Holliday junction

A Holliday junction is a branched nucleic acid structure that contains four double-stranded arms joined. These arms may adopt one of several conformations depending on buffer salt concentrations and the sequence of nucleobases closest to the junction. The structure is named after Robin Holliday, the molecular biologist who proposed its existence in 1964.^[1]

In biology, Holliday junctions are a key intermediate in many types of genetic recombination, as well as in double-strand break repair. These junctions usually have a symmetrical sequence and are thus mobile, meaning that the four individual arms may slide through the junction in a specific pattern that largely preserves base pairing. Additionally, four-arm junctions similar to Holliday junctions appear in some functional RNA molecules.

Immobile Holliday junctions, with asymmetrical sequences that lock the strands in a specific position, were artificially created by scientists to study their structure as a model for natural Holliday junctions. These junctions also later found use as basic structural building blocks in DNA nanotechnology, where multiple Holliday junctions can be combined into specific designed geometries that provide molecules with a high degree of structural rigidity.

Molecular structure of a stacked Holliday junction, in which the four arms stack into two double-helical domains. Note how the blue and red strands remain roughly helical, while the green and yellow strands cross over between the two domains.

Molecular structure of an unstacked (open-X) Holliday junction. This conformation lacks base stacking between the double-helical domains, and is stable only in solutions lacking divalent metal ions such as Mg²⁺. From PDB: 3CRX​.

Las uniones de Holliday pueden existir en una variedad de isómeros conformacionales con diferentes patrones de apilamiento coaxial entre los cuatro brazos de doble hélice. El apilamiento coaxial es la tendencia de los extremos romos de los ácidos nucleicos a unirse entre sí mediante interacciones entre las bases expuestas. Existen tres conformaciones posibles: una forma no apilada (o en X abierta) y dos formas apiladas. La forma no apilada predomina en ausencia de cationes divalentes como ^el Mg²⁺ , debido a la repulsión electrostática entre las cadenas principales cargadas negativamente de las hebras. En presencia de al menos aproximadamente 0,1 mM de ^Mg²⁺ , la repulsión electrostática se contrarresta y predominan las estructuras apiladas. Hasta el año 2000, no se sabía con certeza si el apantallamiento electrostático era el resultado de la unión específica de cationes a la unión o de la presencia de una acumulación difusa de iones en solución. ^{[ 2 ]}

La forma no apilada es una conformación extendida, casi plana y cuadrada. Por otro lado, los conformeros apilados tienen dos dominios de doble hélice continuos separados por un ángulo de aproximadamente 60° en dirección dextrógira . Dos de las cuatro hebras permanecen aproximadamente helicoidales, dentro de cada uno de los dos dominios de doble hélice, mientras que las otras dos se cruzan entre los dos dominios de forma antiparalela . ^{[ 2 ]}

Las dos posibles formas apiladas difieren en qué pares de brazos se apilan entre sí; cuál de las dos predomina depende en gran medida de las secuencias de bases más cercanas a la unión. Algunas secuencias dan como resultado un equilibrio entre los dos conformeros, mientras que otras prefieren fuertemente un único conformero. En particular, las uniones que contienen la secuencia A-CC que une el punto de unión parecen preferir fuertemente el conformero que permite la formación de un enlace de hidrógeno entre la segunda citosina y uno de los fosfatos en el punto de unión. Si bien la mayoría de los estudios se han centrado en la identidad de las cuatro bases más cercanas a la unión en cada brazo, es evidente que las bases más alejadas también pueden afectar las conformaciones de apilamiento observadas. ^{[ 2 ]}

En las uniones con secuencias simétricas, el punto de ramificación es móvil y puede migrar mediante un proceso de paseo aleatorio . La velocidad de migración de la ramificación varía drásticamente con la concentración de iones, con tiempos de paso único que aumentan de 0,3 a 0,4 ms sin iones a 270-300 ms con 10 mM de Mg²⁺ ^. El cambio en la velocidad se correlaciona con la formación de estructuras apiladas frente a estructuras no apiladas. ^{[ 2 ]}

Las uniones de Holliday con una muesca , o rotura en una de las hebras, en el punto de unión adoptan una orientación perpendicular y siempre prefieren el conformero de apilamiento que coloca la muesca en una hebra de cruce en lugar de una hebra helicoidal. ^{[ 2 ]}

Las uniones de Holliday del ARN adoptan una conformación apilada antiparalela a altas concentraciones de magnesio, una conformación apilada perpendicular a concentraciones moderadas y rotan hacia una conformación apilada paralela a bajas concentraciones, mientras que incluso pequeñas concentraciones de iones de calcio favorecen el conformero antiparalelo. ^{[ 2 ]}

