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Microscopio electrónico de barrido

La imagen de los granos de polen tomada con un microscopio electrónico de barrido (SEM) muestra la profundidad de campo característica de las micrografías SEM. El primer microsc...

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La imagen de los granos de polen tomada con un microscopio electrónico de barrido (SEM) muestra la profundidad de campo característica de las micrografías SEM.
El primer microscopio electrónico de barrido (SEM) de M. von Ardenne
Microscopio electrónico de barrido con cámara de muestras abierta
Microscopio electrónico de barrido (SEM) de tipo analógico

Un microscopio electrónico de barrido ( MEB ) es un tipo de microscopio electrónico que produce imágenes de una muestra al escanear su superficie con un haz de electrones enfocado . Los electrones interactúan con los átomos de la muestra, produciendo diversas señales que contienen información sobre la topografía y composición de la superficie. El haz de electrones se escanea en un patrón de barrido raster , y la posición del haz se combina con la intensidad de la señal detectada para producir una imagen. En el modo de MEB más común, los electrones secundarios emitidos por los átomos excitados por el haz de electrones se detectan mediante un detector de electrones secundarios ( detector Everhart-Thornley ). El número de electrones secundarios que se pueden detectar, y por lo tanto la intensidad de la señal, depende, entre otras cosas, de la topografía de la muestra. Algunos MEB pueden alcanzar resoluciones mejores que 1 nanómetro .

Las muestras se observan en alto vacío en un microscopio electrónico de barrido (MEB) convencional , o en bajo vacío o en condiciones húmedas en un MEB de presión variable o ambiental, y a un amplio rango de temperaturas criogénicas o elevadas con instrumentos especializados. [ 1 ]

Historia

McMullan ha presentado un relato de la historia temprana de la microscopía electrónica de barrido. [ 2 ] [ 3 ] Aunque Max Knoll produjo una foto con un  ancho de campo de objeto de 50 mm que mostraba contraste de canalización mediante el uso de un escáner de haz de electrones, [ 4 ] fue Manfred von Ardenne quien en 1937 inventó [ 5 ] un microscopio con alta resolución al escanear una trama muy pequeña con un haz de electrones desmagnificado y finamente enfocado. En el mismo año, Cecil E. Hall también completó la construcción del primer microscopio de emisión en América del Norte, solo dos años después de que su supervisor, EF Burton en la Universidad de Toronto, se lo encargara. [ 6 ] Ardenne aplicó el escaneo del haz de electrones en un intento de superar la resolución del microscopio electrónico de transmisión (TEM), así como de mitigar problemas sustanciales con la aberración cromática inherente a la imagen real en el TEM. Además, analizó los diversos modos de detección, posibilidades y teoría del SEM, [ 7 ] junto con la construcción del primer SEM de alta resolución. [ 8 ] El grupo de Zworykin informó sobre trabajos posteriores , [ 9 ] seguidos por los grupos de Cambridge en las décadas de 1950 y principios de 1960, [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] dirigidos por Charles Oatley , todo lo cual finalmente condujo a la comercialización del primer instrumento comercial por parte de Cambridge Scientific Instrument Company como el "Stereoscan" en 1965, que fue entregado a DuPont .

Principios y capacidades

fuente de electrones emisor Schottky
Volumen de interacción electrón-materia y tipos de señal generada

Las señales que utiliza un microscopio electrónico de barrido (SEM) para crear una imagen resultan de las interacciones entre el haz de electrones y los átomos a diferentes profundidades dentro de la muestra. Se producen varios tipos de señales, incluyendo electrones secundarios (SE), electrones reflejados o retrodispersados ​​(BSE), rayos X característicos y luz ( catodoluminiscencia ) (CL), corriente absorbida (corriente de la muestra) y electrones transmitidos. [ 14 ] La obtención de imágenes de electrones secundarios y los detectores de electrones retrodispersados ​​son métodos estándar en un SEM [ 15 ] , pero se pueden utilizar detectores adicionales para capturar señales adicionales. Por ejemplo, los rayos X emitidos se pueden detectar mediante espectrometría de rayos X de energía dispersiva. [ 16 ]

