TOPBP1

El gen TOPBP1 codifica una proteína andamio que facilita las interacciones entre diferentes proteínas en momentos y lugares específicos. Logra estas interacciones con otros socios proteicos a través de sus dominios BRCT ( gen 1 asociado al cáncer de mama , extremo C ). ^{[ 10 ]} Un dominio BRCT se define estructuralmente por una lámina β de 4 miembros que está flanqueada por una hélice α (α2) y otras dos hélices α (α1 y α3). Los residuos de aminoácidos que componen estas características centrales están altamente conservados, con desviaciones específicas de la proteína que ocurren en los bucles que conectan estas subunidades. ^{[ 13 ] [ 14 ]} Los dominios BRCT actúan canónicamente en pares, con un dominio actuando como aceptor para socios de unión fosforilados y el otro dominio poseyendo un motivo de unión que proporciona especificidad. Estos pares están separados por una secuencia de enlace que varía según la proteína. Los dominios emparejados se asocian mediante interacciones de empaquetamiento hidrofóbico que ocurren entre la hélice α2 del dominio BRCT N-terminal y las hélices α1 y α3 del dominio BRCT C-terminal . Estas interacciones facilitan la unión del dominio BRCT con socios de unión fosforilados. ^{[ 13 ]} Por el contrario, los dominios BRCT también pueden existir como dominios únicos o como una fusión de dos dominios diferentes.

La proteína humana TOPBP1 posee nueve dominios BRCT únicos, cuatro de los cuales se conservan del homólogo de la levadura Dpb11 (es decir, BRCT1,2 y BRCT4,5). ^{[ 15 ]} En la TOPBP1 humana, los dominios BRCT0, BRCT1 y BRCT2 existen de forma exclusiva en forma de triple dominio, a diferencia del doble dominio canónico de la levadura Dpb11. Solo los dominios BRCT3 y BRCT6 existen como dominios simples y podrían no ser capaces de unirse a fosfoproteínas asociadas. ^{[ 10 ] [ 13 ]} La TOPBP1 también contiene un dominio de activación de ATR (AAD) ubicado entre los dominios BRCT6 y BRCT7. ^{[ 10 ] [ 15 ]} Mediante estas interacciones específicas de BRCT, la TOPBP1 media la reparación del daño del ADN, la replicación del ADN, la transcripción y la mitosis. ^{[ 10 ]}

Para regular su actividad, se ha descubierto que TOPBP1 se auto-oligomeriza en los dominios BRCT7/8, en respuesta al estrés replicativo. ^{[ 16 ]}

TOPBP1 se identificó por primera vez como una proteína de daño al ADN a través de su asociación con BRCA1 , una proteína fuertemente implicada en la patología del cáncer de mama. Se encontró que TOPBP1 formaba un complejo con BRCA1 en sitios independientes de las horquillas de replicación (es decir, identificados por el antígeno nuclear de células proliferantes, una pinza de replicación del ADN ) durante la fase S normal . Cuando se indujo daño al ADN a niveles más altos mediante irradiación gamma , hubo un aumento de TOPBP1/BRCA1 en sitios alejados de las horquillas de replicación. Por el contrario, cuando las horquillas de replicación se detuvieron con hidroxiurea para generar estrés de replicación del ADN , se encontró TOPBP1/BRCA1 en los sitios de las horquillas de replicación. ^{[ 17 ] [ 18 ]} Esto demostró una función específica de daño al ADN para el reclutamiento de TOPBP1 tanto en sitios de replicación como en sitios no replicativos. Para mediar en estos aspectos de la reparación del ADN, se encontró que TOPBP1 se asocia con Rad9 , que forma un complejo con Rad1 y Hus1 , denominado pinza de reparación del ADN 9-1-1. ^{[ 13 ] [ 15 ] [ 17 ] [ 19 ] [ 20 ]} TOPBP1 se une a Rad9 con sus dominios BRCT0/1/2. Se encontró que el dominio BRCT1 es directamente responsable de mediar la interacción dependiente de la fosforilación con Rad9. ^{[ 13 ]}

