peptídico. La reacción más utilizada es la ligación química nativa, en la que un tioéster peptídico reacciona con un residuo de cisteína N-terminal. [ 61 ]

Los métodos para unir covalentemente polipéptidos producidos recombinantemente en solución acuosa incluyen inteínas divididas , [ 62 ] la formación espontánea de enlaces isopeptídicos [ 63 ] y la ligación de sortasa . [ 64 ]

Para optimizar la síntesis de péptidos largos , se desarrolló en Medicon Valley un método para convertir secuencias peptídicas . Se incorpora una presecuencia simple (por ejemplo, lisina (Lysn); ácido glutámico (Glun); (LysGlu)n) en el extremo C-terminal del péptido para inducir una estructura similar a una hélice alfa . Esto puede aumentar potencialmente la vida media biológica , mejorar la estabilidad del péptido e inhibir la degradación enzimática sin alterar la actividad farmacológica ni el perfil de acción. [ 65 ] [ 66 ]

Péptidos cíclicos

Sobre la ciclación de resinas

Los péptidos pueden ciclarse en un soporte sólido. Se pueden utilizar diversos reactivos de ciclación, como HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA y PyClock/DIEA. [ 67 ] Los péptidos cabeza-cola pueden sintetizarse en el soporte sólido. La desprotección del extremo C en un punto adecuado permite la ciclación en resina mediante la formación de un enlace amida con el extremo N desprotegido. Una vez que se ha producido la ciclación, el péptido se separa de la resina mediante acidólisis y se purifica. [ 68 ] [ 69 ]

La estrategia para la síntesis en fase sólida de péptidos cíclicos no se limita a la unión a través de las cadenas laterales de Asp, Glu o Lys. La cisteína posee un grupo sulfhidrilo muy reactivo en su cadena lateral. Se crea un puente disulfuro cuando un átomo de azufre de una cisteína forma un enlace covalente simple con otro átomo de azufre de una segunda cisteína en una parte diferente de la proteína. Estos puentes ayudan a estabilizar las proteínas, especialmente las secretadas por las células. Algunos investigadores utilizan cisteínas modificadas con S-acetamidometilo (Acm) para bloquear la formación del enlace disulfuro, pero preservando la cisteína y la estructura primaria original de la proteína. [ 70 ]

Ciclación fuera de la resina

La ciclación fuera de resina consiste en una síntesis en fase sólida de intermedios clave, seguida de la ciclación clave en fase de solución. La desprotección final de cualquier cadena lateral enmascarada también se lleva a cabo en fase de solución. Esto presenta las desventajas de que la eficiencia de la síntesis en fase sólida se pierde en las etapas en fase de solución, que se requiere la purificación de subproductos, reactivos y material no convertido, y que pueden formarse oligómeros no deseados si se produce la formación de macrociclos . [ 71 ]

El uso de ésteres de pentafluorofenilo (FDPP, [ 72 ] PFPOH [ 73 ] ) y BOP-Cl [ 74 ] son ​​útiles para la ciclación de péptidos.

Ciclación simultánea/liberación de resina

Se pueden introducir pequeñas fracciones cíclicas C-terminales como γ- , δ- y ε-lactamas en péptidos sintetizados en enlaces lábiles a bases desprotegiendo el aminoácido C-terminal que lleva una amina en su cadena lateral y permitiendo que se ciclice, liberando así el péptido de la resina en el proceso. [ 75 ]

Historia

El primer péptido protegido fue sintetizado por Theodor Curtius en 1882 y el primer péptido libre fue sintetizado por Emil Fischer en 1901. [ 3 ]

Véase también

Referencias

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