Los electrones secundarios tienen energías muy bajas, del orden de 50 eV , lo que limita su recorrido libre medio en la materia sólida. Por consiguiente, los electrones secundarios solo pueden escapar de los pocos nanómetros superiores de la superficie de una muestra. La señal de los electrones secundarios tiende a estar altamente localizada en el punto de impacto del haz de electrones primarios, lo que permite obtener imágenes de la superficie de la muestra con una resolución inferior a 1 nm . Los electrones retrodispersados ​​(BSE) son electrones del haz que se reflejan en la muestra por dispersión elástica . Dado que tienen una energía mucho mayor que los electrones secundarios, emergen de ubicaciones más profundas dentro de la muestra y, por consiguiente, la resolución de las imágenes de BSE es menor que la de las imágenes de electrones secundarios. Sin embargo, los BSE se utilizan a menudo en la microscopía electrónica de barrido analítica, junto con los espectros obtenidos a partir de los rayos X característicos, porque la intensidad de la señal de BSE está fuertemente relacionada con el número atómico (Z) de la muestra. Las imágenes de BSE pueden proporcionar información sobre la distribución, pero no la identidad, de los diferentes elementos en la muestra. En muestras compuestas predominantemente de elementos ligeros, como especímenes biológicos, la imagen BSE puede visualizar inmunomarcadores de oro coloidal de 5 o 10 nm de diámetro, que de otro modo serían difíciles o imposibles de detectar en imágenes de electrones secundarios. [ 17 ] Se emiten rayos X característicos cuando el haz de electrones elimina un electrón de la capa interna de la muestra, lo que provoca que un electrón de mayor energía llene la capa y libere energía. La energía o longitud de onda de estos rayos X característicos se puede medir mediante espectroscopia de rayos X de energía dispersiva o espectroscopia de rayos X de longitud de onda dispersiva y se utiliza para identificar y medir la abundancia de elementos en la muestra y mapear su distribución.   

Debido al haz de electrones muy estrecho, las micrografías SEM tienen una gran profundidad de campo que produce una apariencia tridimensional característica útil para comprender la estructura superficial de una muestra. [ 18 ] Esto se ejemplifica con la micrografía de polen que se muestra arriba. Es posible un amplio rango de aumentos, desde aproximadamente 10 veces (aproximadamente equivalente al de una lupa potente) hasta más de 500 000 veces, aproximadamente 250 veces el límite de aumento de los mejores microscopios ópticos .

Preparación de la muestra

Una araña recubierta de oro mediante pulverización catódica , preparada para su observación con un microscopio electrónico de barrido (SEM).
Micrografía de bajo voltaje (300  V) de la distribución de gotas adhesivas en una nota Post-it . No se aplicó ningún recubrimiento conductor, ya que dicho recubrimiento alteraría esta frágil muestra.

Las muestras SEM deben ser lo suficientemente pequeñas para caber en la platina de la muestra, aseguradas con una pintura conductora. El vacío relativamente bajo (0,076 a 20 torr ) de la SEM de presión variable y ambiental evita la necesidad de limpieza, incluso aquellas con películas de agua o aceite, lo que permite la observación en estado natural. La preparación es idéntica a los pasos utilizados en muestras pulidas para microscopía óptica. Las técnicas SEM se pueden utilizar para examinar el estado de los circuitos integrados y los puntos de fijación. El acortamiento se logra inclinando cualquier muestra. El recubrimiento por pulverización catódica se utiliza para aplicar una capa delgada de metal o aleación metálica a muestras no conductoras. [ 19 ] Los materiales conductores que se utilizan actualmente para el recubrimiento de muestras incluyen oro , aleación de oro/ paladio , platino , iridio , tungsteno , cromo y osmio . [ 17 ] . Una alternativa al recubrimiento para algunas muestras biológicas es aumentar la conductividad volumétrica del material mediante impregnación con osmio utilizando variantes del método de tinción OTO (O- tetróxido de osmio , T- tiocarbohidrazida , O- osmio ). [ 20 ] [ 21 ]

Muestras biológicas

Dado que la cámara de muestras del SEM está bajo alto vacío, una muestra de SEM debe estar completamente seca o enfriada criogénicamente. [ 22 ] Los materiales duros y secos como madera, hueso, plumas, insectos secos o conchas (incluidas las cáscaras de huevo [ 23 ] ) se pueden examinar con poco tratamiento adicional, pero las células y tejidos vivos y los organismos completos de cuerpo blando requieren fijación química para preservar y estabilizar su estructura.

La fijación se realiza generalmente mediante incubación en una solución de un fijador químico tamponado , como el glutaraldehído , a veces en combinación con formaldehído [ 22 ] [ 24 ] [ 25 ] y otros fijadores, [ 26 ] y opcionalmente seguida de postfijación con tetróxido de osmio. [ 22 ] El tejido fijado se deshidrata. Debido a que el secado al aire causa colapso y contracción, esto se logra comúnmente reemplazando el agua en las células con solventes orgánicos como etanol o acetona , y reemplazando estos solventes a su vez con un fluido de transición como dióxido de carbono líquido mediante secado en punto crítico . [ 27 ] El dióxido de carbono se elimina finalmente mientras está en estado supercrítico, de modo que no haya interfase gas-líquido dentro de la muestra durante el secado.

