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código de barras de ADN

esquema de código de barras de ADN La identificación de especies mediante códigos de barras de ADN es un método que utiliza una sección corta de ADN de uno o varios genes especí...

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esquema de código de barras de ADN

La identificación de especies mediante códigos de barras de ADN es un método que utiliza una sección corta de ADN de uno o varios genes específicos. La premisa de este método es que, mediante la comparación con una biblioteca de referencia de dichas secciones de ADN (también llamadas " secuencias " ), una secuencia individual puede utilizarse para identificar de forma unívoca un organismo a nivel de especie, del mismo modo que un escáner de supermercado utiliza las conocidas franjas negras del código de barras UPC para identificar un artículo en su inventario comparándolo con su base de datos de referencia. [ 1 ] Estos "códigos de barras" se utilizan a veces para identificar especies desconocidas o partes de un organismo, simplemente para catalogar el mayor número posible de taxones o para compararlos con la taxonomía tradicional con el fin de determinar los límites de las especies. [ 2 ]

Se utilizan diferentes regiones genéticas para identificar los distintos grupos de organismos mediante códigos de barras. La región de código de barras más utilizada para animales y algunos protistas es una porción del gen de la citocromo c oxidasa I (COI, CO1 o COX1 ), que se encuentra en el ADN mitocondrial . Otros genes adecuados para el código de barras de ADN son el espaciador transcrito interno (ITS) del ARNr, frecuentemente utilizado para hongos, y la RuBisCO, utilizada para plantas. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] Los microorganismos se detectan utilizando diferentes regiones genéticas. El gen del ARNr 16S, por ejemplo, se utiliza ampliamente en la identificación de procariotas, mientras que el gen del ARNr 18S se utiliza principalmente para detectar eucariotas microbianos . Estas regiones genéticas se eligen porque tienen menos variación intraespecífica (dentro de la especie) que variación interespecífica (entre especies), lo que se conoce como la "brecha del código de barras". [ 6 ]

Algunas aplicaciones del código de barras de ADN incluyen: identificar hojas de plantas incluso cuando no hay flores ni frutos disponibles; identificar polen recolectado en los cuerpos de animales polinizadores; identificar larvas de insectos que pueden tener menos caracteres diagnósticos que los adultos; o investigar la dieta de un animal basándose en el contenido de su estómago, saliva o heces. [ 7 ] Cuando el código de barras se utiliza para identificar organismos a partir de una muestra que contiene ADN de más de un organismo, se utiliza el término metabarcoding de ADN , [ 8 ] [ 9 ] por ejemplo, metabarcoding de ADN de comunidades de diatomeas en ríos y arroyos, que se utiliza para evaluar la calidad del agua. [ 10 ]

Fondo

Las técnicas de código de barras de ADN se desarrollaron a partir de los primeros trabajos de secuenciación de ADN en comunidades microbianas utilizando el gen 5S rRNA . [ 11 ] En 2003, se propusieron métodos y terminología específicos del código de barras de ADN moderno como un método estandarizado para identificar especies, así como para potencialmente asignar secuencias desconocidas a taxones superiores como órdenes y filos, en un artículo de Paul DN Hebert et al. de la Universidad de Guelph , Ontario , Canadá . [ 12 ] Hebert y sus colegas demostraron la utilidad del gen citocromo c oxidasa I (COI), utilizado por primera vez por Folmer et al. en 1994, utilizando sus cebadores de ADN publicados como una herramienta para análisis filogenéticos a nivel de especie [ 12 ] como una herramienta discriminatoria adecuada entre invertebrados metazoos. [ 13 ] La "región de Folmer" del gen COI se utiliza comúnmente para distinguir entre taxones basándose en sus patrones de variación a nivel de ADN. La relativa facilidad para recuperar la secuencia y la variabilidad combinada con la conservación entre especies son algunas de las ventajas del gen COI. Hebert et al., al denominar a estos perfiles "códigos de barras", concibieron el desarrollo de una base de datos de COI que podría servir de base para un "sistema global de bioidentificación".

Métodos

Muestreo y conservación

La identificación mediante códigos de barras puede realizarse a partir de tejido de una muestra específica, de una mezcla de organismos (muestra a granel) o del ADN presente en muestras ambientales (por ejemplo, agua o suelo). Los métodos de muestreo, conservación y análisis varían según el tipo de muestra.

Muestras de tejido

Para codificar con código de barras una muestra de tejido del espécimen objetivo, un pequeño trozo de piel, una escama, una pata o una antena suele ser suficiente (dependiendo del tamaño del espécimen). Para evitar la contaminación, es necesario esterilizar las herramientas utilizadas entre muestras. Se recomienda recolectar dos muestras de un mismo espécimen: una para archivar y otra para el proceso de codificación. La conservación de la muestra es fundamental para evitar la degradación del ADN.

Muestras a granel

Una muestra a granel es un tipo de muestra ambiental que contiene varios organismos del grupo taxonómico en estudio. La diferencia entre las muestras a granel (en el sentido aquí utilizado) y otras muestras ambientales radica en que la muestra a granel suele proporcionar una gran cantidad de ADN de buena calidad. Ejemplos de muestras a granel incluyen muestras de macroinvertebrados acuáticos recolectadas con redes de arrastre o muestras de insectos recolectadas con trampas Malaise. Las muestras de agua filtradas o fraccionadas por tamaño que contienen organismos completos, como eucariotas unicelulares, también se definen a veces como muestras a granel. Dichas muestras pueden recolectarse mediante las mismas técnicas utilizadas para obtener muestras tradicionales para la identificación morfológica.

muestras de ADN ambiental

El método de ADN ambiental (ADNe) es un enfoque no invasivo para detectar e identificar especies a partir de restos celulares o ADN extracelular presente en muestras ambientales (por ejemplo, agua o suelo) mediante códigos de barras o metabarcoding. Este enfoque se basa en el hecho de que todo organismo vivo deja ADN en el medio ambiente, y este ADN ambiental puede detectarse incluso en organismos que se encuentran en muy baja abundancia. Por lo tanto, para el muestreo de campo, lo más crucial es utilizar material y herramientas libres de ADN en cada sitio o muestra de muestreo para evitar la contaminación, si es probable que el ADN del organismo o organismos objetivo esté presente en bajas cantidades. Por otro lado, una muestra de ADNe siempre incluye el ADN de microorganismos vivos de células enteras, que a menudo están presentes en grandes cantidades. Por lo tanto, las muestras de microorganismos tomadas en el medio ambiente natural también se denominan muestras de ADNe, pero la contaminación es menos problemática en este contexto debido a la gran cantidad de organismos objetivo. Los métodos de ADNe pueden utilizarse con la mayoría de los tipos de muestras, como agua, suelo, heces, contenido estomacal o sangre [ 14 ].

