Formilación

La formilación del metanofurano inicia el ciclo de la metanogénesis . El grupo formilo se deriva del dióxido de carbono y se convierte en metano .

En bacterias y orgánulos, el inicio de la síntesis de proteínas se señala mediante la formación de formil-metionil-ARNt (ARNt ^fMet ). Esta reacción depende del 10-formiltetrahidrofolato y de la enzima metionil-ARNt formiltransferasa. ^{[ 9 ]} Esta reacción no se utiliza en eucariotas ni arqueas, ya que la presencia de ARNt ^fMet en células no bacterianas se considera material intrusivo y se elimina rápidamente. Tras su producción, el ARNt ^fMet se entrega a la subunidad 30S del ribosoma para iniciar la síntesis de proteínas. El fMet posee la misma secuencia de codones que la metionina. Sin embargo, el fMet solo se utiliza para el inicio de la síntesis de proteínas y, por lo tanto, se encuentra únicamente en el extremo N-terminal de la proteína. La metionina se utiliza durante el resto de la traducción. En E. coli , el ARNt ^fMet es reconocido específicamente por el factor de iniciación IF-2 , ya que el grupo formilo bloquea la formación del enlace peptídico en el extremo N-terminal de la metionina. ^{[ 9 ]}

Una vez completada la síntesis de proteínas, el grupo formilo de la metionina puede eliminarse mediante la enzima peptidil deformilasa . El residuo de metionina puede eliminarse aún más mediante la enzima metionina aminopeptidasa .

Se requieren dos reacciones de formilación en la síntesis de novo de once pasos del monofosfato de inosina (IMP) , precursor de los ribonucleótidos de purina AMP y GMP. La glicinamida ribonucleótido (GAR) transformilasa cataliza la formilación de GAR a formilglicinamidina ribótido (FGAR) en la cuarta reacción de la vía. En el penúltimo paso de la biosíntesis de purinas de novo, el 5-aminoimidazol-4-carboxiamida ribótido (AICAR) se formiló a 5-formaminoimidazol-4-carboxamida ribótido (FAICAR) por acción de la AICAR transformilasa . ^{[ 10 ]}

GAR transformilasa

La GAR transformilasa PurN se encuentra en eucariotas y procariotas. Sin embargo, se ha identificado una segunda GAR transformilasa, la GAR transformilasa PurT, en E. coli . Si bien ambas enzimas no presentan conservación de secuencia y requieren diferentes donantes de formilo, la actividad específica y la Km para GAR son las mismas en ambas GAR transformilasas, PurT y PurN.

PurN GAR transformilasa

La PurN GAR transformilasa 1CDE utiliza la coenzima N10-formiltetrahidrofolato (N10-formil-THF) como donador de formilo para formilar el grupo α-amino del GAR. En eucariotas, la PurN GAR transformilasa forma parte de una gran proteína multifuncional, pero se encuentra como una proteína única en procariotas. ^{[ 12 ]}

Mecanismo

Se propone que la reacción de formilación ocurra a través de una reacción de transferencia directa en la que el grupo amino de GAR ataca nucleofílicamente a N10-formil-THF creando un intermedio tetraédrico. ^{[ 10 ]} Como el grupo α-amino de GAR es relativamente reactivo, se propone que la desprotonación del nucleófilo ocurra por el solvente. En el sitio activo, Asn 106, His 108 y Asp 144 están posicionados para ayudar con la transferencia de formilo. ^{[ 12 ]} Sin embargo, estudios de mutagénesis han indicado que estos residuos no son individualmente esenciales para la catálisis, ya que solo las mutaciones de dos o más residuos inhiben la enzima. Con base en la estructura, se cree que el Asp144 cargado negativamente aumenta el pKa de His108, permitiendo que el grupo imidazolio protonado de His108 aumente la electrofilicidad del grupo formilo de N10-formil-THF. Además, se cree que His108 y Asn106 estabilizan el oxianión formado en el estado de transición. ^{[ 13 ]}

PurT GAR transformilasa

La transformilasa PurT GAR requiere formato como donador de formilo y ATP para la catálisis. Se estima que la transformilasa PurT GAR cataliza entre el 14 % y el 50 % de las formilaciones de GAR en E. coli . Esta enzima pertenece a la superfamilia de proteínas ATP-grasp . ^{[ 14 ]}

Mecanismo

Se ha propuesto un mecanismo secuencial para la PurT GAR transformilasa en el que se plantea la formación inicial de un intermedio de fosfato de formil de corta duración. Este intermedio sufre un ataque nucleofílico por parte de la amina GAR para la transferencia del grupo formilo. Se ha detectado un intermedio de fosfato de formil en experimentos de mutagénesis, en los que la PurT GAR transformilasa mutante mostró una baja afinidad por el formato. ^{[ 12 ]} La incubación de la PurT GAR transformilasa con fosfato de formil, ADP y GAR produce tanto ATP como FGAR. Esto indica además que el fosfato de formil puede ser un intermedio, ya que es cinética y químicamente competente para llevar a cabo la reacción de formilación en la enzima. ^{[ 15 ]} También se ha propuesto la formación de un intermedio de fosfato enzimático que precede al intermedio de fosfato de formil, basándose en estudios de intercambio isotópico posicional. ^{[ 15 ]} Sin embargo, los datos estructurales indican que el formato puede estar posicionado para un ataque directo sobre el γ-fosfato del ATP en el sitio activo de la enzima para formar el intermedio formilfosfato. ^{[ 14 ]}

transformilasa AICAR

La transformilasa de AICAR requiere la coenzima N10-formiltetrahidrofolato (N10-formil-THF) como donador de formilo para la formilación de AICAR a FAICAR. Sin embargo, la transformilasa de AICAR y la transformilasa de GAR no comparten una alta similitud de secuencia ni homología estructural. ^{[ 13 ]}

