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Microsatélite

Un microsatélite es un segmento de ADN repetitivo que consiste en una secuencia particular de pares de bases repetida un gran número de veces. Los microsatélites se encuentran e...

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Un microsatélite es un segmento de ADN repetitivo que consiste en una secuencia particular de pares de bases repetida un gran número de veces. Los microsatélites se encuentran en miles de ubicaciones dentro del genoma de un organismo . Tienen una tasa de mutación más alta que otras áreas del ADN [ 1 ], lo que da lugar a una alta diversidad genética . Los genetistas forenses y los genealogistas genéticos suelen referirse a los microsatélites como repeticiones cortas en tándem ( STR ) , o como repeticiones de secuencias simples ( SSR ) en genética vegetal [ 2 ] .

Los microsatélites y sus parientes más largos, los minisatélites , se clasifican conjuntamente como ADN VNTR (número variable de repeticiones en tándem ). El nombre "ADN satélite" se refiere a la observación temprana de que la centrifugación del ADN genómico en un tubo de ensayo separa una capa prominente de ADN a granel de las capas "satélite" acompañantes de ADN repetitivo. [ 3 ]

Se utilizan ampliamente para la elaboración de perfiles de ADN en el diagnóstico del cáncer , en el análisis de parentesco (especialmente en las pruebas de paternidad ) y en la identificación forense. También se emplean en el análisis de ligamiento genético para localizar un gen o una mutación responsable de un rasgo o enfermedad específicos. Los microsatélites también se utilizan en genética de poblaciones para medir el grado de parentesco entre subespecies, grupos e individuos.

Historia

Aunque el primer microsatélite fue caracterizado en 1984 en la Universidad de Leicester por Weller, Jeffreys y sus colegas como una repetición polimórfica GGAT en el gen de la mioglobina humana , el término "microsatélite" fue introducido posteriormente, en 1989, por Litt y Luty. [ 4 ] La creciente disponibilidad de la amplificación de ADN por PCR a principios de la década de 1990 impulsó un gran número de estudios que utilizaban la amplificación de microsatélites como marcadores genéticos para la medicina forense, para pruebas de paternidad y para clonación posicional con el fin de encontrar el gen subyacente a un rasgo o enfermedad. Entre las aplicaciones iniciales más destacadas se incluyen las identificaciones mediante genotipado de microsatélites de los restos óseos de una víctima de asesinato británica de ocho años ( Hagelberg et al. 1991) y del médico del campo de concentración de Auschwitz, Josef Mengele , que escapó a Sudamérica tras la Segunda Guerra Mundial ( Jeffreys et al. 1992). [ 4 ]

Estructuras, ubicaciones y funciones

El elemento repetitivo de un microsatélite es corto: generalmente diez nucleótidos o menos (un límite superior preciso, el punto en el que un microsatélite se convierte en un minisatélite, no está definido explícitamente y varía de un autor a otro), [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] y se repiten típicamente de 5 a 50 veces. Por ejemplo, la secuencia TATATATATA es un microsatélite de dinucleótidos, y GTCGTCGTCGTCGTC es un microsatélite de trinucleótidos (donde A es adenina , G guanina , C citosina y T timina ). Las unidades repetitivas de cuatro y cinco nucleótidos se denominan motivos de tetra- y pentanucleótidos, respectivamente. La mayoría de los eucariotas tienen microsatélites, con la notable excepción de algunas especies de levadura. Los microsatélites se distribuyen por todo el genoma. [ 7 ] [ 4 ] [ 8 ] El genoma humano, por ejemplo, contiene entre 50 000 y 100 000 microsatélites de dinucleótidos, y cantidades menores de microsatélites de tri-, tetra- y pentanucleótidos. [ 9 ] Muchos se encuentran en partes no codificantes del genoma humano y, por lo tanto, no producen proteínas, pero también pueden encontrarse en regiones reguladoras y regiones codificantes .