La muestra seca se suele montar en un soporte con un adhesivo como resina epoxi o cinta adhesiva de doble cara conductora, y se recubre con oro o aleación de oro/paladio mediante pulverización catódica antes de su examen microscópico. Las muestras pueden seccionarse (con un micrótomo ) si se desea obtener información sobre la ultraestructura interna del organismo para su observación.

Si el SEM está equipado con una platina fría para criomicroscopía, se puede utilizar la criofijación y realizar microscopía electrónica de barrido a baja temperatura en las muestras fijadas criogénicamente. [ 22 ] Las muestras criofijadas se pueden criofracturar al vacío en un aparato especial para revelar la estructura interna, recubrir con una capa de pulverización catódica y transferir a la platina criogénica del SEM mientras aún están congeladas. [ 28 ] La microscopía electrónica de barrido a baja temperatura (LT-SEM) también es aplicable a la obtención de imágenes de materiales sensibles a la temperatura, como el hielo [ 29 ] [ 30 ] y las grasas. [ 31 ]

La criofractura, el grabado por congelación o la congelación y rotura son métodos de preparación particularmente útiles para examinar las membranas lipídicas y sus proteínas incorporadas en una vista frontal. Este método revela las proteínas incrustadas en la bicapa lipídica.

Materiales

Según Goldstein et al., "Hay muchas maneras de seccionar las muestras, incluyendo el aserrado con cuchilla, el aserrado con alambre, el corte abrasivo, la fractura (mejor para materiales más frágiles), el cizallamiento, la erosión por chispa y la microtomía . La superficie que se va a preparar para el análisis microestructural se pule utilizando una secuencia gradual de materiales abrasivos. Las muestras cerámicas y geológicas, como los metales, pueden requerir grabado para permitir que las características microestructurales se visualicen o analicen en el SEM". Sin embargo, la trayectoria del haz de electrones desde la superficie de la muestra hasta tierra debe permanecer intacta para asegurar que la muestra no actúe como un espejo de electrones cuando se acumula una carga suficiente igual a la del haz incidente, lo que se conoce como "carga". Según Goldstein et al., "La mejor y más sencilla manera de superar los problemas de carga es depositar una capa delgada de metal en la superficie de la muestra". Esto se logra mediante recubrimiento por evaporación al vacío o recubrimiento por pulverización catódica. Para elementos con números atómicos del 8 al 20, solo el carbono, el aluminio y el cromo son materiales de recubrimiento adecuados. [ 19 ] : 539–545, 648–669

La FIB es análoga a la SEM, pero utiliza iones con carga positiva en lugar de electrones. Además de la obtención de imágenes, la FIB se puede utilizar para el corte de precisión, el grabado o la deposición de materiales conductores en la superficie de la muestra. [ 19 ] : 553

Proceso de escaneo y formación de imágenes

Esquema de un microscopio electrónico de barrido (SEM)

El microscopio electrónico de barrido (SEM) consta de una columna de electrones, con el cañón de electrones, lentes electrónicas y bombas de vacío, además de una consola de control con pantalla y controles del haz de electrones. El cañón de electrones genera y acelera electrones entre 0,1 y 30 kE . Las lentes electrónicas enfocan el haz de electrones a menos de 10 nm en la muestra, donde interactúa con ella a una profundidad de aproximadamente 1 micrómetro , generando señales utilizadas para la obtención de imágenes punto por punto. Las bobinas de deflexión barren el haz de electrones a través de la muestra en forma de barrido raster , y los electrones retrodispersados ​​y secundarios son recogidos por el detector de electrones, formando una imagen que puede procesarse y visualizarse digitalmente. La nitidez y la visibilidad de las características se controlan mediante el tamaño de la sonda electrónica, la corriente de la sonda electrónica, el ángulo de convergencia de la sonda electrónica y la tensión de aceleración del haz de electrones. Según Goldstein et al., «La mayoría de los SEM más antiguos utilizan emisores termoiónicos de tungsteno o LaB6 , pero, cada vez más, los microscopios nuevos están equipados con fuentes de emisión de campo frío, térmico o Schottly, ya que estas proporcionan un rendimiento, una fiabilidad y una vida útil superiores». [ 19 ] : 21–60

Mecanismos de emisión de electrones secundarios, electrones retrodispersados ​​y rayos X característicos de los átomos de la muestra.
Serie de imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) a baja temperatura para un cristal de nieve . Los cristales se capturan, almacenan y recubren con platino mediante pulverización catódica a temperaturas criogénicas para su posterior análisis.