Extracción, amplificación y secuenciación de ADN

La identificación mediante códigos de barras de ADN requiere la extracción del ADN de la muestra. Existen diversos métodos de extracción de ADN , y factores como el costo, el tiempo, el tipo de muestra y el rendimiento influyen en la selección del método óptimo.

Cuando el ADN de muestras de organismos o ADN ambiental se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción puede verse afectada negativamente por moléculas inhibidoras presentes en la muestra. [ 15 ] La eliminación de estos inhibidores es crucial para garantizar la disponibilidad de ADN de alta calidad para su posterior análisis.

La amplificación del ADN extraído es un paso necesario en la codificación de barras de ADN. Normalmente, solo se secuencia un pequeño fragmento del material de ADN total (generalmente de 400 a 800 pares de bases ) para obtener el código de barras de ADN, y la amplificación se limita, por lo tanto, a dicho fragmento mediante un par de cebadores. [ 16 ] La amplificación del material de ADN ambiental (ADNe) suele centrarse en fragmentos más pequeños (<200 pares de bases), ya que el ADNe es más propenso a fragmentarse que el ADN de otras fuentes. Sin embargo, algunos estudios argumentan que no existe relación entre el tamaño del amplicón y la tasa de detección de ADNe. [ 17 ] [ 18 ]

Secuenciadores HiSeq en SciLifeLab en Uppsala, Suecia. La foto fue tomada durante la excursión del curso PNS0169 de la SLU en marzo de 2019.

Una vez amplificada la región del marcador de código de barras de ADN, el siguiente paso es secuenciar dicha región mediante métodos de secuenciación de ADN . [ 19 ] Existen diversas plataformas de secuenciación y el desarrollo técnico avanza rápidamente.

Selección de marcadores

Una vista esquemática de los cebadores y la región objetivo, demostrada en el gen del ARNr 16S en Pseudomonas . Como cebadores, normalmente se seleccionan secuencias cortas conservadas con baja variabilidad, que pueden amplificar la mayoría o todas las especies en el grupo objetivo elegido. Los cebadores se utilizan para amplificar una región objetivo altamente variable entre los dos cebadores, que luego se utiliza para la discriminación de especies. Modificado de »Variable Copy Number, Intra-Genomic Heterogeneities and Lateral Transfers of the 16S rRNA Gene in Pseudomonas« por Bodilis, Josselin; Nsigue-Meilo, Sandrine; Besaury, Ludovic; Quillet, Laurent, utilizado bajo CC BY, disponible en: https://www.researchgate.net/figure/Hypervariable-regions-within-the-16S-rRNA-gene-in-Pseudomonas-The-plotted-line-reflects_fig2_224832532 .

Los marcadores utilizados para la identificación de especies mediante códigos de barras de ADN se denominan códigos de barras. Para caracterizar con éxito las especies basándose en códigos de barras de ADN, es crucial seleccionar regiones de ADN informativas. Un buen código de barras de ADN debe tener una baja variabilidad intraespecífica y una alta variabilidad interespecífica [ 12 ] , además de poseer sitios flanqueantes conservados para el desarrollo de cebadores de PCR universales para una amplia aplicación taxonómica . El objetivo es diseñar cebadores que detecten y distingan la mayoría o la totalidad de las especies del grupo de organismos estudiado (alta resolución taxonómica). La longitud de la secuencia del código de barras debe ser lo suficientemente corta como para ser utilizada con los métodos actuales de muestreo, extracción de ADN , amplificación y secuenciación [ 20 ] .

Sería más eficiente utilizar una única secuencia genética para todos los grupos taxonómicos, desde virus hasta plantas y animales . Sin embargo, aún no se ha encontrado dicha región genética, por lo que se utilizan diferentes códigos de barras para distintos grupos de organismos, o según la pregunta de investigación.

Para los animales, el código de barras más utilizado es el locus de la citocromo C oxidasa I mitocondrial ( COI ). [ 21 ] También se utilizan otros genes mitocondriales, como Cytb , 12S o 16S . Los genes mitocondriales se prefieren a los genes nucleares debido a su falta de intrones , su modo de herencia haploide y su recombinación limitada . [ 21 ] [ 22 ] Además, cada célula tiene varias mitocondrias (hasta varios miles) y cada una de ellas contiene varias moléculas de ADN circular. Por lo tanto, las mitocondrias pueden ofrecer una fuente abundante de ADN incluso cuando el tejido de la muestra es limitado.

En las plantas, sin embargo, los genes mitocondriales no son apropiados para la identificación mediante códigos de barras de ADN debido a sus bajas tasas de mutación . [ 23 ] Se han encontrado algunos genes candidatos en el genoma del cloroplasto , siendo el más prometedor el gen de la madurasa K ( matK ), ya sea solo o en asociación con otros genes. También se han utilizado marcadores multilocus, como los espaciadores transcritos internos ribosomales (ADN ITS) junto con matK , rbcL , trnH u otros genes, para la identificación de especies. La mejor discriminación entre especies vegetales se ha logrado utilizando dos o más loci de "código de barras" del cloroplasto. [ 24 ]

Para las bacterias , el gen de la subunidad pequeña del ARN ribosómico ( 16S ) puede usarse para diferentes taxones, ya que está altamente conservado. [ 25 ] Algunos estudios sugieren que COI , [ 26 ] la chaperonina de tipo II ( cpn60 ) [ 27 ] o la subunidad β de la ARN polimerasa ( rpoB ) [ 28 ] también podrían servir como códigos de barras de ADN bacteriano.