Los microsatélites en regiones no codificantes pueden no tener ninguna función específica y, por lo tanto, podrían no ser objeto de selección natural; esto les permite acumular mutaciones sin impedimentos a lo largo de las generaciones y da lugar a una variabilidad que puede utilizarse para la identificación genética y la obtención de huellas genéticas. Otros microsatélites se localizan en regiones reguladoras flanqueantes o intrónicas de los genes, o directamente en los codones de los genes  ; en estos casos, las mutaciones de microsatélites pueden provocar cambios fenotípicos y enfermedades, especialmente en enfermedades de expansión de tripletes como el síndrome del cromosoma X frágil y la enfermedad de Huntington . [ 10 ]

Los telómeros son secuencias lineales de ADN que se encuentran en los extremos de los cromosomas y protegen la integridad del material genómico (de forma similar a la punta de un cordón de zapato) durante las sucesivas rondas de división celular debido al "problema de replicación de los extremos". [ 6 ] En los glóbulos blancos, se ha demostrado que el acortamiento gradual del ADN telomérico se correlaciona inversamente con el envejecimiento en varios tipos de muestras. [ 11 ] Los telómeros consisten en ADN repetitivo, con el motivo de repetición de hexanucleótidos TTAGGG en vertebrados. Por lo tanto, se clasifican como minisatélites . De manera similar, los insectos tienen motivos de repetición más cortos en sus telómeros que podrían considerarse microsatélites.

Mecanismos de mutación y tasas de mutación

Deslizamiento de la cadena de ADN durante la replicación de un locus STR. Los recuadros simbolizan unidades repetitivas de ADN. Las flechas indican la dirección en la que se replica una nueva cadena de ADN (recuadros blancos) a partir de la cadena molde (recuadros negros). Se muestran tres situaciones durante la replicación del ADN: (a) La replicación del locus STR se ha producido sin mutación. (b) La replicación del locus STR ha dado lugar a una ganancia de una unidad debido a un bucle en la nueva cadena; el bucle aberrante se estabiliza mediante unidades flanqueantes complementarias a la cadena opuesta. (c) La replicación del locus STR ha dado lugar a una pérdida de una unidad debido a un bucle en la cadena molde. (Forster et al. 2015)

A diferencia de las mutaciones puntuales , que afectan solo a un único nucleótido, las mutaciones de microsatélites conducen a la ganancia o pérdida de una unidad de repetición completa, y a veces dos o más repeticiones simultáneamente. Por lo tanto, se espera que la tasa de mutación en los loci de microsatélites difiera de otras tasas de mutación, como las tasas de sustitución de bases. [ 12 ] [ 13 ] La tasa de mutación en los loci de microsatélites depende de la secuencia del motivo de repetición, el número de unidades de motivo repetidas y la pureza de la secuencia repetida canónica. [ 14 ] Se han revisado varios mecanismos para la mutación de los loci de microsatélites, [ 14 ] [ 15 ] y se ha cuantificado su naturaleza polimórfica resultante. [ 16 ] La causa real de las mutaciones en los microsatélites es objeto de debate.

Una causa propuesta de tales cambios de longitud es el deslizamiento de replicación, [ 17 ] causado por desajustes entre las hebras de ADN mientras se replican durante la meiosis . [ 18 ] La ADN polimerasa , la enzima responsable de leer el ADN durante la replicación, puede deslizarse mientras se mueve a lo largo de la hebra molde y continuar en el nucleótido incorrecto. El deslizamiento de la ADN polimerasa es más probable que ocurra cuando se replica una secuencia repetitiva (como CGCGCG). Debido a que los microsatélites consisten en tales secuencias repetitivas, la ADN polimerasa puede cometer errores con mayor frecuencia en estas regiones de secuencia. Varios estudios han encontrado evidencia de que el deslizamiento es la causa de las mutaciones de microsatélites. [ 19 ] [ 20 ] Típicamente, el deslizamiento en cada microsatélite ocurre aproximadamente una vez cada 1000 generaciones. [ 21 ] Por lo tanto, los cambios de deslizamiento en el ADN repetitivo son tres órdenes de magnitud más comunes que las mutaciones puntuales en otras partes del genoma. [ 22 ] La mayoría de los deslizamientos resultan en un cambio de solo una unidad de repetición, y las tasas de deslizamiento varían para diferentes longitudes de alelos y tamaños de unidades de repetición, [ 1 ] y dentro de diferentes especies. [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] Si hay una gran diferencia de tamaño entre alelos individuales, entonces puede haber una mayor inestabilidad durante la recombinación en la meiosis. [ 22 ]