Aumento

La magnificación en un microscopio electrónico de barrido (MEB) se puede controlar en un rango de aproximadamente 6 órdenes de magnitud, desde 10 hasta 3.000.000 de veces. [ 32 ] El cambio de magnificación se logra ajustando la longitud del escaneo en la muestra; una mayor magnificación requiere un área de muestra o píxel menor . [ 19 ] : 108–113

Detección de electrones secundarios

El modo de imagen más común recoge electrones secundarios de baja energía (<50 eV) que se emiten desde las bandas de conducción o valencia de los átomos de la muestra mediante interacciones de dispersión inelástica con los electrones del haz. Debido a su baja energía, estos electrones se originan a pocos nanómetros por debajo de la superficie de la muestra. [ 18 ] Los electrones son detectados por un detector Everhart-Thornley . [ 33 ] Según Goldstein et al., "El desarrollo del detector ET proporcionó el primer uso eficiente de la rica señal de electrones secundarios/retrodispersados ​​con un gran ángulo sólido de recolección, alta ganancia de amplificación, bajo ruido y un rendimiento robusto y de bajo mantenimiento". Se emite luz cuando un electrón energético incide sobre un material centelleador , que se conduce a través de una guía de luz a un fotomultiplicador , el cual proporciona alta ganancia, poca degradación del ruido, gran ancho de banda y una rápida velocidad de respuesta. [ 19 ] : 128–129

Detección de electrones retrodispersados

Comparación de técnicas SEM: Arriba: análisis de electrones retrodispersados ​​– composición Abajo: análisis de electrones secundarios – topografía  

Los electrones retrodispersados ​​(BSE) consisten en electrones de alta energía originados en el haz de electrones, que se reflejan o retrodispersan fuera del volumen de interacción de la muestra mediante interacciones de dispersión elástica con los átomos de la muestra. Dado que los elementos pesados ​​(de alto número atómico) retrodispersan los electrones con mayor intensidad que los elementos ligeros (de bajo número atómico) y, por lo tanto, aparecen más brillantes en la imagen, los BSE se utilizan para detectar el contraste entre áreas con diferentes composiciones químicas. [ 18 ] Según Goldstein et al., «Cuando el detector de electrones retrodispersados ​​(ET) está polarizado negativamente, solo se detectan los electrones retrodispersados. Todos los electrones secundarios se rechazan, incluidos los que se emiten desde la muestra en dirección al detector ET dentro del ángulo sólido de la línea de visión para la recolección geométrica directa. Los detectores de electrones retrodispersados ​​específicos están diseñados para aumentar considerablemente el ángulo sólido de recolección». Estos incluyen los detectores de electrones retrodispersados ​​de centelleo pasivo, el detector de conversión de electrones retrodispersados ​​a secundarios y el detector de diodo de estado sólido. [ 19 ] : 129–133

Los electrones retrodispersados ​​también pueden utilizarse para formar una imagen de difracción de electrones retrodispersados ​​(EBSD) que puede emplearse para determinar la estructura cristalográfica de la muestra. [ 19 ] : 10

Análisis de semiconductores mediante inyección de haz

La microscopía SEM de contraste de voltaje y recolección de carga se utiliza para caracterizar el rendimiento eléctrico de circuitos integrados y dispositivos semiconductores. La recolección de carga utiliza las corrientes o voltajes inducidos en la muestra por el haz de electrones. La corriente inducida por haz de electrones (EBIC) se utiliza para estudiar barreras Schottky , uniones pn difusas e implantadas con iones . [ 19 ] : 546

Catodoluminiscencia

Superposición de catodoluminiscencia de color sobre una imagen SEM de un policristal de InGaN . Los canales azul y verde representan colores reales, mientras que el canal rojo corresponde a la emisión ultravioleta.

La catodoluminiscencia se puede utilizar para detectar impurezas en minerales o la presencia de pares electrón-hueco en exceso en semiconductores. [ 19 ] : 16 . La catodoluminiscencia , la emisión de luz cuando los átomos excitados por electrones de alta energía regresan a su estado fundamental, es análoga a la fluorescencia inducida por UV , y algunos materiales como el sulfuro de zinc y algunos colorantes fluorescentes, exhiben ambos fenómenos. Durante las últimas décadas, la catodoluminiscencia se experimentó más comúnmente como la emisión de luz de la superficie interna del tubo de rayos catódicos en televisores y monitores CRT de computadora. En el SEM, los detectores CL o bien recogen toda la luz emitida por la muestra o pueden analizar las longitudes de onda emitidas por la muestra y mostrar un espectro de emisión o una imagen de la distribución de la catodoluminiscencia emitida por la muestra en color real.

