Protide

The ProTide technology is a prodrug approach used in molecular biology and drug design. It is designed to deliver nucleotide analogues (as monophosphate) into the cell (ProTide: PROdrug + nucleoTIDE). This technology was invented by Professor Chris McGuigan from the School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences at Cardiff University in the early 1990s. ProTides form a critical part of antiviral drugs such as sofosbuvir, tenofovir alafenamide, and remdesivir.^[1]

The first demonstration of the ProTide approach was made in 1992, when the efficiency of aryloxy phosphates and phosphoramidates was noted.^[2] In particular, diaryl phosphates were prepared from zidovudine (AZT) using simple phosphorochloridate chemistry. For the first time, the anti-HIV activity of these phosphate derivatives of AZT exceeded that of the parent nucleoside in some cases. Moreover, while AZT was almost inactive (EC⁵⁰ 100μM) in the JM cell line, the substituted diaryl phosphate was 10 times more active (EC⁵⁰ 10μM). At the time, JM was considered AZT-insensitive due to poor phosphorylation. It later emerged that an AZT-efflux pump was the source of this poor AZT sensitivity. However, the conclusion remains valid that the diaryl phosphate was more able to retain activity in the JM cell line and that this may imply a (small) degree of intracellular phosphate delivery. The electron-withdrawing power of the p-nitro groups and putative enhancements in aryl leaving group ability were suggested as the major driving force of this SAR.

Posteriormente, se preparó una serie de ariloxifosforamidatos de AZT con varios sustituyentes p-arilo y varios aminoácidos . ^{[ 3 ]} Estos compuestos se estudiaron exclusivamente en la línea celular JM resistente a AZT para explorar la posible liberación (implícita) de AZT-monofosfato, y el fosforamidato de alanina demostró ser excepcionalmente efectivo. En todos los cultivos de JM infectados con VIH-1 , el AZT se inhibió a una concentración de 100 μM, mientras que el fosforamidato de fenil metoxi alaninilo fue activo a 0,8 μM. Esto se tomó como la primera evidencia de una administración exitosa de nucleótidos . También se observó que en otras series, había una marcada preferencia por la alanina sobre la leucina (10 veces) y la glicina (>100 veces). Además, aunque la sustitución arílica atractora de electrones había demostrado ser altamente efectiva en sistemas diarílicos, fue perjudicial en este contexto. La sustitución de flúor en posición para tuvo un ligero efecto adventicio, pero no significativo, mientras que la sustitución de nitro en posición para provocó una pérdida de actividad de 100 veces. En un estudio posterior, se amplió el rango de sustituyentes arilo y se probaron compuestos en líneas celulares TK+ ( competentes en timidina quinasa ) y TK- (deficientes en timidina quinasa). Ninguno de los fosforamidatos conservó la alta potencia (2–4 nM) del AZT en líneas celulares competentes en timidina quinasa (CEM y MT-4) contra el VIH-1 o el VIH-2 . ^{[ 4 ]} Sin embargo, mientras que el AZT perdió toda su actividad en la línea celular deficiente en timidina quinasa CEM/TK-, la mayoría de los fosforamidatos conservaron la actividad antiviral, siendo así aproximadamente >10–35 veces más activos que el AZT en este ensayo. Nuevamente, la alanina se destacó como un componente importante, mientras que el análogo de glicina resultó inactivo en cultivos CEM/TK- infectados con VIH. En este ensayo, la leucina y la fenilalanina fueron tan efectivas como la alanina, aunque menos en los ensayos CEM/TK+. Por lo tanto, el fosforamidato de fenil metoxi alanilo original se reveló como un compuesto prometedor.

La estavudina (d4T) fue una aplicación temprana del enfoque ProTide. ^{[ 5 ]} Esta fue una elección racional basada en la cinética conocida de la fosforilación de d4T. Así, mientras que la segunda fosforilación (AZT-monofosfato a AZT-difosfato) pero no la primera fosforilación (AZT a AZT-monofosfato) se considera limitante de la velocidad para la activación de AZT a trifosfato, se piensa que el primer paso (d4T a d4T monofosfato) es en general el paso lento para d4T. Por lo tanto, una administración intracelular de (mono)nucleótido debería tener un impacto máximo para d4T y nucleósidos similares. En primera instancia, se prepararon (halo)alquiloxi fosforamidatos de d4T y se encontró que conservaban la actividad en células JM resistentes a d4T. La actividad dependía del grupo haloalquilo; el sistema propilo original era poco activo. Estudios posteriores en cultivos de células CEM/TK- infectadas por el VIH revelaron que los fosforamidatos de ariloxi de d4T son altamente efectivos y, notablemente, conservan toda su actividad en las células CEM/TK-. En este estudio, el éster bencílico resultó ser ligeramente más potente que el compuesto metílico original, siendo casi 10 veces más activo que d4T en ensayos con células CEM/TK+ y, por lo tanto, aproximadamente 300-500 veces más activo que d4T en ensayos con células CEM/TK-.

Los profármacos ProTide son útiles para administrar fármacos que contienen fosfonatos a tipos celulares con alta expresión de CTSA y CES1 , como las células inmunitarias. El tenofovir alafenamida es un ejemplo exitoso de esta iteración. Los ProTides también son útiles para análogos de nucleósidos que no se fosforilan eficientemente por las nucleósido quinasas endógenas. Para el nucleósido GS-334750, precursor del sofosbuvir, la fosforilación por nucleósido quinasas se anula prácticamente por completo, y la única forma de administrar el nucleótido activo es mediante ProTide. Una limitación importante de los ProTides es que requieren la expresión de esterasas como CTSA y CES1, que es muy alta en algunos tipos celulares como los hepatocitos y resulta ventajosa para el tratamiento de la hepatitis C con sofosbuvir.

Se realizaron estudios exhaustivos sobre estos prometedores derivados de d4T y la tecnología ProTide se aplicó con éxito a una amplia gama de análogos de nucleósidos. ^{[ 6 ] [ 7 ]} En particular, el enfoque ProTide se ha utilizado en varios análogos de nucleósidos anti- VHC evaluados clínicamente , incluido el compuesto sofosbuvir , aprobado por la FDA en 2013 , y el compuesto tenofovir alafenamida , aprobado por la FDA en 2016. Remdesivir también utiliza la tecnología de profármacos ProTide (la autoinmolación es el principio clave de los profármacos de nucleótidos ProTide ^{[ 8 ]} ). Debido a que el nucleósido GS-441524 puede fosforilarse y activarse, algunos investigadores han argumentado que la aplicación de ProTide es una complicación innecesaria en el diseño de Remdesivir y que el nucleósido original sería un fármaco más barato y eficaz contra la COVID-19 . ^{[ 9 ] [ 10 ]}

Se han probado los ProTides para administrar metabolitos fosforilados clave en errores congénitos del metabolismo, como el fosfopantotenato para la deficiencia de PANK2 ; sin embargo, estos fueron un fracaso clínico. ^{[ 11 ]}