Another possible cause of microsatellite mutations are point mutations, where only one nucleotide is incorrectly copied during replication. A study comparing human and primate genomes found that most changes in repeat number in short microsatellites appear due to point mutations rather than slippage.[26]

Microsatellite mutation rates

Direct estimates of microsatellite mutation rates have been made in numerous organisms, from insects to humans. In the desert locustSchistocerca gregaria, the microsatellite mutation rate was estimated at 2.1 × 10−4 per generation per locus.[27] The microsatellite mutation rate in human male germ lines is five to six times higher than in female germ lines and ranges from 0 to 7 × 10−3 per locus per gamete per generation.[1] In the nematode Pristionchus pacificus, the estimated microsatellite mutation rate ranges from 8.9 × 10−5 to 7.5 × 10−4 per locus per generation.[28]

Microsatellite mutation rates vary with base position relative to the microsatellite, repeat type, and base identity.[26] Mutation rate rises specifically with repeat number, peaking around six to eight repeats and then decreasing again.[26] Increased heterozygosity in a population will also increase microsatellite mutation rates,[29] especially when there is a large length difference between alleles. This is likely due to homologous chromosomes with arms of unequal lengths causing instability during meiosis.[30]

Biological effects of microsatellite mutations

Many microsatellites are located in non-coding DNA and are biologically silent. Others are located in regulatory or even coding DNA – microsatellite mutations in such cases can lead to phenotypic changes and diseases. A genome-wide study estimates that microsatellite variation contributes 10–15% of heritable gene expression variation in humans.[31][16]

Effects on proteins

En los mamíferos, entre el 20 y el 40 % de las proteínas contienen secuencias repetitivas de aminoácidos codificadas por repeticiones de secuencias cortas. [ 32 ] La mayoría de las repeticiones de secuencias cortas dentro de las porciones codificantes de proteínas del genoma tienen una unidad repetitiva de tres nucleótidos, ya que esa longitud no causará cambios de marco de lectura cuando muten. [ 33 ] Cada secuencia repetitiva de trinucleótidos se transcribe en una serie repetitiva del mismo aminoácido. En las levaduras, los aminoácidos repetidos más comunes son la glutamina, el ácido glutámico, la asparagina, el ácido aspártico y la serina.

Las mutaciones en estos segmentos repetitivos pueden afectar las propiedades físicas y químicas de las proteínas, con el potencial de producir cambios graduales y predecibles en la acción de las proteínas. [ 34 ] Por ejemplo, los cambios de longitud en regiones repetidas en tándem en el gen Runx2 conducen a diferencias en la longitud facial en perros domésticos ( Canis familiaris ), con una asociación entre longitudes de secuencia más largas y caras más largas. [ 35 ] Esta asociación también se aplica a una gama más amplia de especies de Carnivora. [ 36 ] Los cambios de longitud en tractos de polialanina dentro del gen HOXA13 están vinculados al síndrome mano-pie-genital , un trastorno del desarrollo en humanos. [ 37 ] Los cambios de longitud en otras repeticiones de tripletes están vinculados a más de 40 enfermedades neurológicas en humanos, en particular trastornos de repetición de trinucleótidos como el síndrome del cromosoma X frágil y la enfermedad de Huntington . [ 10 ] Los cambios evolutivos por deslizamiento de replicación también ocurren en organismos más simples. Por ejemplo, los cambios de longitud de microsatélites son comunes dentro de las proteínas de membrana superficial en levaduras, lo que proporciona una evolución rápida en las propiedades celulares. [ 38 ] Específicamente, los cambios de longitud en el gen FLO1 controlan el nivel de adhesión a los sustratos. [ 39 ] Las repeticiones de secuencias cortas también proporcionan un cambio evolutivo rápido a las proteínas de superficie en bacterias patógenas; esto puede permitirles mantenerse al día con los cambios inmunológicos en sus huéspedes. [ 40 ] Los cambios de longitud en las repeticiones de secuencias cortas en un hongo ( Neurospora crassa ) controlan la duración de sus ciclos del reloj circadiano . [ 41 ]

Efectos sobre la regulación genética

Los cambios en la longitud de los microsatélites dentro de los promotores y otras regiones cis-reguladoras pueden modificar rápidamente la expresión génica entre generaciones. El genoma humano contiene muchas (>16 000) repeticiones de secuencias cortas en regiones reguladoras, que actúan como "perillas de ajuste" en la expresión de muchos genes. [ 31 ] [ 42 ]