microanálisis de rayos X

Los rayos X característicos producidos por la interacción de los electrones con la muestra también pueden detectarse en un microscopio electrónico de barrido (SEM) equipado para espectroscopia de rayos X de energía dispersiva o espectroscopia de rayos X de longitud de onda dispersiva . El análisis de las señales de rayos X puede utilizarse para mapear la distribución y estimar la abundancia de elementos en la muestra. [ 19 ] : 297–353

Técnicas complementarias

Numerosos estudios de investigación basados ​​en SEM se complementan con técnicas a nanoescala como la microscopía de fuerza atómica (AFM) y sus modos de imagen eléctrica. Estos métodos proporcionan información que va más allá de la morfología superficial. Por ejemplo, la AFM permite analizar la topografía superficial de la muestra a escala nanométrica mediante una punta afilada en modo de contacto o de golpeteo. La AFM conductiva (C-AFM) permite mapear la conductividad eléctrica local, lo que resulta útil para estudiar materiales de conmutación resistiva y semiconductores. La microscopía de fuerza de sonda Kelvin (KPFM) mide las variaciones del potencial superficial, lo que es valioso para analizar la distribución de carga en materiales electrónicos o fotovoltaicos. Al utilizarse junto con SEM, estas técnicas ofrecen una comprensión integral de las propiedades estructurales y funcionales de los materiales.

Resolución del SEM

Un vídeo que ilustra el rango de aumento práctico típico de un microscopio electrónico de barrido diseñado para muestras biológicas. El vídeo comienza con un aumento de 25×, aproximadamente 6 mm en todo el campo de visión, y aumenta hasta 12000×, aproximadamente 12 μm en todo el campo de visión. Los objetos esféricos son microesferas de vidrio con un diámetro de 10 μm, similar al de un glóbulo rojo .  

Un SEM no es una cámara y el detector no forma imágenes de forma continua como una matriz CCD o una película . A diferencia de un sistema óptico, la resolución no está limitada por el límite de difracción , la finura de las lentes o espejos o la resolución de la matriz del detector. La óptica de enfoque puede ser grande y gruesa, y el detector SE es del tamaño de un puño y simplemente detecta corriente. En cambio, la resolución espacial del SEM depende del tamaño del punto de electrones, que a su vez depende tanto de la longitud de onda de los electrones como del sistema electroóptico que produce el haz de escaneo. La resolución también está limitada por el tamaño del volumen de interacción, el volumen de material de la muestra que interactúa con el haz de electrones. El tamaño del punto y el volumen de interacción son grandes en comparación con las distancias entre átomos, por lo que la resolución del SEM no es lo suficientemente alta como para obtener imágenes de átomos individuales, como es posible con un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Sin embargo, el SEM tiene ventajas compensatorias, incluida la capacidad de obtener imágenes de un área comparativamente grande de la muestra; la capacidad de obtener imágenes de materiales a granel (no solo películas delgadas o láminas); y la variedad de modos analíticos disponibles para medir la composición y las propiedades de la muestra. Dependiendo del instrumento, la resolución puede oscilar entre menos de 1  nm y 20  nm. En 2009, el microscopio electrónico de barrido (SEM) convencional (≤30 kV) de mayor resolución del mundo  podía alcanzar una resolución puntual de 0,4  nm utilizando un detector de electrones secundarios. [ 34 ]

Microscopía electrónica de barrido ambiental

La microscopía electrónica de barrido (SEM) convencional requiere que las muestras se analicen al vacío , ya que una atmósfera gaseosa dispersa y atenúa rápidamente los haces de electrones. En consecuencia, las muestras que producen una cantidad significativa de vapor , como muestras biológicas húmedas o rocas con petróleo, deben secarse o congelarse criogénicamente. Los procesos que implican transiciones de fase , como el secado de adhesivos o la fusión de aleaciones , el transporte de líquidos, las reacciones químicas y los sistemas sólido-aire-gas, generalmente no pueden observarse con la SEM convencional de alto vacío. En la SEM ambiental (ESEM), la cámara se vacía de aire, pero el vapor de agua se retiene cerca de su presión de saturación, y la presión residual permanece relativamente alta. Esto permite el análisis de muestras que contienen agua u otras sustancias volátiles. Con la ESEM, ha sido posible observar insectos vivos. [ 35 ]

El primer desarrollo comercial del ESEM a finales de la década de 1980 [ 36 ] [ 37 ] permitió observar muestras en entornos gaseosos de baja presión (por ejemplo, 1–50 Torr o 0,1–6,7  kPa) y alta humedad relativa (hasta el 100%). Esto fue posible gracias al desarrollo de un detector de electrones secundarios [ 38 ] [ 39 ] capaz de operar en presencia de vapor de agua y al uso de aperturas limitadoras de presión con bombeo diferencial en la trayectoria del haz de electrones para separar la región de vacío (alrededor del cañón y las lentes) de la cámara de muestras. Los primeros ESEM comerciales fueron producidos por ElectroScan Corporation en EE. UU. en 1988. ElectroScan fue adquirida por Philips (que posteriormente vendió su división de óptica electrónica a FEI Company) en 1996. [ 40 ]