La unión de Holliday es un intermediario clave en la recombinación homóloga , un proceso biológico que aumenta la diversidad genética mediante el desplazamiento de genes entre dos cromosomas , así como en eventos de recombinación sitio-específica que involucran integrasas . Además, participan en la reparación de roturas de doble cadena . ^{[ 2 ]} Asimismo, pueden surgir estructuras cruciformes que involucran uniones de Holliday para aliviar la tensión helicoidal en secuencias simétricas en superenrollamientos de ADN . ^{[ 3 ]} Si bien las uniones de cuatro brazos también aparecen en moléculas de ARN funcionales , como el ARN espliceosómico U1 y la ribozima en horquilla del virus de la mancha anular del tabaco , estas generalmente contienen nucleótidos no apareados entre los dominios de doble hélice apareados y, por lo tanto, no adoptan estrictamente la estructura de Holliday. ^{[ 2 ]}

Las uniones de Holliday en la recombinación homóloga se producen entre secuencias idénticas o casi idénticas, lo que da lugar a una disposición simétrica de las secuencias alrededor de la unión central. Esto permite que se produzca un proceso de migración de ramificación en el que las hebras se mueven a través del punto de unión. ^{[ 2 ]} La escisión, o resolución, de la unión de Holliday puede ocurrir de dos maneras. La escisión del conjunto original de hebras da lugar a dos moléculas que pueden mostrar conversión génica pero no entrecruzamiento cromosómico , mientras que la escisión del otro conjunto de dos hebras provoca que las moléculas recombinantes resultantes muestren entrecruzamiento. Todos los productos, independientemente de la escisión, son heterodúplex en la región de migración de la unión de Holliday. ^{[ 4 ]}

Muchas proteínas pueden reconocer o distorsionar la estructura de la unión de Holliday. Una clase de estas proteínas incluye enzimas que resuelven las uniones, las cuales las escinden, a veces de forma específica de secuencia. Dichas proteínas distorsionan la estructura de la unión de diversas maneras, a menudo provocando que adopte una conformación no apilada, rompiendo los pares de bases centrales y/o cambiando los ángulos entre los cuatro brazos. Otras clases son las proteínas de migración de ramificación, que aumentan la tasa de intercambio en varios órdenes de magnitud, y las recombinasas específicas de sitio . ^{[ 2 ]} En procariotas, las resolvasas de la unión de Holliday se dividen en dos familias: integrasas y nucleasas, que son estructuralmente similares, aunque sus secuencias no están conservadas. ^{[ 4 ]}

En eucariotas, dos modelos principales para la reparación de roturas de doble cadena en el ADN mediante recombinación homóloga son la vía de reparación de roturas de doble cadena (DSBR, por sus siglas en inglés) (a veces denominada modelo de unión de Holliday doble ) y la vía de recocido de cadena dependiente de la síntesis (SDSA, por sus siglas en inglés). ^{[ 5 ]} En el caso de una rotura de doble cadena, el extremo 3' se degrada y el extremo 5', más largo, invade la cromátida hermana contigua, formando una burbuja de replicación. A medida que esta burbuja se acerca al ADN roto, la cadena antisentido 5', más larga, invade nuevamente la cadena sentido de esta porción de ADN, transcribiendo una segunda copia. Cuando finaliza la replicación, ambas colas se reconectan para formar dos uniones de Holliday, que luego son escindidas en diversos patrones por proteínas. ^{[ 6 ]} Aquí se puede ver una animación de este proceso . ^{[ 7 ]}

Las roturas de ADN de doble cadena en bacterias son reparadas por la vía RecBCD de recombinación homóloga. Se cree que las roturas que ocurren en solo una de las dos cadenas de ADN, conocidas como huecos de cadena simple, son reparadas por la vía RecF . Ambas vías, RecBCD y RecF, incluyen una serie de reacciones conocidas como migración de rama, en la que se intercambian cadenas simples de ADN entre dos moléculas de ADN dúplex entrecruzadas, y resolución , en la que esas dos moléculas de ADN entrecruzadas se cortan y se restauran a su estado normal de doble cadena. ^{[ 8 ]} La recombinación homóloga ocurre en varios grupos de virus. En virus de ADN como el herpesvirus , la recombinación ocurre a través de un mecanismo de rotura y unión como en bacterias y eucariotas. ^{[ 9 ]} En bacterias, la migración de rama es facilitada por el complejo RuvABC o la proteína RecG , motores moleculares que utilizan la energía de la hidrólisis de ATP para mover la unión. La unión debe entonces resolverse en dos dúplex separados, restaurando la configuración parental o una configuración entrecruzada. La resolución puede ocurrir de forma horizontal o vertical durante la recombinación homóloga, dando productos de parche (si están en la misma orientación durante la reparación de roturas de doble cadena) o productos de empalme (si están en diferentes orientaciones durante la reparación de roturas de doble cadena). ^{[ 10 ] [ 11 ]} RuvA y RuvB son proteínas de migración de ramificación, mientras que RuvC es una enzima de resolución de uniones. ^{[ 2 ]}