Los cambios de longitud en los SSR bacterianos pueden afectar la formación de fimbrias en Haemophilus influenzae , al alterar el espaciamiento del promotor. [ 40 ] Los microsatélites de dinucleótidos están vinculados a una variación abundante en las regiones de control cis-reguladoras en el genoma humano. [ 42 ] Los microsatélites en las regiones de control del gen del receptor de vasopresina 1a en los topillos influyen en su comportamiento social y nivel de monogamia. [ 43 ]

En el sarcoma de Ewing (un tipo de cáncer óseo doloroso en humanos jóvenes), una mutación puntual ha creado un microsatélite GGAA extendido que se une a un factor de transcripción, el cual, a su vez, activa el gen EGR2 que impulsa el cáncer. [ 44 ] Además, otros microsatélites GGAA pueden influir en la expresión de genes que contribuyen al pronóstico clínico de los pacientes con sarcoma de Ewing. [ 45 ]

Efectos dentro de los intrones

Los microsatélites dentro de los intrones también influyen en el fenotipo, a través de mecanismos que aún no se comprenden. Por ejemplo, una expansión del triplete GAA en el primer intrón del gen X25 parece interferir con la transcripción y causa la ataxia de Friedreich . [ 46 ] Las repeticiones en tándem en el primer intrón del gen de la asparagina sintetasa están relacionadas con la leucemia linfoblástica aguda. [ 47 ] Un polimorfismo de repetición en el cuarto intrón del gen NOS3 está relacionado con la hipertensión en una población tunecina. [ 48 ] Las longitudes de repetición reducidas en el gen EGFR están relacionadas con los osteosarcomas. [ 49 ]

Se sabe que una forma arcaica de empalme conservada en el pez cebra utiliza secuencias de microsatélites dentro del ARNm intrónico para la eliminación de intrones en ausencia de U2AF2 y otra maquinaria de empalme. Se postula que estas secuencias forman configuraciones de trébol altamente estables que acercan los sitios de empalme de intrones 3' y 5', reemplazando efectivamente el espliceosoma . Se cree que este método de empalme de ARN divergió de la evolución humana en la formación de los tetrápodos y representa un vestigio de un mundo de ARN . [ 50 ]

Efectos dentro de los transposones

Casi el 50% del genoma humano está contenido en diversos tipos de elementos transponibles (también llamados transposones o "genes saltarines"), y muchos de ellos contienen ADN repetitivo. [ 51 ] Es probable que las repeticiones de secuencias cortas en esas ubicaciones también participen en la regulación de la expresión génica. [ 52 ]

Aplicaciones

Los microsatélites se utilizan para evaluar las deleciones del ADN cromosómico en el diagnóstico del cáncer. Se emplean ampliamente para la elaboración de perfiles de ADN , también conocidos como "huellas genéticas", de manchas de drogas (en medicina forense) y de tejidos (en pacientes trasplantados). También se utilizan con frecuencia en el análisis de parentesco (principalmente en pruebas de paternidad). Además, los microsatélites se emplean para mapear ubicaciones dentro del genoma, específicamente en el análisis de ligamiento genético, para localizar un gen o una mutación responsable de un rasgo o enfermedad determinados. Como caso especial de mapeo, pueden utilizarse para estudios de duplicación o deleción de genes . Los investigadores emplean microsatélites en genética de poblaciones y en proyectos de conservación de especies. Los genetistas de plantas han propuesto el uso de microsatélites para la selección asistida por marcadores de rasgos deseables en el mejoramiento vegetal.

diagnóstico de cáncer

En las células tumorales , cuyos controles de replicación están dañados, los microsatélites pueden ganarse o perderse con una frecuencia especialmente alta durante cada ronda de mitosis . Por lo tanto, una línea celular tumoral podría mostrar una huella genética diferente a la del tejido huésped y, especialmente en el cáncer colorrectal , podría presentar pérdida de heterocigosidad . [ 53 ] [ 54 ] Por consiguiente, los microsatélites analizados en tejido primario se han utilizado de forma rutinaria en el diagnóstico del cáncer para evaluar la progresión tumoral. [ 55 ] [ 56 ] [ 57 ] Los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) se han utilizado para identificar biomarcadores de microsatélites como fuente de predisposición genética en una variedad de cánceres. [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ]

Perfil STR humano parcial obtenido mediante el kit Identifiler de Applied Biosystems.