La identificación de hongos mediante códigos de barras genéticos es más compleja y puede requerirse más de una combinación de cebadores. [ 29 ] El marcador COI funciona bien en ciertos grupos de hongos, [ 30 ] pero no igual de bien en otros. [ 31 ] Por lo tanto, se están utilizando marcadores adicionales, como el ADNr ITS y la subunidad grande del ARN ribosómico nuclear (ARNr 28S LSU). [ 32 ]

Dentro del grupo de los protistas , se han propuesto varios códigos de barras, como las regiones D1-D2 o D2-D3 del ADNr 28S , la subregión V4 del gen del ARNr 18S , el ADNr ITS y el gen COI . Además, se pueden utilizar algunos códigos de barras específicos para protistas fotosintéticos , por ejemplo, la subunidad grande del gen de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa-oxigenasa ( rbcL ) y el gen del ARNr 23S cloroplástico .

Bibliotecas de referencia

Las bibliotecas de referencia se utilizan para la identificación taxonómica, también llamada anotación, de secuencias obtenidas mediante códigos de barras o metabarcoding. Estas bases de datos contienen los códigos de barras de ADN asignados a taxones previamente identificados. La mayoría de las bibliotecas de referencia no cubren todas las especies dentro de un grupo de organismos, y continuamente se crean nuevas entradas. En el caso de macro- y muchos microorganismos (como las algas), estas bibliotecas de referencia requieren documentación detallada (ubicación y fecha de muestreo, persona que lo recolectó, imagen, etc.) e identificación taxonómica autorizada del espécimen de referencia, así como la presentación de secuencias en un formato particular. Sin embargo, tales estándares se cumplen solo para un pequeño número de especies. El proceso también requiere el almacenamiento de especímenes de referencia en colecciones de museos, herbarios y otras instituciones colaboradoras. Tanto la cobertura taxonómicamente completa como la calidad del contenido son importantes para la precisión de la identificación. [ 33 ] En el mundo microbiano, no hay información de ADN para la mayoría de los nombres de especies, y muchas secuencias de ADN no se pueden asignar a ningún binomio linneano . [ 34 ] Existen varias bases de datos de referencia dependiendo del grupo de organismos y el marcador genético utilizado. Existen bases de datos nacionales más pequeñas (por ejemplo, FinBOL) y grandes consorcios como el Proyecto Internacional del Código de Barras de la Vida (iBOL). [ 35 ]

ATREVIDO

Lanzado en 2007, el Barcode of Life Data System (BOLD) [ 36 ] es una de las bases de datos más grandes, que contiene alrededor de 780.000 BIN (Barcode Index Numbers) en 2022. Es un repositorio de acceso libre para los registros de especímenes y secuencias para estudios de códigos de barras, y también es un banco de trabajo que ayuda a la gestión, el control de calidad y el análisis de datos de códigos de barras. La base de datos contiene principalmente registros BIN para animales basados ​​en el marcador genético COI. Para la identificación de plantas, BOLD acepta secuencias de matK y rbcL .

UNIR

La base de datos UNITE [ 37 ] se lanzó en 2003 y es una base de datos de referencia para la identificación molecular de especies de hongos (y desde 2018 de todas las eucariotas) mediante la región del marcador genético del espaciador transcrito interno (ITS) del ARN ribosómico nuclear. Esta base de datos se basa en el concepto de hipótesis de especies: se elige el  porcentaje con el que se desea trabajar y las secuencias se ordenan en comparación con las secuencias obtenidas de especímenes de referencia identificados por expertos.

Código de barras Diat.

Diat.barcode es una base de datos para diatomeas. [ 38 ] Se publicó por primera vez con el nombre R-syst::diatom [ 39 ] en 2016, comenzando con datos de dos fuentes: la colección de cultivos de Thonon (TCC) en la estación hidrobiológica del Instituto Nacional Francés de Investigación Agronómica (INRA) y de la base de datos de nucleótidos del NCBI ( Centro Nacional de Información Biotecnológica ). Diat.barcode proporciona datos para dos marcadores genéticos, rbcL (Ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa, cloroplástica) y 18S (ARN ribosómico 18S, nuclear). La base de datos también incluye información adicional sobre rasgos de las especies, como características morfológicas (biovolumen, dimensiones de tamaño, etc.), formas de vida (movilidad, tipo de colonia, etc.) o características ecológicas (sensibilidad a la contaminación, etc.).

Análisis bioinformático

Para obtener datos bien estructurados, limpios e interpretables, los datos de secuenciación brutos deben procesarse mediante análisis bioinformáticos. El archivo FASTQ con los datos de secuenciación contiene dos tipos de información: las secuencias detectadas en la muestra ( archivo FASTA ) y un archivo de calidad con puntuaciones de calidad ( puntuaciones PHRED ) asociadas a cada nucleótido de cada secuencia de ADN. Las puntuaciones PHRED indican la probabilidad de que el nucleótido asociado haya sido puntuado correctamente.

En general, la puntuación PHRED disminuye hacia el final de cada secuencia de ADN. Por lo tanto, algunos flujos de trabajo bioinformáticos simplemente cortan el final de las secuencias en un umbral definido.