La ESEM es especialmente útil para materiales no metálicos y biológicos, ya que no requiere recubrimiento con carbono ni oro. Los plásticos y elastómeros sin recubrimiento pueden examinarse de forma rutinaria, al igual que las muestras biológicas sin recubrimiento. Esto resulta útil porque el recubrimiento puede ser difícil de eliminar, puede ocultar pequeñas características en la superficie de la muestra y puede reducir el valor de los resultados obtenidos. El análisis de rayos X es difícil con un recubrimiento de metal pesado, por lo que los recubrimientos de carbono se utilizan habitualmente en los microscopios electrónicos de barrido (SEM) convencionales; sin embargo, la ESEM permite realizar microanálisis de rayos X en muestras no conductoras sin recubrimiento. No obstante, se introducen algunos artefactos específicos de la ESEM en el análisis de rayos X. La ESEM puede ser la técnica preferida para la microscopía electrónica de muestras únicas procedentes de procesos penales o civiles, donde el análisis forense puede requerir la repetición por parte de varios expertos. Es posible estudiar muestras en fase líquida con ESEM o con otros métodos de microscopía electrónica en fase líquida . [ 41 ]

Microscopía electrónica de barrido por transmisión y espectroscopia de pérdida de energía

El SEM también puede utilizarse en modo de transmisión incorporando un detector adecuado debajo de una sección delgada de la muestra. [ 42 ] Existen detectores para campo claro, campo oscuro, así como detectores segmentados para campo oscuro anular de ángulo medio a alto . A pesar de las diferencias en la instrumentación, esta técnica se sigue denominando comúnmente microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) .

Desde 2016, ha habido un creciente interés en el uso de SEM en modo de transmisión para espectroscopia de pérdida de energía de electrones (EELS) . Iniciado por Hitachi y el grupo Gauvin en la Universidad McGill, [ 43 ] ahora es posible el mapeo elemental de muestras delgadas mediante SEM-EELS, junto con una reducción del daño por haz en materiales litiados debido a la menor energía del haz que reduce el daño por efecto de rebote. En 2025, científicos del MIT demostraron que el análisis EELS de muestras delgadas es posible en cualquier SEM modificado en el rango de energía de 1 a 20 keV. [ 44 ]

Microscopía electrónica de barrido en ciencias forenses

El microscopio electrónico de barrido (MEB) se utiliza con frecuencia en la ciencia forense para el análisis ampliado de elementos microscópicos como diatomeas y residuos de disparos . Dado que el MEB no daña la muestra, permite analizar la evidencia sin alterarla. El MEB emite un haz de electrones de alta energía que rebotan en la muestra sin modificarla ni destruirla. Esto resulta muy útil para el análisis de diatomeas. Cuando una persona muere ahogada, inhala el agua, lo que provoca que las diatomeas presentes en ella entren en el torrente sanguíneo, el cerebro, los riñones y otros órganos. Estas diatomeas pueden ampliarse con el MEB para determinar su tipo, lo que ayuda a comprender cómo y dónde falleció la persona. Mediante las imágenes obtenidas con el MEB, los científicos forenses pueden comparar los tipos de diatomeas para confirmar el cuerpo de agua en el que murió la persona. [ 45 ]

El análisis de residuos de disparo (GSR) se puede realizar con diversos instrumentos analíticos, [ 46 ] pero el SEM es una técnica común para analizar compuestos inorgánicos debido a su capacidad para analizar con precisión los diferentes tipos de elementos (principalmente metales) mediante sus tres detectores: detector de electrones retrodispersados, detector de electrones secundarios y detector de rayos X. Los GSR se pueden recolectar de la escena del crimen, la víctima o el tirador y analizarse con el SEM. Esto permite a los científicos determinar la proximidad o el contacto con el arma de fuego disparada. [ 46 ]

Color en SEM

Los microscopios electrónicos no producen imágenes en color de forma natural. Un detector de electrones secundarios produce un único valor por píxel que corresponde al número de electrones recibidos por el detector durante el breve periodo de tiempo en que el haz se dirige a la  posición del píxel (x, y). Para cada píxel, este valor único se representa mediante un nivel de gris, formando una imagen monocromática. [ 47 ] Sin embargo, se pueden utilizar varios métodos para obtener imágenes de microscopía electrónica en color. [ 48 ]

Falso color mediante un único detector

  • En imágenes compositivas de superficies planas (típicamente BSE):