Huellas dactilares forenses y médicas

El análisis de microsatélites se popularizó en el campo de la ciencia forense en la década de 1990. [ 61 ] Se utiliza para la identificación genética de individuos, permitiendo la identificación forense (generalmente relacionando una mancha de un delito con una víctima o un perpetrador). También se utiliza para el seguimiento de pacientes trasplantados de médula ósea . [ 62 ]

Los microsatélites que se utilizan hoy en día para el análisis forense son todos repeticiones de tetra- o pentanucleótidos, ya que estos proporcionan un alto grado de datos libres de errores y, al mismo tiempo, son lo suficientemente cortos como para sobrevivir a la degradación en condiciones no ideales. Incluso las secuencias repetidas más cortas tenderían a sufrir artefactos como tartamudeo de PCR y amplificación preferencial, mientras que las secuencias repetidas más largas sufrirían más degradación ambiental y se amplificarían menos bien por PCR . [ 63 ] Otra consideración forense es que debe respetarse la privacidad médica de la persona , por lo que se eligen STR forenses que no sean codificantes, no influyan en la regulación genética y no sean generalmente STR de trinucleótidos que podrían estar involucrados en enfermedades de expansión de tripletes como la enfermedad de Huntington . Los perfiles STR forenses se almacenan en bancos de datos de ADN como la Base de Datos Nacional de ADN del Reino Unido (NDNAD), la estadounidense CODIS o la australiana NCIDD.

Análisis de parentesco (pruebas de paternidad)

Los microsatélites autosómicos se utilizan ampliamente para el perfil de ADN en el análisis de parentesco (más comúnmente en las pruebas de paternidad). [ 64 ] Los Y-STR heredados del padre (microsatélites en el cromosoma Y ) se utilizan a menudo en las pruebas de ADN genealógicas .

Análisis de ligamiento genético

Durante la década de 1990 y los primeros años de este milenio, los microsatélites fueron los marcadores genéticos de referencia para los análisis genómicos a gran escala, con el fin de localizar cualquier gen responsable de un fenotipo o enfermedad determinados, utilizando observaciones de segregación a lo largo de generaciones de un pedigrí muestreado. Si bien el auge de las plataformas de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de mayor rendimiento y rentabilidad dio paso a la era de los SNP para los análisis genómicos, los microsatélites siguen siendo medidas altamente informativas de la variación genómica para estudios de ligamiento y asociación. Su ventaja continua reside en su mayor diversidad alélica que los SNP bialélicos, lo que permite a los microsatélites diferenciar alelos dentro de un bloque de desequilibrio de ligamiento de interés definido por SNP. Así, los microsatélites han permitido descubrir genes relacionados con la diabetes tipo 2 ( TCF7L2 ) y el cáncer de próstata (la región 8q21). [ 6 ] [ 65 ]

genética de poblaciones

Árbol de consenso de unión de vecinos de 249 poblaciones humanas y seis poblaciones de chimpancés. Creado a partir de 246 marcadores microsatélite. [ 66 ]

Los microsatélites se popularizaron en la genética de poblaciones durante la década de 1990 porque, a medida que la PCR se generalizó en los laboratorios, los investigadores pudieron diseñar cebadores y amplificar conjuntos de microsatélites a bajo costo. Sus usos son muy variados. [ 67 ] Un microsatélite con una historia evolutiva neutra lo hace aplicable para medir o inferir cuellos de botella , [ 68 ] adaptación local , [ 69 ] el índice de fijación alélica (F ST ), [ 70 ] tamaño de la población , [ 71 ] y flujo genético . [ 72 ] A medida que la secuenciación de próxima generación se vuelve más asequible, el uso de microsatélites ha disminuido, sin embargo, siguen siendo una herramienta crucial en el campo. [ 73 ]

mejoramiento vegetal

La selección asistida por marcadores (MAS, por sus siglas en inglés) es un proceso de selección indirecta en el que se selecciona un rasgo de interés basándose en un marcador ( variación morfológica , bioquímica o de ADN / ARN ) vinculado a dicho rasgo (por ejemplo, productividad, resistencia a enfermedades, tolerancia al estrés y calidad), en lugar de en el rasgo en sí. Se ha propuesto el uso de microsatélites como marcadores para facilitar el mejoramiento vegetal. [ 74 ]