Mecanismo

La amina en AICAR es mucho menos nucleofílica que su contraparte en GAR debido a la deslocalización de electrones en AICAR a través de la conjugación. Por lo tanto, el nucleófilo N5 de AICAR debe activarse para que ocurra la reacción de formilación. Se ha descubierto que la histidina 268 y la lisina 267 son esenciales para la catálisis y se conservan en todas las transformilasas de AICAR. La histidina 268 participa en la desprotonación del nucleófilo N5 de AICAR, mientras que se propone que la lisina 267 estabiliza el intermedio tetraédrico. ^{[ 13 ]}

La ε-formilación es una de las muchas modificaciones postraduccionales que ocurren en las proteínas histonas, y se ha demostrado que modula las conformaciones de la cromatina y la activación génica.

Se ha identificado la formilación en el Nε de los residuos de lisina en histonas y proteínas. Esta modificación se ha observado en histonas de enlace y proteínas del grupo de alta movilidad , es muy abundante y se cree que desempeña un papel en la epigenética de la función de la cromatina. Se ha demostrado que las lisinas formiladas participan en la unión al ADN. Además, se ha detectado formilación en lisinas de histonas que también se sabe que están acetiladas y metiladas. Por lo tanto, la formilación puede bloquear otras modificaciones postraduccionales. ^{[ 16 ]} La formilación se detecta con mayor frecuencia en 19 sitios de modificación diferentes en la histona H1. La expresión genética de la célula se ve gravemente alterada por la formilación, lo que puede causar enfermedades como el cáncer. El desarrollo de estas modificaciones puede deberse al estrés oxidativo . ^{[ 16 ]}

En las proteínas histonas, la lisina se modifica típicamente por las histona acetiltransferasas (HAT) y las histona desacetilasas (HDAC o KDAC). La acetilación de la lisina es fundamental para la regulación y expresión de ciertos genes. El estrés oxidativo crea un entorno significativamente diferente en el que la acetil-lisina puede ser rápidamente desplazada por la formación de formil-lisina debido a la alta reactividad de las especies de formilfosfato. Actualmente se cree que esta situación es causada por el daño oxidativo del ADN. Se ha propuesto un mecanismo para la formación de formilfosfato, que depende en gran medida del ADN dañado por oxidación y está impulsado principalmente por la química de radicales dentro de la célula. ^{[ 17 ]} El formilfosfato producido puede luego usarse para formilar la lisina. Se cree que el estrés oxidativo juega un papel en la disponibilidad de residuos de lisina en la superficie de las proteínas y la posibilidad de ser formilados.

La inhibición de las enzimas implicadas en la biosíntesis de purinas se ha aprovechado como una posible diana farmacológica para la quimioterapia.

Las células cancerosas requieren altas concentraciones de purinas para facilitar la división ^{[ 12 ]} y tienden a depender de la síntesis de novo en lugar de la vía de recuperación de nucleótidos . ^{[ 13 ] [ 18 ]} Se han desarrollado varios inhibidores basados ​​en folato para inhibir las reacciones de formilación por GAR transformilasa y AICAR transformilasa. ^{[ 19 ]} El primer inhibidor de GAR transformilasa, Lometrexol [(6R)5,10-dideazatetrahidrofolato], se desarrolló en la década de 1980 a través de una colaboración entre Eli Lilly y laboratorios académicos. ^{[ 20 ]} Aunque similar en estructura a N10-formil-THF, el lometrexol es incapaz de llevar a cabo reacciones de transferencia de un carbono. ^{[ 19 ]} Además, también se han sintetizado varios inhibidores de GAR transformilasa basados ​​en GAR. ^{[ 19 ]} Se ha descubierto que el desarrollo de inhibidores basados ​​en folato es particularmente difícil, ya que estos inhibidores también regulan negativamente la enzima folilpoliglutamato sintasa , la cual agrega γ-glutamatos adicionales a los folatos monoglutamatos y antifolatos después de entrar en la célula para aumentar la afinidad enzimática. Esta mayor afinidad puede conducir a la resistencia a los antifolatos. ^{[ 18 ]}

El síndrome de Leigh es un trastorno neurodegenerativo que se ha relacionado con un defecto en una reacción de formilación enzimática. El síndrome de Leigh se asocia típicamente con defectos en la fosforilación oxidativa, que ocurre en las mitocondrias. ^{[ 21 ]} La secuenciación del exoma se ha utilizado para identificar una mutación en el gen que codifica la metionil-ARNt formiltransferasa mitocondrial (MTFMT) en pacientes con síndrome de Leigh. Se cree que la mutación c.626C>T identificada en MTFMT que produce síntomas del síndrome de Leigh altera el empalme del exón, lo que conduce a una mutación de cambio de marco de lectura y un codón de parada prematuro. Se encontró que los individuos con la mutación MTFMT c.626C>T tenían niveles reducidos de fMet-ARNtMet y cambios en el nivel de formilación de COX1 traducido mitocondrialmente. Esta relación proporciona evidencia de la necesidad de metionina formilada en el inicio de la expresión de ciertos genes mitocondriales. ^{[ 22 ]}