La reparación del daño del ADN es iniciada y mantenida por dos quinasas, la proteína ATM (ataxia-telangiectasia mutada) y ATR , siendo ATR más importante para el mantenimiento del genoma. ^{[ 17 ]} Se ha demostrado que TOPBP1 es un activador de ATR, lo que conduce a un aumento en la actividad quinasa de ATR. ^{[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]} Tras los daños en el ADN que provocan roturas de doble cadena (DSB) y la posterior resección mediada por reparación, se exponen largas secuencias de ADN monocatenario (ssDNA). Este ssDNA se recubre con la proteína de replicación A (RPA) . ATR se dirige con éxito al ssDNA recubierto de RPA mediante la proteína de interacción con ATR (ATRIP). La unión del ssDNA recubierto de RPA y el ADN bicatenario (dsDNA) intacto es donde se reclutan TOPBP1 y la pinza 9-1-1. ^{[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]} Además de TOPBP1, también se ha descubierto que ATR es activada por la proteína ETAA1, específica de ssDNA e interactuante con RPA. ^{[ 21 ]}

El reclutamiento de TOPBP1/9-1-1 se lleva a cabo independientemente de ATRIP/ATR, que actúa como un mecanismo regulador que previene la activación prematura y no específica de la vía de respuesta al daño del ADN. ^{[ 20 ] [ 22 ]} TOPBP1 interactúa con ATR a través de su dominio activador de ATR (AAD), que se encuentra entre los dominios BRCT 6 y 7. ^{[ 13 ] [ 17 ]} El dominio AAD de TOPBP1 por sí solo es suficiente para activar la actividad de la quinasa ATR in vitro. La reducción de la expresión del gen TOPBP1 conduce a una disminución de la fosforilación de los objetivos de la quinasa ATR posteriores. ^{[ 17 ]} El mecanismo de activación específico de ATR aún se desconoce, pero se cree que la unión de TOPBP1 a ATR induce un cambio conformacional que promueve la catálisis por encima de la actividad basal de la quinasa. ^{[ 17 ] [ 19 ]} Tras la activación de ATR, es capaz de fosforilar factores asociados al daño del ADN posteriores, siendo el efector principal la quinasa Chk1. ^{[ 17 ] [ 20 ] [ 23 ]}

La proteína TOPBP1 recombinante es suficiente para la activación de ATR, lo que indica que la regulación de la actividad de TOPBP1 no se produce mediante modificaciones postraduccionales . Por lo tanto, se cree que está regulada por la localización subcelular (es decir, el movimiento al núcleo para su activación) y/o la concentración de proteína. ^{[ 17 ]} Esto se ve respaldado además por el hecho de que TOPBP1 reduce la K _m de ATR para sus diversos sustratos. ^{[ 22 ]} Además, TOPBP1 puede ser fosforilada por ATM, lo que aumenta la eficiencia de la activación de ATR mediada por TOPBP1. ^{[ 20 ]}

El complejo CIP2A - MDC1 -TOPBP1 se utiliza en la reparación de daños en el ADN durante la meiosis en los ovocitos . ^{[ 24 ]} Este proceso de reparación ocurre a través del reclutamiento, dependiente de microtúbulos , del complejo CIP2A-MDC1-TOPBP1 desde el polo del huso hacia los cromosomas . ^{[ 24 ]}

La proteína humana TOPBP1 es necesaria para el inicio de la replicación del ADN mediante su asociación con las proteínas Treslin, CDC45 y RecQ4 . En levaduras, se ha demostrado que el homólogo de TOPBP1, Dpb11, recluta la ADN polimerasa ε (Polε) y el complejo GINs al ​​origen de replicación , que ha sido previamente cargado con el complejo de mantenimiento de minicromosomas ( MCM ). Esto se logra mediante la unión a Sld2 (factor asociado a Polε) y Sld3 (factor asociado a CDC45) de forma dependiente de la fosforilación por cinasas dependientes de ciclinas (CDK) . Esto conduce a la formación del complejo de preiniciación, es decir, la helicasa replicativa CDC45-MCM-GINS (CMG). En resumen, TOPBP1 actúa como una proteína andamiaje que facilita las interacciones necesarias para la formación del complejo de preiniciación de la replicación del ADN. En humanos, el mecanismo aún no se comprende completamente, pero TOPBP1 interactúa con RecQ4 (Sld2) y Treslin (Sld3). ^{[ 10 ] [ 19 ]}