Algunas tecnologías de secuenciación, como MiSeq, utilizan la secuenciación de extremos emparejados, en la que la secuenciación se realiza en ambas direcciones, lo que produce una mejor calidad. Las secuencias superpuestas se alinean en contigs y se fusionan. Generalmente, se combinan varias muestras en una sola ejecución, y cada muestra se caracteriza por un fragmento corto de ADN, la etiqueta. En un paso de desmultiplexación, las secuencias se ordenan utilizando estas etiquetas para reconstruir las muestras individuales. Antes de un análisis posterior, las etiquetas y otros adaptadores se eliminan del fragmento de ADN de la secuencia de código de barras. Durante el recorte, se eliminan las secuencias de mala calidad (puntuaciones PHRED bajas) o las secuencias que son mucho más cortas o más largas que el código de barras de ADN objetivo. El siguiente paso de desreplicación es el proceso en el que todas las secuencias filtradas por calidad se colapsan en un conjunto de lecturas únicas (unidades de secuencia individuales, ISU) con la información de su abundancia en las muestras. Después de eso, se detectan y eliminan las quimeras (es decir, secuencias compuestas formadas a partir de fragmentos de origen mixto). Finalmente, las secuencias se agrupan en OTU (Unidades Taxonómicas Operacionales), utilizando una de las muchas estrategias de agrupamiento. El software bioinformático más utilizado incluye Mothur, [ 40 ] Uparse, [ 41 ] Qiime, [ 42 ] Galaxy, [ 43 ] Obitools, [ 44 ] JAMP, [ 45 ] Barque, [ 46 ] y DADA2. [ 47 ]

Comparar la abundancia de lecturas, es decir, secuencias, entre diferentes muestras sigue siendo un desafío, ya que tanto el número total de lecturas en una muestra como la cantidad relativa de lecturas para una especie pueden variar entre muestras, métodos u otras variables. Para la comparación, se puede reducir el número de lecturas de cada muestra al número mínimo de lecturas de las muestras que se van a comparar, un proceso llamado rarefacción. Otra forma es utilizar la abundancia relativa de lecturas. [ 48 ]

Identificación de especies y asignación taxonómica

La asignación taxonómica de las OTU a especies se logra comparando las secuencias con bibliotecas de referencia. La herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) se usa comúnmente para identificar regiones de similitud entre secuencias comparando las lecturas de secuencia de la muestra con secuencias en bases de datos de referencia. [ 49 ]

Si la base de datos devuelve una coincidencia exacta para una secuencia de interés, entonces se puede identificar a nivel de especie. Las coincidencias muy similares también pueden tratarse como la misma especie, según las convenciones de cada grupo taxonómico.

Si no se encuentran coincidencias suficientemente similares, la identificación a un nivel taxonómico superior, como una familia o una clase, puede ser posible considerando las coincidencias obtenidas como "anclas" taxonómicas. La secuencia puede asignarse a una unidad taxonómica operativa (OTU) específica que, combinada con otros métodos taxonómicos, puede utilizarse para describir un nuevo taxón y convertirse en una nueva entrada en la base de datos. La construcción de un árbol filogenético de la secuencia de muestra y las secuencias coincidentes suele ayudar a contextualizar las coincidencias. [ 50 ]

En algunos grupos de organismos, como las bacterias, la asignación taxonómica a nivel de especie a menudo no es posible, ya que son comunes las especies no descritas y desconocidas. Véase también taxones oscuros .

BLAST es un método ingenuo para encontrar secuencias similares. Es lento, tiene una alta tasa de falsos positivos y la mejor coincidencia no es necesariamente el vecino filogenético. Los métodos mejorados incluyen clasificadores bayesianos ingenuos y de bosques aleatorios entrenados con bases de datos de genes marcadores. Existen clasificadores preentrenados para muchos tipos de códigos de barras, como el 16S de procariotas , el CO1 de artrópodos y el LSU de hongos. [ 51 ]

Aplicaciones

Las aplicaciones del código de barras de ADN incluyen la identificación de nuevas especies , la evaluación de la seguridad de los alimentos, la identificación y evaluación de especies crípticas, la detección de especies exóticas, la identificación de especies en peligro de extinción y amenazadas , [ 52 ] vincular las etapas de huevo y larva con las especies adultas, asegurar los derechos de propiedad intelectual para los biorrecursos, enmarcar planes de gestión global para estrategias de conservación, dilucidar nichos de alimentación, [ 53 ] y la ciencia forense. [ 54 ] Los marcadores de código de barras de ADN se pueden aplicar para abordar cuestiones básicas en sistemática, ecología , biología evolutiva y conservación , incluyendo el ensamblaje de comunidades, redes de interacción de especies , descubrimiento taxonómico y evaluación de áreas prioritarias para la protección ambiental .

Identificación de especies

Secuencias cortas de ADN específicas o marcadores de una región estandarizada del genoma pueden proporcionar un código de barras de ADN para identificar especies. [ 55 ] Los métodos moleculares son especialmente útiles cuando los métodos tradicionales no son aplicables. El código de barras de ADN tiene una gran aplicabilidad en la identificación de larvas para las que generalmente hay pocos caracteres diagnósticos disponibles, y en la asociación de diferentes etapas de vida (por ejemplo, larva y adulto) en muchos animales. [ 56 ] La identificación de especies incluidas en los apéndices de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres ( CITES ) mediante técnicas de código de barras se utiliza en el monitoreo del comercio ilegal. [ 57 ]

Detección de especies invasoras

Las especies exóticas pueden detectarse mediante códigos de barras. [ 58 ] [ 59 ] Los códigos de barras pueden ser adecuados para la detección de especies, por ejemplo, en el control de fronteras, donde la identificación morfológica rápida y precisa a menudo no es posible debido a las similitudes entre diferentes especies, la falta de características diagnósticas suficientes [ 58 ] y/o la falta de experiencia taxonómica. Los códigos de barras y el metabarcoding también pueden utilizarse para examinar ecosistemas en busca de especies invasoras y para distinguir entre una especie invasora y especies nativas morfológicamente similares. [ 60 ] Se demuestra la alta eficiencia de la identificación de ADN en relación con el monitoreo tradicional de invasiones biológicas. [ 61 ]