La forma más sencilla de obtener color es reemplazar cada nivel de gris con un color arbitrario, utilizando una tabla de consulta de colores . Este método se conoce como imagen de falso color y puede ayudar a distinguir fases de la muestra con propiedades o composición similares. [ 49 ]

  • En imágenes de superficies texturizadas:

Como alternativa a simplemente reemplazar cada nivel de gris por un color, una muestra observada mediante un haz oblicuo permite a los investigadores crear una imagen topográfica aproximada (véase la sección «Representación 3D fotométrica a partir de una sola imagen SEM» ). Dicha topografía puede procesarse posteriormente con algoritmos de representación 3D para obtener una representación más natural de la textura de la superficie.

coloración de imágenes SEM

Con frecuencia, las imágenes SEM publicadas se colorean artificialmente. [ 49 ] Esto puede hacerse por motivos estéticos, para aclarar la estructura o para dar una apariencia realista a la muestra y, por lo general, no aporta información adicional sobre el espécimen. [ 50 ]

El coloreado puede realizarse manualmente con software de edición fotográfica o de forma semiautomática con software especializado que utiliza detección de características o segmentación orientada a objetos. [ 51 ]

Alternativamente, cuando se dispone de información adicional de otros detectores como EDX , EBSD , ECCI o catodoluminiscencia , se puede combinar como canal(es) de color para proporcionar información detallada del material en una sola imagen de alta resolución. [ 52 ]

El color se construye utilizando múltiples detectores de electrones.

En algunas configuraciones se recopila más información por píxel, a menudo mediante el uso de múltiples detectores. [ 53 ]

Como ejemplo común, se superponen detectores de electrones secundarios y retrodispersados, y se asigna un color a cada una de las imágenes capturadas por cada detector, [ 54 ] [ 55 ] obteniendo como resultado una imagen de color combinada donde los colores se relacionan con la densidad de los componentes. Este método se conoce como microscopía electrónica de barrido de color dependiente de la densidad (DDC-SEM). Las micrografías producidas por DDC-SEM conservan la información topográfica, que es mejor capturada por el detector de electrones secundarios, y la combinan con la información sobre la densidad, obtenida por el detector de electrones retrodispersados. [ 56 ] [ 57 ]

Señales analíticas basadas en fotones generados

La medición de la energía de los fotones emitidos por la muestra es un método común para obtener capacidades analíticas. Ejemplos de ello son los detectores de espectroscopia de rayos X de energía dispersiva (EDS) utilizados en el análisis elemental [ 19 ] : 355–381 y los sistemas de microscopía de catodoluminiscencia (CL) que analizan la intensidad y el espectro de la luminiscencia inducida por electrones en (por ejemplo) muestras geológicas. En los sistemas SEM que utilizan estos detectores, es común codificar por colores estas señales adicionales y superponerlas en una sola imagen de color, de modo que las diferencias en la distribución de los diversos componentes de la muestra puedan verse claramente y compararse. Opcionalmente, la imagen estándar de electrones secundarios puede fusionarse con uno o más canales de composición, de modo que se pueda comparar la estructura y composición de la muestra. Dichas imágenes pueden generarse manteniendo la integridad total de los datos de la señal original, que no se modifican de ninguna manera.

3D en SEM

A diferencia de los microscopios de sonda de barrido (SPM) , los microscopios electrónicos de barrido (SEM) no generan imágenes 3D de forma natural. Sin embargo, se pueden obtener datos 3D utilizando un SEM mediante métodos como la estereoscopia .

Reconstrucción 3D SEM a partir de un par estéreo

  • La fotogrametría es el método metrológicamente más preciso para incorporar la tercera dimensión a las imágenes SEM. [ 49 ] A diferencia de los métodos fotométricos (párrafo siguiente), la fotogrametría calcula las alturas absolutas mediante métodos de triangulación . Sus inconvenientes son que solo funciona con una textura mínima y requiere la adquisición de dos imágenes desde dos ángulos diferentes, lo que implica el uso de una platina basculante. ( La fotogrametría es una operación de software que calcula el desplazamiento (o "disparidad") de cada píxel entre la imagen izquierda y la derecha del mismo par. Dicha disparidad refleja la altura local).

Reconstrucción fotométrica 3D SEM a partir de un detector de cuatro cuadrantes mediante "formación a partir de sombreado".