Existe evidencia de recombinación en algunos virus de ARN , específicamente en virus de ARN monocatenario de sentido positivo como los retrovirus , picornavirus y coronavirus . Existe controversia sobre si la recombinación homóloga ocurre en virus de ARN monocatenario de sentido negativo como la influenza . ^{[ 12 ]}

La nanotecnología del ADN consiste en el diseño y la fabricación de estructuras artificiales de ácidos nucleicos como materiales de ingeniería para la nanotecnología , en lugar de como portadores de información genética en células vivas. Este campo utiliza estructuras de ADN ramificadas como componentes fundamentales para crear estructuras más complejas y diseñadas racionalmente. Las uniones de Holliday son, por lo tanto, componentes de muchas de estas estructuras de ADN. Dado que los complejos de uniones de Holliday aislados son demasiado flexibles para ensamblarse en grandes matrices ordenadas, se utilizan motivos estructurales con múltiples uniones de Holliday para crear " baldosas " rígidas que luego pueden ensamblarse en "matrices" más grandes. ^{[ 24 ] [ 25 ]}

El motivo más común de este tipo es el complejo de doble cruce (DX), que contiene dos uniones de Holliday muy próximas entre sí, lo que da como resultado una estructura rígida que puede autoensamblarse en conjuntos más grandes. La estructura de la molécula DX obliga a las uniones de Holliday a adoptar una conformación con los dominios de doble hélice directamente uno al lado del otro, en contraste con su ángulo preferido de aproximadamente 60°. El complejo puede diseñarse para forzar las uniones a una orientación paralela o antiparalela, pero en la práctica la variante antiparalela se comporta mejor y la versión paralela se usa raramente. ^{[ 24 ] [ 25 ]}

El motivo estructural DX es el componente básico del método de origami de ADN , que se utiliza para crear estructuras bidimensionales y tridimensionales de mayor tamaño y forma arbitraria. En lugar de utilizar teselas DX individuales, una única hebra larga de andamiaje se pliega en la forma deseada mediante varias hebras cortas de anclaje. Al ensamblarse, la hebra de andamiaje es continua a través de los dominios de doble hélice, mientras que las hebras de anclaje participan en las uniones de Holliday como hebras de entrecruzamiento. ^{[ 27 ]}

Se han demostrado algunos tipos de teselas que conservan el ángulo nativo de 60° de la unión de Holliday. Una de estas matrices utiliza teselas que contienen cuatro uniones de Holliday en una disposición de paralelogramo. Esta estructura tuvo la ventaja de permitir la visualización directa del ángulo de la unión mediante microscopía de fuerza atómica . Se han utilizado teselas de tres uniones de Holliday en forma triangular para crear matrices tridimensionales periódicas para su uso en cristalografía de rayos X de biomoléculas. Estas estructuras reciben su nombre por su similitud con unidades estructurales basadas en el principio de tensegridad , que utiliza elementos tanto en tensión como en compresión. ^{[ 24 ] [ 25 ]}

Robin Holliday propuso la estructura de unión que ahora lleva su nombre como parte de su modelo de recombinación homóloga en 1964, basándose en su investigación sobre los organismos Ustilago maydis y Saccharomyces cerevisiae . El modelo proporcionó un mecanismo molecular que explicaba tanto la conversión génica como el entrecruzamiento cromosómico . Holliday se dio cuenta de que la vía propuesta crearía segmentos de ADN heteroduplex con bases mal apareadas entre diferentes versiones de un mismo gen. Predijo que la célula tendría un mecanismo de reparación de bases mal apareadas, que posteriormente se descubrió. ^{[ 4 ]} Antes del modelo de Holliday, el modelo aceptado implicaba un mecanismo de copia-elección ^{[ 28 ]} donde la nueva hebra se sintetiza directamente a partir de partes de las diferentes hebras parentales. ^{[ 29 ]}

En el modelo original de Holliday para la recombinación homóloga, las roturas de cadena simple ocurren en el mismo punto de una de las hebras de cada ADN parental. Los extremos libres de cada hebra rota migran a la otra hélice de ADN. Allí, las hebras invasoras se unen a los extremos libres que encuentran, dando lugar a la unión de Holliday. A medida que cada hebra de entrecruzamiento se vuelve a unir a su hebra compañera original, desplaza la hebra complementaria original que se encuentra delante. Esto provoca la migración de la unión de Holliday, creando los segmentos heteroduplex. Dependiendo de qué hebra se utilizó como plantilla para reparar la otra, las cuatro células resultantes de la meiosis podrían terminar con tres copias de un alelo y solo una del otro, en lugar de las dos copias normales de cada uno, una propiedad conocida como conversión génica. ^{[ 4 ]}