Delimitación de especies crípticas

El código de barras de ADN permite la identificación y el reconocimiento de especies crípticas . [ 62 ] Sin embargo, los resultados de los análisis de código de barras de ADN dependen de la elección de los métodos analíticos, por lo que el proceso de delimitación de especies crípticas mediante códigos de barras de ADN puede ser tan subjetivo como cualquier otra forma de taxonomía . Hebert et al. (2004) concluyeron que la mariposa Astraptes fulgerator en el noroeste de Costa Rica en realidad consta de 10 especies diferentes. [ 63 ] Sin embargo, estos resultados fueron posteriormente cuestionados por Brower (2006), quien señaló numerosas fallas graves en el análisis y concluyó que los datos originales no podían respaldar más que la posibilidad de tres a siete taxones crípticos en lugar de diez especies crípticas. [ 64 ] Smith et al. (2007) utilizaron códigos de barras de ADN de citocromo c oxidasa I para la identificación de especies de las 20 morfoespecies de moscas parasitoides Belvosia ( Diptera : Tachinidae ) criadas a partir de orugas ( Lepidoptera ) en el Área de Conservación Guanacaste (ACG), noroeste de Costa Rica. Estos autores descubrieron que el código de barras aumenta el número de especies a 32, al revelar que cada una de las tres especies de parasitoides , previamente consideradas generalistas, son en realidad conjuntos de especies crípticas altamente específicas de hospedador. [ 65 ] Para 15 morfoespecies de poliquetos dentro del bentos profundo antártico estudiado mediante código de barras de ADN, se encontró diversidad críptica en el 50% de los casos. Además, se detectaron 10 morfoespecies previamente pasadas por alto, aumentando la riqueza total de especies en la muestra en un 233%. [ 66 ] De manera similar, un estudio de código de barras de ADN de reptiles de Socotra reveló divergencias intraespecíficas inesperadamente altas en varios taxones y estimó que la riqueza de especies puede estar subestimada entre un 13,8 y un 54,4 %. [ 67 ]

El código de barras es una herramienta para garantizar la calidad de los alimentos. En este caso, se extrae ADN de alimentos navideños tradicionales noruegos en el laboratorio de biología molecular del Museo Universitario NTNU.

Análisis de dietas y aplicación web alimentaria

El código de barras de ADN y el metabarcoding pueden ser útiles en estudios de análisis de dieta, [ 68 ] y se utilizan típicamente cuando los especímenes de presa no pueden identificarse basándose en caracteres morfológicos. [ 69 ] [ 70 ] Hay una variedad de enfoques de muestreo en el análisis de dieta: el metabarcoding de ADN puede realizarse en contenido estomacal, [ 71 ] heces, [ 70 ] [ 72 ] saliva [ 73 ] o análisis de cuerpo entero. [ 52 ] [ 74 ] En muestras fecales o contenido estomacal altamente digerido, a menudo no es posible distinguir tejido de especies individuales, y por lo tanto se puede aplicar el metabarcoding en su lugar. [ 70 ] [ 75 ] Las heces o la saliva representan enfoques de muestreo no invasivos, mientras que el análisis de cuerpo entero a menudo significa que el individuo debe ser sacrificado primero. Para organismos más pequeños, la secuenciación del contenido estomacal a menudo se realiza secuenciando el animal completo.

Código de barras para la seguridad alimentaria

El código de barras de ADN representa una herramienta esencial para evaluar la calidad de los productos alimenticios. Su propósito es garantizar la trazabilidad de los alimentos, minimizar la piratería alimentaria y valorar la producción agroalimentaria local y típica. Otro propósito es salvaguardar la salud pública; por ejemplo, el metabarcoding ofrece la posibilidad de identificar meros que causan la intoxicación por ciguatera a partir de restos de comida [ 76 ] o de separar setas venenosas de comestibles (Ref).

Biomonitoreo y evaluación ecológica

La identificación mediante códigos de barras de ADN puede utilizarse para evaluar la presencia de especies en peligro de extinción para los esfuerzos de conservación (Ref), o la presencia de especies indicadoras que reflejen condiciones ecológicas específicas (Ref), por ejemplo, exceso de nutrientes o bajos niveles de oxígeno.

ciencia forense

El código de barras de ADN se utiliza a menudo para la identificación de especies en casos de ciencias forenses . Se pueden encontrar, recolectar e identificar muestras desconocidas de animales o plantas en escenas del crimen, con la esperanza de vincularlas con un sospechoso y obtener una condena. [ 77 ] La caza furtiva , la matanza de especies en peligro de extinción y el maltrato animal son ejemplos de delitos en los que se utiliza el código de barras de ADN, ya que a menudo se encuentra ADN animal. [ 54 ] [ 78 ] Por otro lado, el ADN vegetal se suele utilizar como evidencia de rastreo para vincular a un sospechoso con una escena del crimen. [ 79 ]

Potenciales y limitaciones

Potenciales

Los métodos tradicionales de bioevaluación están bien establecidos internacionalmente y son útiles para el biomonitoreo, como por ejemplo para la bioevaluación acuática dentro de las Directivas de la UE WFD y MSFD . Sin embargo, el código de barras de ADN podría mejorar los métodos tradicionales por las siguientes razones: el código de barras de ADN (i) puede aumentar la resolución taxonómica y armonizar la identificación de taxones que son difíciles de identificar o carecen de expertos, (ii) puede relacionar con mayor precisión los factores ambientales con taxones específicos, (iii) puede aumentar la comparabilidad entre regiones, (iv) permite la inclusión de etapas tempranas de vida y especímenes fragmentados, (v) permite la delimitación de especies crípticas /raras, (vi) permite el desarrollo de nuevos índices, por ejemplo, especies raras/crípticas que pueden ser sensibles/tolerantes a los factores de estrés , (vii) aumenta el número de muestras que se pueden procesar y reduce el tiempo de procesamiento, lo que resulta en un mayor conocimiento de la ecología de las especies, (viii) es una forma no invasiva de monitoreo cuando se utilizan métodos de ADN ambiental . [ 80 ]

Tiempo y costo

La identificación mediante códigos de barras de ADN es más rápida que los métodos morfológicos tradicionales, desde la formación hasta la asignación taxonómica. Se requiere menos tiempo para adquirir experiencia en métodos de ADN que para convertirse en un experto en taxonomía. Además, el flujo de trabajo de la identificación mediante códigos de barras de ADN (desde la muestra hasta el resultado) suele ser más rápido que el de los métodos morfológicos tradicionales y permite procesar un mayor número de muestras.