Análisis

Análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) en un modelo simplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Primero, una muestra de ADN se somete a PCR con cebadores dirigidos a ciertas STR (que varían en longitud entre individuos y sus alelos ). Los fragmentos resultantes se separan por tamaño (por ejemplo, mediante electroforesis ). [ 75 ]

El ADN repetitivo no se analiza fácilmente con los métodos de secuenciación de ADN de nueva generación , ya que algunas tecnologías tienen dificultades con los tractos homopoliméricos . Se han creado diversos enfoques de software para el análisis de las lecturas de secuenciación de ADN de nueva generación sin procesar para determinar el genotipo y las variantes en los loci repetitivos. [ 76 ] [ 77 ] Los microsatélites se pueden analizar y verificar mediante la amplificación por PCR establecida y la determinación del tamaño del amplicón, a veces seguida de la secuenciación de ADN de Sanger .

En medicina forense, el análisis se realiza extrayendo ADN nuclear de las células de una muestra de interés y amplificando regiones polimórficas específicas del ADN extraído mediante la reacción en cadena de la polimerasa . Una vez amplificadas, estas secuencias se separan mediante electroforesis en gel o electroforesis capilar , lo que permite al analista determinar cuántas repeticiones de la secuencia de microsatélites en cuestión existen. Si el ADN se separó mediante electroforesis en gel, se puede visualizar mediante tinción con plata (baja sensibilidad, seguro, económico), o con un colorante intercalante como el bromuro de etidio (sensible, riesgos moderados para la salud, económico), o, como utilizan la mayoría de los laboratorios forenses modernos, con colorantes fluorescentes (alta sensibilidad, seguro, caro). [ 78 ] Los instrumentos diseñados para separar fragmentos de microsatélites mediante electroforesis capilar también utilizan colorantes fluorescentes. [ 78 ] Los perfiles forenses se almacenan en las principales bases de datos. La base de datos británica para la identificación de loci de microsatélites se basó originalmente en el sistema británico SGM+ [ 79 ] [ 80 ] , que utilizaba 10 loci y un marcador sexual . Los estadounidenses [ 81 ] aumentaron este número a 13 loci. [ 82 ] La base de datos australiana se llama NCIDD y, desde 2013, utiliza 18 marcadores principales para la elaboración de perfiles de ADN. [ 61 ]

Amplificación

Los microsatélites pueden amplificarse para su identificación mediante el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando las secuencias únicas de las regiones flanqueantes como cebadores . El ADN se desnaturaliza repetidamente a alta temperatura para separar la doble hebra, luego se enfría para permitir la hibridación de los cebadores y la extensión de las secuencias de nucleótidos a través del microsatélite. Este proceso produce suficiente ADN para ser visible en geles de agarosa o poliacrilamida ; solo se necesitan pequeñas cantidades de ADN para la amplificación porque de esta manera el termociclado crea un aumento exponencial en el segmento replicado. [ 83 ] Con la abundancia de la tecnología PCR, los cebadores que flanquean los loci de microsatélites son simples y rápidos de usar, pero el desarrollo de cebadores que funcionen correctamente suele ser un proceso tedioso y costoso.

Se amplificaron varias muestras de ADN de ejemplares de Littorina plena mediante reacción en cadena de la polimerasa con cebadores dirigidos a un locus de repetición de secuencia simple variable (SSR, también conocido como microsatélite). Las muestras se analizaron en un gel de poliacrilamida al 5 % y se visualizaron mediante tinción con plata.

Diseño de cebadores de microsatélites

Si se buscan marcadores microsatélite en regiones específicas del genoma, por ejemplo, dentro de un intrón concreto , se pueden diseñar cebadores manualmente. Esto implica buscar repeticiones de microsatélites en la secuencia de ADN genómico, lo cual puede hacerse visualmente o mediante herramientas automatizadas como RepeatMasker . Una vez identificados los microsatélites potencialmente útiles, se pueden utilizar las secuencias flanqueantes para diseñar cebadores de oligonucleótidos que amplifiquen la repetición de microsatélite específica en una reacción de PCR.