El modelo original de Holliday asumía que el ADN heteroduplex estaría presente en ambos cromosomas, pero los datos experimentales en levadura lo refutaron. Un modelo actualizado de Matt Meselson y Charley Radding en 1975 introdujo la idea de la migración de ramas. ^{[ 28 ]} Observaciones posteriores en la década de 1980 llevaron a la propuesta de mecanismos alternativos para la recombinación, como el modelo de rotura de doble cadena (por Jack Szostak , Frank Stahl y otros) y el modelo de recocido de cadena simple. Un tercer modelo, el de recocido de cadena dependiente de la síntesis, no involucraba uniones de Holliday. ^{[ 4 ]}

La primera evidencia experimental de la estructura de la unión de Holliday provino de estudios de microscopía electrónica a finales de la década de 1970, donde la estructura de cuatro brazos era claramente visible en imágenes de ADN de plásmidos y bacteriófagos . Posteriormente, en la década de 1980, se identificaron las enzimas responsables de iniciar la formación y la unión a las uniones de Holliday, aunque hasta 2004 la identificación de las resolvasas de la unión de Holliday en mamíferos seguía siendo esquiva (sin embargo, véase la sección "Resolución de las uniones de Holliday" más arriba para obtener información más reciente). En 1983, Nadrian Seeman construyó por primera vez moléculas artificiales de unión de Holliday a partir de oligonucleótidos sintéticos , lo que permitió un estudio más directo de sus propiedades físicas. Gran parte del análisis inicial de la estructura de la unión de Holliday se infirió a partir de estudios de electroforesis en gel , FRET y huellas de radicales hidroxilo y nucleasas . En la década de 1990, se dispuso de métodos de cristalografía y RMN de ácidos nucleicos , así como de herramientas de modelado molecular computacional . ^{[ 2 ] [ 4 ] [ 30 ]}

Inicialmente, los genetistas asumieron que la unión adoptaría una conformación paralela en lugar de antiparalela , porque eso colocaría los dúplex homólogos en una alineación más cercana entre sí. ^{[ 2 ]} El análisis químico en la década de 1980 mostró que la unión en realidad prefería la conformación antiparalela, un hallazgo que se consideró controvertido, y el propio Robin Holliday inicialmente dudó de los resultados. ^{[ 2 ] [ 4 ]} La estructura antiparalela fue posteriormente ampliamente aceptada debido a datos de cristalografía de rayos X en moléculas in vitro , aunque hasta 2004 las implicaciones para la estructura in vivo seguían sin estar claras, especialmente porque la estructura de las uniones a menudo se ve alterada por las proteínas unidas a ella. ^{[ 4 ]}

La base conceptual de la nanotecnología del ADN fue establecida por primera vez por Nadrian Seeman a principios de la década de 1980. ^{[ 31 ]} En ese momento se conocían varias estructuras de ADN ramificadas naturales, incluyendo la horquilla de replicación del ADN y la unión de Holliday móvil, pero la intuición de Seeman fue que se podían crear uniones de ácidos nucleicos inmóviles diseñando adecuadamente las secuencias de hebras para eliminar la simetría en la molécula ensamblada, y que estas uniones inmóviles podrían, en principio, combinarse en redes cristalinas rígidas. El primer artículo teórico que proponía este esquema se publicó en 1982, y la primera demostración experimental de una unión de ADN inmóvil se publicó al año siguiente. ^{[ 25 ] [ 32 ]} Seeman desarrolló el motivo de doble cruce (DX) más rígido , adecuado para formar redes bidimensionales, demostrado en 1998 por él y Erik Winfree . ^{[ 24 ]} En 2006, Paul Rothemund demostró por primera vez la técnica de origami de ADN para crear de forma sencilla y robusta estructuras de ADN plegadas de forma arbitraria. Este método permitió la creación de estructuras mucho más grandes que las que eran posibles anteriormente, y que son menos exigentes técnicamente para diseñar y sintetizar. ^{[ 33 ]} La síntesis de una red tridimensional fue finalmente publicada por Seeman en 2009, casi treinta años después de que se propusiera lograrla. ^{[ 34 ]}

• Holliday+junctions en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• Cambio conformacional de la unión de Holliday
• Análisis de las actividades de migración de ramificación de proteínas utilizando sustratos de ADN sintético (un protocolo)