Resolución taxonómica

El código de barras de ADN permite la resolución de taxones desde niveles taxonómicos superiores (p. ej., familia) hasta inferiores (p. ej., especie), que de otro modo serían demasiado difíciles de identificar utilizando métodos morfológicos tradicionales, como p. ej., la identificación mediante microscopía. Por ejemplo, los quironómidos (los mosquitos no picadores) están ampliamente distribuidos tanto en ecosistemas terrestres como de agua dulce. Su riqueza y abundancia los hacen importantes para los procesos y redes ecológicas, y son uno de los muchos grupos de invertebrados utilizados en el biomonitoreo. Las muestras de invertebrados pueden contener hasta 100 especies de quironómidos que a menudo constituyen hasta el 50 % de una muestra. A pesar de esto, generalmente no se identifican por debajo del nivel de familia debido a la experiencia taxonómica y el tiempo requerido. [ 81 ] Esto puede resultar en la agrupación de diferentes especies de quironómidos con diferentes preferencias ecológicas, lo que resulta en una evaluación inexacta de la calidad del agua.

El código de barras de ADN brinda la oportunidad de resolver taxones y relacionar directamente los efectos de los factores de estrés con taxones específicos, como especies individuales de quironómidos. Por ejemplo, Beermann et al. (2018) utilizaron el código de barras de ADN de Chironomidae para investigar su respuesta a múltiples factores de estrés: reducción del flujo, aumento de sedimentos finos y aumento de la salinidad. [ 82 ] Después del código de barras, se encontró que la muestra de quironómidos constaba de 183 Unidades Taxonómicas Operacionales (OTU), es decir, códigos de barras (secuencias) que a menudo son equivalentes a especies morfológicas. Estas 183 OTU mostraron 15 tipos de respuesta en lugar de los dos tipos de respuesta previamente informados [ 83 ] registrados cuando todos los quironómidos se agruparon en el mismo estudio de múltiples factores de estrés. Se descubrió una tendencia similar en un estudio de Macher et al. (2016) que descubrió diversidad críptica dentro de la especie de efímera de Nueva Zelanda Deleatidium sp . Este estudio encontró diferentes patrones de respuesta de 12 OTU moleculares distintos a los factores de estrés, lo que puede cambiar el consenso de que esta efímera es sensible a la contaminación. [ 84 ]

deficiencias

A pesar de las ventajas que ofrece la identificación mediante códigos de barras de ADN, también se ha sugerido que su mejor uso es como complemento de los métodos morfológicos tradicionales. [ 80 ] Esta recomendación se basa en múltiples desafíos percibidos.

Parámetros físicos

No es del todo sencillo relacionar los códigos de barras de ADN con las preferencias ecológicas del taxón en cuestión, algo necesario para su uso en biomonitoreo. Por ejemplo, la detección de ADN objetivo en sistemas acuáticos depende de la concentración de moléculas de ADN en un sitio, la cual, a su vez, puede verse afectada por muchos factores. La presencia de moléculas de ADN también depende de su dispersión en un sitio, como la dirección o la fuerza de las corrientes. Se desconoce con precisión cómo se desplaza el ADN en arroyos y lagos, lo que dificulta el muestreo. Otro factor podría ser el comportamiento de la especie objetivo; por ejemplo, los peces pueden presentar cambios estacionales en sus movimientos, mientras que los cangrejos de río o los mejillones liberan ADN en mayores cantidades solo en ciertos momentos de su ciclo de vida (muda, desove). En el caso del ADN en el suelo, se sabe aún menos sobre su distribución, cantidad o calidad.

La principal limitación del método de código de barras es que depende de bibliotecas de referencia de códigos de barras para la identificación taxonómica de las secuencias. La identificación taxonómica solo es precisa si se dispone de una referencia fiable. Sin embargo, la mayoría de las bases de datos aún están incompletas, especialmente para organismos más pequeños, como hongos, fitoplancton, nematodos, etc. Además, las bases de datos actuales contienen identificaciones erróneas, errores ortográficos y otros errores. Se requiere un enorme esfuerzo de curación y completitud en torno a las bases de datos de todos los organismos necesarios, lo que implica grandes proyectos de código de barras (por ejemplo, el proyecto iBOL para la base de datos de referencia Barcode of Life Data Systems (BOLD)). [ 85 ] [ 86 ] Sin embargo, la completitud y la curación son difíciles y requieren mucho tiempo. Sin especímenes de referencia, no se puede tener certeza sobre si la secuencia utilizada como referencia es correcta.

Las bases de datos de secuencias de ADN como GenBank contienen muchas secuencias que no están vinculadas a especímenes de referencia (por ejemplo, especímenes de herbario, líneas celulares cultivadas o, a veces, imágenes). Esto es problemático ante cuestiones taxonómicas como si varias especies deben dividirse o combinarse, o si las identificaciones anteriores fueron correctas. Reutilizar secuencias, no vinculadas a especímenes de referencia, de organismos inicialmente mal identificados puede respaldar conclusiones erróneas y debe evitarse. [ 87 ] Por lo tanto, la mejor práctica para la codificación de barras de ADN es secuenciar especímenes de referencia. [ 88 ] [ 89 ] Sin embargo, para muchos taxones, puede ser difícil obtener especímenes de referencia, por ejemplo, con especímenes difíciles de capturar, especímenes disponibles mal conservados o falta de experiencia taxonómica adecuada. [ 87 ]

Es importante destacar que los códigos de barras de ADN también pueden utilizarse para crear una taxonomía provisional, en cuyo caso las OTU pueden utilizarse como sustitutos de los binomios latinos tradicionales, reduciendo así significativamente la dependencia de bases de datos de referencia completamente pobladas. [ 90 ]

Sesgo tecnológico

La identificación mediante códigos de barras de ADN también conlleva sesgos metodológicos, desde el muestreo hasta el análisis de datos bioinformáticos .