También se ha demostrado que TOPBP1 interactúa con otra helicasa de ADN, la helicasa de ADN B (HELB), que forma parte de la superfamilia de helicasas 1B y participa tanto en la replicación como en la reparación del ADN. Esta interacción entre TOPBP1 y HELB también se ha relacionado con la iniciación de la replicación del ADN mediada por CDC45. ^{[ 25 ]}

TOPBP1 regula la transcripción genética mediante interacciones directas con factores de transcripción, como E2F-1 y Miz1. La familia de factores de transcripción E2F media la expresión de una multitud de genes implicados en diversas funciones, como la proliferación celular, el desarrollo, la respuesta al daño del ADN y la apoptosis. Está fuertemente implicada en la vía de replicación del ADN mediante la regulación de genes en la vía supresora de tumores del retinoblastoma (Rb) . Un ejemplo de ello es E2F-1 , que media la transición de la fase G1 a la fase S. ^{[ 17 ] [ 26 ]} Cuando se detecta daño en el ADN, TOPBP1 se une a E2F-1 a través de su dominio BRCT6. Esto inhibe la capacidad de E2F-1 para inducir la apoptosis mediada por transcripción y la transición a la fase S. ^{[ 17 ]} Se cree que la inducción de un estado transcripcional represivo en genes relacionados con la apoptosis se debe al reclutamiento, mediado por TOPBP1, de máquinas de remodelación de la cromatina, por ejemplo, histona deacetilasas (HDAC). ^{[ 10 ]} La unión de TOPBP1 a E2F-1 depende tanto de la fosforilación de Ser1159 en TOPBP1 mediada por Akt como de la oligomerización de TOPBP1 en sus dominios BRCT 7 y 8. ^{[ 17 ]}

El estrés de replicación ocurre cuando la horquilla de replicación se detiene y no puede avanzar. Este fenómeno puede ser causado por activación inducida por oncogenes, estructuras difíciles de replicar, colisiones de transcripción/replicación, desacoplamiento de la polimerasa, privación de dNTP y otras fuentes. En estos casos, las células progresarán a mitosis antes de que la replicación esté completa. En un intento por terminar la replicación de ADN remanente, la célula iniciará la síntesis de ADN mitótico (MiDAS). TOPBP1 es responsable de reclutar la proteína de andamiaje esencial de MiDAS, SLX4 , que forma un gran complejo de nucleasa . ^{[ 16 ]} Los mecanismos propuestos para la MiDAS mediada por TOPBP1/SLX4 son el reinicio de la horquilla de replicación y/o la resolución de intermediarios de recombinación homóloga que fueron responsables de terminar la replicación. ^{[ 16 ]} A medida que avanza la mitosis , la cantidad de ADN asociado a TOPBP1 disminuye, lo que indica ADN reparado.

Durante la mitosis , las cromátidas hermanas pueden enredarse y no pueden separarse al comenzar la anafase normal . Estas estructuras enredadas se denominan puentes de cromatina y, si no se resuelven, pueden provocar aneuploidía . ^{[ 8 ]} Un subconjunto específico de estas cromátidas enredadas son los puentes anafásicos ultrafinos (UFB). Se caracterizan por la ausencia de histonas y la imposibilidad de detectarlos mediante métodos convencionales de tinción de ADN. ^{[ 27 ]} Existe evidencia de que la topoisomerasa II-α (TOP2A) es capaz de resolver los UFB en el centrómero , ya que la disminución de TOP2A produce más UFB tras la mitosis. Estos UFB centroméricos se encuentran normalmente durante la mitosis, pero disminuyen a medida que el ciclo celular progresa con normalidad. Esto sugiere que los UFB son un resultado normal de la mitosis y que TOP2A puede desempeñar un papel en su resolución antes de que la célula salga del ciclo celular, previniendo así resultados adversos ^{[ 8 ]} Se encontró que TOPBP1 se localiza tanto en los UFB como en TOP2A, una interacción conservada que se encuentra en el homólogo de levadura Dpb11. Como TOPBP1 es una proteína andamiaje conocida, parece estar reclutando a TOP2A a los UFB para su eventual resolución. Se encontró que la unión de TOPBP1 a los UFB actúa a través del residuo de lisina 704 altamente conservado en el dominio BRCT5. ^{[ 8 ]} Sin embargo, aún no se sabe exactamente cómo TOPBP1 recluta a TOP2A a los UFB. Se ha demostrado que los dominios BRCT7/8 de TOPBP1 interactúan con TOP2A, pero estos dominios no se encuentran en el homólogo de levadura Dpb11, por lo que se plantea la hipótesis de que la región de enlace encontrada entre BRCT7 y BRCT8 puede ser responsable del reclutamiento de TOP2A. ^{[ 8 ]}

