Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados

El polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados ( AFLP-PCR o AFLP ) es una herramienta basada en PCR que se utiliza en la investigación genética , la huella genética del ADN y la práctica de la ingeniería genética . Desarrollado a principios de la década de 1990 por Pieter Vos, ^{[ 1 ]} el AFLP utiliza enzimas de restricción para digerir el ADN genómico , seguido de la ligación de adaptadores a los extremos cohesivos de los fragmentos de restricción . A continuación, se selecciona un subconjunto de los fragmentos de restricción para su amplificación. Esta selección se logra utilizando cebadores complementarios a la secuencia del adaptador, la secuencia del sitio de restricción y algunos nucleótidos dentro de los fragmentos del sitio de restricción (como se describe en detalle más adelante). Los fragmentos amplificados se separan y visualizan en la electroforesis desnaturalizante en gel de agarosa , ya sea mediante autorradiografía o metodologías de fluorescencia , o mediante instrumentos automatizados de secuenciación capilar.

Aunque AFLP no debería usarse como acrónimo, comúnmente se le conoce como "polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados" (tomando prestado el término "polimorfismo de longitud de fragmentos de amplificación" utilizado en la huella genética por amplificación de ADN ^{[ 2 ]} ). Sin embargo, los datos resultantes no se clasifican como polimorfismos de longitud, sino como polimorfismos de presencia-ausencia. ^{[ 1 ]}

AFLP-PCR es un método altamente sensible para detectar polimorfismos en el ADN . La técnica fue descrita originalmente por Vos y Zabeau en 1993. ^{[ 3 ] [ 4 ]} En detalle, el procedimiento de esta técnica se divide en tres pasos:

1. Digestión del ADN celular total con una o más enzimas de restricción y ligación de adaptadores específicos de sitio de restricción a todos los fragmentos de restricción.
2. Amplificación selectiva de algunos de estos fragmentos con dos cebadores de PCR que poseen secuencias adaptadoras y específicas de sitios de restricción correspondientes.
3. Separación electroforética de los amplicones en una matriz de gel, seguida de la visualización del patrón de bandas.

Como se mencionó anteriormente, los resultados de AFLP se puntúan como varias secuencias de polimorfismos de presencia-ausencia. Estas secuencias se pueden comparar y se puede utilizar el agrupamiento jerárquico para generar un dendrograma.

• Con métodos como UPGMA (comúnmente utilizado para AFLP) y el método de unión de vecinos , se requiere una matriz de distancias. Existen varias ideas sobre cómo se puede crear una matriz de distancias:
  • Hill et al. (1996) utiliza la fórmula de Nei y Li (1979), que califica la presencia o ausencia en cada longitud discreta (secuencia de marcador 0/1). ^{[ 5 ]}
  • No todos los geles se corrien hasta el punto en que las longitudes se pueden resolver en incrementos de 1 base (ejemplos incluyen las dos imágenes de la sección), e incluso si son distinguibles, el conteo de bandas es propenso a errores. Desde 1999, los estudios abordan este problema considerando cada resultado como una secuencia de niveles de densidad (como una imagen de un píxel de altura). Estas secuencias se comparan entre sí mediante la correlación de Pearson . Esto también tiene la ventaja de utilizar diferentes niveles de densidad. ^{[ 6 ]}
• Dos métodos bayesianos separados, uno de MrBayes y el otro de Luo et al. (2007), primero traducen el resultado a secuencias de marcadores 0/1. ^{[ 7 ]}
• Un método bayesiano traduce las secuencias de densidad en parámetros de estructura poblacional. ^{[ 8 ]}

El problema con las secuencias marcadoras 0/1 es que se heredan de forma dominante, ^{[ 6 ]} pero la mayoría de los métodos estadísticos utilizados en ecología requieren datos codominantes. La representación de la densidad de secuencias del resultado de AFLP es adecuada para abordar este problema, siempre que el cambio en la densidad se deba a un cambio real en la cantidad relativa de ácidos nucleicos de un tamaño determinado y no a un error experimental. ^{[ 9 ]}

La tecnología AFLP permite detectar simultáneamente diversos polimorfismos en diferentes regiones genómicas. Además, es altamente sensible y reproducible. Por ello, se ha generalizado su uso para la identificación de variaciones genéticas en cepas o especies estrechamente relacionadas de plantas, hongos, animales y bacterias. Esta tecnología se ha empleado en pruebas forenses y de paternidad, para determinar pequeñas diferencias dentro de poblaciones y en estudios de ligamiento genético para generar mapas de loci de rasgos cuantitativos (QTL).

AFLP presenta numerosas ventajas en comparación con otras tecnologías de marcadores, como el ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y los microsatélites . AFLP no solo ofrece mayor reproducibilidad, resolución y sensibilidad a nivel de todo el genoma en comparación con otras técnicas, ^{[ 10 ]} sino que también permite amplificar entre 50 y 100 fragmentos simultáneamente. Esto la hace comparable a otra técnica de ADN amplificado arbitrariamente , la huella genética por amplificación de ADN (DAF). Además, no requiere información de secuencia previa para la amplificación. ^{[ 11 ]} En consecuencia, AFLP se ha convertido en una herramienta sumamente útil para el estudio de taxones como bacterias, hongos y plantas, donde aún se desconoce gran parte de la composición genómica de diversos organismos.

La tecnología AFLP está protegida por patentes y solicitudes de patente de Keygene NV. AFLP es una marca registrada de Keygene NV.

• ADN amplificado arbitrariamente
• Amplificación aleatoria de ADN polimórfico
• PCR con cebadores arbitrarios
• huella genética por amplificación de ADN

Software para analizar datos AFLP

• BioNumerics Gelcompar II Archivado el 10/06/2015 en Wayback Machine (Descontinuado ^{[ 1 ]} ) Una plataforma universal para gestionar y analizar todos sus datos biológicos, incluyendo AFLP
• KeyGene Quantar Suite: Software versátil para la puntuación de marcadores

Software gratuito para analizar datos AFLP

• SourceForge Genographer: Software gratuito para la puntuación manual (aplicación Java).
• SourceForge RawGeno: puntuación automatizada gratuita (entorno R CRAN, que incluye una interfaz gráfica de usuario intuitiva).

Programas en línea para la simulación de AFLP-PCR

• ALFIE - BProcariotas o secuencias cargadas
• AFLP-PCR in silico para procariotas , algunos eucariotas o secuencias cargadas.
• Enzimas para AFLP New England Biolabs
• Nota sobre tecnología AFLP en KeyGene
• Solicitudes AFLP