La muestra de ADN puede estar contaminada con inhibidores de la PCR, lo que provoca que algunas muestras presenten resultados falsos positivos. La replicación de la PCR suele ser necesaria para obtener una buena calidad y sensibilidad de la secuencia, pero conlleva un aumento exponencial del riesgo de contaminación.

Además del riesgo de contaminación de la muestra de ADN por inhibidores de PCR, el sesgo de los cebadores es una de las principales fuentes de errores en el código de barras de ADN. [ 91 ] [ 92 ] El aislamiento de un marcador de ADN eficiente y el diseño de los cebadores es un proceso complejo y se ha hecho un esfuerzo considerable para desarrollar cebadores para el código de barras de ADN en diferentes grupos taxonómicos. A pesar de este esfuerzo, sigue existiendo la posibilidad de que los cebadores no amplifiquen una secuencia divergente inesperada. [ 93 ] Además, los cebadores a menudo se unirán preferentemente a algunas secuencias, lo que lleva a una eficiencia y especificidad diferencial de los cebadores y a una evaluación de comunidades no representativas y una inflación de la riqueza. [ 94 ] Por lo tanto, la composición de las secuencias de las comunidades de la muestra se altera principalmente en el paso de PCR.

Varios estudios experimentaron con enfoques "sin PCR" para evitar estos sesgos. Un enfoque principal es utilizar muestras enriquecidas con mitocondrias, de modo que la alta concentración de ADN objetivo haga innecesaria la amplificación. (Las secuencias más largas obtenidas también ayudan con la resolución taxonómica). [ 95 ] [ 96 ] Pero a partir de 2018, la principal técnica de metabarcoding de ADN todavía se basa en la secuenciación de amplicones. [ 93 ]

Otros sesgos entran en juego durante la secuenciación y el procesamiento bioinformático de las secuencias, como la creación de quimeras.

Falta de estandarización

Aunque el código de barras de ADN se utiliza y aplica cada vez más, no existe consenso sobre los métodos de preservación o extracción de ADN, la selección de marcadores y conjuntos de cebadores, ni los protocolos de PCR. Los parámetros de las herramientas bioinformáticas (por ejemplo, la agrupación de OTU, los algoritmos o umbrales de asignación taxonómica, etc.) son el origen de numerosos debates entre los usuarios del código de barras de ADN. [ 93 ] Las tecnologías de secuenciación también evolucionan rápidamente, junto con las herramientas para el análisis de las enormes cantidades de datos de ADN generados, y la estandarización de los métodos es urgentemente necesaria para facilitar la colaboración y el intercambio de datos a mayor escala espacial y temporal. Esta estandarización de los métodos de código de barras a escala europea forma parte de los objetivos de la Acción COST europea DNAqua-net [ 97 ] y también es abordada por el CEN (Comité Europeo de Normalización). [ 98 ]

Otra crítica a la identificación mediante códigos de barras de ADN es su limitada eficiencia para la discriminación precisa por debajo del nivel de especie (por ejemplo, para distinguir entre variedades), para la detección de híbridos, y que puede verse afectada por las tasas de evolución .

Discrepancias entre la identificación convencional (morfológica) y la basada en códigos de barras.

Es importante saber que las listas de taxones derivadas de la identificación convencional (morfológica) no son, y tal vez nunca serán, directamente comparables a las listas de taxones derivadas de la identificación basada en códigos de barras debido a varias razones. La causa más importante es probablemente la incompletitud y la falta de precisión de las bases de datos de referencia molecular, lo que impide una correcta asignación taxonómica de las secuencias de ADN ambiental. Los taxones que no están presentes en las bases de datos de referencia no se encontrarán mediante ADN ambiental, y las secuencias vinculadas a un nombre erróneo darán lugar a una identificación incorrecta. [ 80 ] Otras causas conocidas son la diferente escala y tamaño de muestreo entre una muestra tradicional y una molecular, el posible análisis de organismos muertos, que puede ocurrir de diferentes maneras para ambos métodos dependiendo del grupo de organismos, y la selección específica de la identificación en cada método, es decir, la variabilidad en la experiencia taxonómica o la posibilidad de identificar ciertos grupos de organismos, respectivamente, el sesgo de los cebadores que también conduce a un posible análisis sesgado de los taxones. [ 80 ]

Resolución de haplogrupos

Los códigos de barras se eligen para que tengan una tasa de mutación adecuada para delimitar especies, pero esto no implica que los loci de los códigos de barras siempre coincidan con la historia de poblaciones que se convierten en especies separadas. En algunos casos, especímenes con códigos de barras de ADN (COI) idénticos pertenecen claramente a especies diferentes, por ejemplo, especies del género de peces Chromis . En otras palabras, estas especies comparten el mismo haplotipo para el locus del código de barras y aún no han divergido. [ 99 ] También es posible que el locus muestre una clasificación de linaje incompleta con algunos eventos de especiación, lo que lleva a agrupaciones difíciles de interpretar. [ 100 ] Un ejemplo de ILS en COI se encuentra en un estudio multilocus de Mechanitis , donde el uso de múltiples loci ayuda a superar el problema. [ 101 ]

El uso de múltiples loci o secuencias más largas generalmente mejora la resolución, aunque esto suele conllevar una menor cobertura de la base de datos. El análisis de secuencias genómicas parciales , que no requiere cebadores especialmente diseñados, puede utilizarse para producir secuencias largas de ADN de alto número de copias, como el ADN ribosómico y el de orgánulos. [ 51 ]