Los cambios en la expresión del gen TOPBP1 están asociados con el cáncer de mama , glioblastoma , cáncer de pulmón de células no pequeñas y sarcomas . ^{[ 10 ] [ 17 ] [ 11 ]} En un estudio, se encontraron niveles aumentados de proteína TOPBP1 en 46 de 79 (58,2%) de muestras de cáncer de mama primario evaluadas, y este aumento en la expresión se asoció con una disminución en la supervivencia del paciente (40 vs. 165 meses; p = 0,003) y un aumento en el grado histológico del cáncer (66,7% vs. 35,5% grado; p = 0,007). ^{[ 10 ] [ 11 ]} En tejido mamario sano, la expresión de la proteína TOPBP1 solo fue detectable en 2 de 47 (4,26%) muestras recolectadas. En contraste con este hallazgo, otro estudio encontró una disminución en la expresión del gen TOPBP1 por RT-PCR en 127 pacientes con cáncer de mama. Aunque la expresión de la proteína TOPBP1 no cambió en esta cohorte. Además, este estudio halló que TOPBP1 se expresaba de forma anómala en el citoplasma en esta cohorte de pacientes con cáncer de mama familiar. Los niveles de TOPBP1 citoplasmático se correlacionaron positivamente con el grado histológico del tumor. ^{[ 10 ] [ 17 ]}

La sobreexpresión de TOPBP1 se asocia con sarcomas en estadio avanzado, metástasis pulmonar y quimiorresistencia a agentes de platino (por ejemplo, cisplatino ). ^{[ 11 ]}

Se encontró un polimorfismo heterocigoto en TOPBP1 (mutación Arg309Cys entre BRCT2 y BRCT3) en una cohorte de 125 familias finlandesas con cáncer de mama y/o ovario (el 15,2 % tenía la mutación, el 7 % de los controles tenía la mutación). ^{[ 10 ] [ 17 ]} Aunque un estudio de cohorte más amplio de pacientes alemanas con cáncer de mama no encontró una asociación entre este polimorfismo y el riesgo de cáncer de mama. ^{[ 10 ]}

Utilizando conjuntos de datos disponibles públicamente de secuenciación de exoma completo , se encontró un vínculo entre mutaciones de TOPBP1 e hipertensión pulmonar (HAP). ^{[ 9 ] [ 28 ]} Se identificaron tres alelos mutantes de TOPBP1 específicos de HAP: p.S817L, p.N1042S y p.R309C. Si bien se predijo que el alelo p.R309C era potencialmente causante de la enfermedad, los tres alelos asociados a la enfermedad aún tenían altas frecuencias en la población de control, por lo que las mutaciones de TOPBP1 probablemente no serían la única causa de HAP. ^{[ 28 ]} En estudios de seguimiento, la inhibición de TOPBP1 mediante siRNA condujo a un aumento en el daño detectable del ADN y apoptosis en células endoteliales pulmonares sanas. Un rescate con plásmidos que contenían TOPBP1 condujo a una recuperación en la salud de las células endoteliales. ^{[ 9 ]} Esto implica daño del ADN en la patología de la HAP.