Este método suele utilizar un detector BSE de cuatro cuadrantes (alternativamente, un fabricante utiliza un detector de tres segmentos). El microscopio produce cuatro imágenes de la misma muestra simultáneamente, por lo que no se requiere inclinación de la misma. El método proporciona dimensiones 3D metrológicas siempre que la pendiente de la muestra sea razonable. [ 49 ] La mayoría de los fabricantes de SEM ahora (2018) ofrecen un detector BSE de cuatro cuadrantes integrado u opcional, junto con software propietario para calcular una imagen 3D en tiempo real. [ 59 ]

Otros enfoques utilizan métodos más sofisticados (y a veces intensivos en GPU) como el algoritmo de estimación óptima y ofrecen resultados mucho mejores [ 60 ] a costa de altas exigencias en potencia de cálculo.

En todos los casos, este método funciona mediante la integración de la pendiente, por lo que se ignoran las pendientes verticales y los voladizos; por ejemplo, si una esfera entera descansa sobre una superficie plana, solo se observa que sobresale del plano el hemisferio superior, lo que resulta en una altitud incorrecta del vértice de la esfera. La magnitud de este efecto depende del ángulo de los detectores BSE con respecto a la muestra, pero estos detectores suelen estar situados alrededor (y cerca) del haz de electrones, por lo que este efecto es muy común.

Reconstrucción 3D fotométrica a partir de una sola imagen SEM

Este método requiere una imagen SEM obtenida con iluminación oblicua de bajo ángulo. El nivel de gris se interpreta como la pendiente, y esta se integra para reconstruir la topografía de la muestra. Este método resulta interesante para la mejora visual y la detección de la forma y posición de los objetos; sin embargo, a diferencia de otros métodos como la fotogrametría, las alturas verticales no suelen poder calibrarse. [ 49 ]

Otros tipos de reconstrucción 3D SEM

  • Reconstrucción inversa utilizando modelos interactivos electrón-material [ 61 ] [ 62 ]
  • Reconstrucción multirresolución utilizando un único archivo 2D: Las imágenes 3D de alta calidad pueden ser la solución definitiva para revelar las complejidades de cualquier medio poroso, pero su adquisición es costosa y requiere mucho tiempo. Por otro lado, las imágenes SEM 2D de alta calidad están ampliamente disponibles. Recientemente , se ha presentado un novedoso método de reconstrucción multirresolución, multiescala y de tres pasos que utiliza directamente imágenes 2D para desarrollar modelos 3D. Este método, basado en la entropía de Shannon y la simulación condicional, puede utilizarse para la mayoría de los materiales estacionarios disponibles y puede construir diversos modelos 3D estocásticos utilizando solo unas pocas secciones delgadas. [ 63 ] [ 64 ] [ 65 ]
  • La microscopía electrónica de barrido por abrasión iónica (IA-SEM) es un método de obtención de imágenes 3D a nanoescala que utiliza un haz de galio enfocado para erosionar repetidamente la superficie de la muestra en incrementos de 20 nanómetros. Cada superficie expuesta se escanea para generar una imagen 3D. [ 66 ] [ 67 ]

Aplicaciones de la microscopía electrónica de barrido 3D

Una posible aplicación es la medición de la rugosidad de los cristales de hielo. Este método puede combinar el SEM ambiental de presión variable y las capacidades 3D del SEM para medir la rugosidad en facetas individuales de cristales de hielo, convertirla en un modelo informático y realizar análisis estadísticos adicionales sobre el modelo. [ 68 ] Otras mediciones incluyen la dimensión fractal, el examen de la superficie de fractura de metales, la caracterización de materiales, la medición de la corrosión y las mediciones dimensionales a nanoescala (altura de escalón, volumen, ángulo, planitud, relación de apoyo, coplanaridad, etc.).

El SEM también es utilizado por los conservadores de arte para discernir amenazas a la estabilidad de la superficie de las pinturas debido al envejecimiento, como la formación de complejos de iones de zinc con ácidos grasos . [ 69 ] Los científicos forenses utilizan el SEM para detectar falsificaciones de arte .

A continuación se muestran ejemplos de imágenes tomadas con un microscopio electrónico de barrido (SEM).

Véase también

Referencias

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General
  • HowStuffWorks – Cómo funcionan los microscopios electrónicos de barrido
  • Aprende a usar un microscopio electrónico de barrido (SEM) : un entorno de aprendizaje en línea para quienes desean utilizar un SEM. Ofrecido por Microscopy Australia.
  • Microscopio electrónico de barrido virtual (SEM) – sparkler – una simulación interactiva de un microscopio electrónico de barrido (SEM) 
  • Imágenes SEM en color multicanal – y con BSE 
  • Vídeo sobre el microscopio electrónico de barrido , Universidad de Ciencias Aplicadas de Karlsruhe.
  • Animaciones y explicaciones sobre diversos tipos de microscopios, incluidos los microscopios electrónicos (Université Paris Sud).
Historia
  • Historia del microscopio electrónico de barrido ambiental (ESEM)
Imágenes
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