Estimaciones de riqueza/diversidad

El código de barras de ADN puede resultar en una sobreestimación o subestimación de la riqueza y diversidad de especies. Algunos estudios sugieren que los artefactos (identificación de especies no presentes en una comunidad) son una causa importante de la biodiversidad inflada. [ 102 ] [ 103 ] El problema más grave son los taxones representados por un bajo número de lecturas de secuenciación. Estas lecturas generalmente se eliminan durante el proceso de filtrado de datos, ya que diferentes estudios sugieren que la mayoría de estas lecturas de baja frecuencia pueden ser artefactos. [ 104 ] Sin embargo, entre estas lecturas de baja abundancia pueden existir taxones realmente raros. [ 105 ] Las secuencias raras pueden reflejar linajes únicos en las comunidades, lo que las convierte en secuencias informativas y valiosas. Por lo tanto, existe una gran necesidad de algoritmos bioinformáticos más robustos que permitan diferenciar entre lecturas informativas y artefactos. Las bibliotecas de referencia completas también permitirían una mejor prueba de los algoritmos bioinformáticos, al permitir un mejor filtrado de artefactos (es decir, la eliminación de secuencias que carecen de una contraparte entre las especies existentes) y, por lo tanto, sería posible obtener una asignación de especies más precisa. [ 106 ] La diversidad críptica también puede resultar en una biodiversidad inflada, ya que una especie morfológica puede dividirse en muchas secuencias moleculares distintas. [ 80 ] Esto contribuirá en gran medida a la generación de datos de referencia de ADN que son cruciales para el monitoreo de la biodiversidad ambiental basado en ADN .

Megabarcoding

Megabarcoding es un término utilizado para describir el código de barras de ADN de alto rendimiento basado en especímenes, donde miles de especímenes pueden ser codificados simultáneamente para la identificación y el descubrimiento de especies. [ 107 ] [ 108 ] [ 109 ] [ 110 ] [ 111 ]

Flujo de trabajo de megabarcoding

Esto es posible gracias al uso de plataformas de secuenciación de tercera generación, como PacBio (Sequel I/II) de Pacific Biosciences y MinION, PromethION de Oxford Nanopore Technology . En comparación con la secuenciación de Sanger , el megabarcoding es más rápido y económico, lo que permite la generación a gran escala de códigos de barras de ADN para miles de especies. [ 112 ]

Aplicaciones

Megabarcoding puede ayudar a llenar la brecha de datos de referencia de códigos de barras de ADN para insectos y acelerar el descubrimiento de especies, [ 113 ] [ 114 ] comprender los patrones de diversidad de especies, [ 115 ] [ 116 ] [ 117 ] evaluar la riqueza de especies, [ 118 ] generar inventarios rápidos de especies de biodiversidad, [ 119 ] rastrear cambios de línea base, [ 120 ] y etapas de historia de vida coincidentes. [ 121 ]

Metabarcoding

Diferencias entre los métodos estándar de código de barras de ADN y metabarcoding. Mientras que el código de barras de ADN busca una especie específica, el metabarcoding busca a toda la comunidad.

El metabarcoding se define como la codificación de barras del ADN o del ADN ambiental ( ADNe ) que permite la identificación simultánea de múltiples taxones dentro de la misma muestra (ambiental), aunque a menudo dentro del mismo grupo de organismos. La principal diferencia entre ambos enfoques radica en que el metabarcoding, a diferencia de la codificación de barras, no se centra en un organismo específico, sino que busca determinar la composición de especies dentro de una muestra.

Metodología

El procedimiento de metabarcoding, al igual que el código de barras general, abarca los pasos de extracción de ADN , amplificación por PCR , secuenciación y análisis de datos . Un código de barras consiste en una región génica variable corta (por ejemplo, ver diferentes marcadores/códigos de barras ) que es útil para la asignación taxonómica, flanqueada por regiones génicas altamente conservadas que pueden usarse para el diseño de cebadores . [ 122 ] Se utilizan diferentes genes dependiendo de si el objetivo es codificar una sola especie o realizar metabarcoding de varias especies. En este último caso, se utiliza un gen más universal. El metabarcoding no utiliza ADN/ARN de una sola especie como punto de partida, sino ADN/ARN de varios organismos diferentes derivados de una muestra ambiental o masiva.

Aplicaciones

El metabarcoding tiene el potencial de complementar las medidas de biodiversidad, e incluso reemplazarlas en algunos casos, especialmente a medida que la tecnología avanza y los procedimientos se vuelven gradualmente más económicos, optimizados y generalizados. [ 123 ] [ 124 ]

Las aplicaciones del metabarcoding de ADN incluyen el monitoreo de la biodiversidad en entornos terrestres y acuáticos, la paleontología y los ecosistemas antiguos, las interacciones planta-polinizador , el análisis de la dieta y la seguridad alimentaria.

Ventajas y desafíos

Las ventajas y desventajas generales del código de barras revisadas anteriormente también son válidas para el metabarcoding. Una desventaja particular de los estudios de metabarcoding es que aún no existe consenso sobre el diseño experimental óptimo y los criterios bioinformáticos que deben aplicarse en el metabarcoding de ADN ambiental. [ 125 ] Sin embargo, actualmente existen iniciativas conjuntas, como por ejemplo la red COST DNAqua-Net de la UE , para avanzar mediante el intercambio de experiencias y conocimientos con el fin de establecer estándares de buenas prácticas para la biomonitorización. [ 80 ]

Código de barras de ADN artificial

En 2014, investigadores de la ETH Zúrich propusieron utilizar códigos de barras de ADN artificiales de tamaño submicrométrico como una "etiqueta invisible para el aceite". Estos códigos de barras consisten en secuencias de ADN sintético dentro de partículas de sílice recuperables magnéticamente. Se pueden añadir al aceite de oliva en cantidades muy pequeñas (hasta 1 ppb) como etiqueta y se pueden recuperar en cualquier momento para realizar pruebas de autenticidad mediante PCR/secuenciación. Este método se puede utilizar para detectar la adulteración del aceite de oliva. [ 126 ]

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Referencias

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