Los cebadores de microsatélites aleatorios se pueden desarrollar clonando segmentos aleatorios de ADN de la especie focal. Estos segmentos aleatorios se insertan en un plásmido o vector bacteriófago , que a su vez se implanta en bacterias Escherichia coli . Luego se desarrollan colonias y se analizan con secuencias de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia que se hibridarán con una repetición de microsatélite, si está presente en el segmento de ADN. Si se pueden obtener clones positivos de este procedimiento, el ADN se secuencia y se eligen cebadores de PCR de secuencias que flanquean dichas regiones para determinar un locus específico . Este proceso implica un ensayo y error significativo por parte de los investigadores, ya que las secuencias de repetición de microsatélites deben predecirse y los cebadores que se aíslan aleatoriamente pueden no mostrar un polimorfismo significativo. [ 22 ] [ 84 ] Los loci de microsatélites están ampliamente distribuidos en todo el genoma y se pueden aislar del ADN semidegradado de especímenes antiguos, ya que todo lo que se necesita es un sustrato adecuado para la amplificación mediante PCR.

Las técnicas más recientes implican el uso de secuencias de oligonucleótidos que consisten en repeticiones complementarias a las repeticiones del microsatélite para "enriquecer" el ADN extraído ( enriquecimiento de microsatélites ). La sonda de oligonucleótido se hibrida con la repetición del microsatélite, y el complejo sonda/microsatélite se extrae de la solución. El ADN enriquecido se clona de forma habitual, pero la proporción de éxitos será mucho mayor, lo que reduce drásticamente el tiempo necesario para desarrollar las regiones para su uso. Sin embargo, la elección de las sondas puede ser un proceso de ensayo y error. [ 85 ]

ISSR-PCR

ISSR (por sus siglas en inglés, repetición de secuencia intersimple ) es un término general para una región del genoma entre loci de microsatélites. Las secuencias complementarias a dos microsatélites vecinos se utilizan como cebadores de PCR ; la región variable entre ellos se amplifica. La duración limitada de los ciclos de amplificación durante la PCR evita la replicación excesiva de secuencias de ADN contiguas demasiado largas, por lo que el resultado será una mezcla de diversas cadenas de ADN amplificadas que, en general, son cortas pero varían mucho en longitud.

Las secuencias amplificadas mediante ISSR-PCR pueden utilizarse para la identificación genética. Dado que una región ISSR puede ser conservada o no conservada, esta técnica no es útil para distinguir individuos, sino más bien para análisis filogeográficos o, posiblemente, para delimitar especies . La diversidad de secuencias es menor que en SSR-PCR, pero aún mayor que en las secuencias genéticas propiamente dichas. Además, la secuenciación de microsatélites y la secuenciación ISSR se complementan entre sí, ya que una genera cebadores para la otra.

Limitaciones

El ADN repetitivo no se analiza fácilmente con los métodos de secuenciación de ADN de nueva generación , que presentan dificultades con los tractos homopoliméricos. [ 86 ] Por lo tanto, los microsatélites se analizan normalmente mediante amplificación por PCR convencional y determinación del tamaño del amplicón. El uso de PCR implica que el análisis de la longitud de los microsatélites está sujeto a las limitaciones de la PCR, al igual que cualquier otro locus de ADN amplificado por PCR. Una preocupación particular es la aparición de " alelos nulos ":

  • Ocasionalmente, dentro de una muestra de individuos como en casos de pruebas de paternidad, una mutación en el ADN que flanquea el microsatélite puede impedir que el cebador de PCR se una y produzca un amplicón (creando un "alelo nulo" en un ensayo de gel), por lo que solo se amplifica un alelo (del cromosoma hermano no mutado), y el individuo puede entonces aparecer falsamente como homocigoto. Esto puede causar confusión en casos de paternidad. Entonces puede ser necesario amplificar el microsatélite usando un conjunto diferente de cebadores. [ 22 ] [ 87 ] Los alelos nulos son causados ​​especialmente por mutaciones en la sección 3', donde comienza la extensión.
  • En el análisis de especies o poblaciones, por ejemplo en trabajos de conservación, los cebadores de PCR que amplifican microsatélites en un individuo o especie pueden funcionar en otras especies. Sin embargo, el riesgo de aplicar cebadores de PCR en diferentes especies radica en la probabilidad de que aparezcan alelos nulos cuando la divergencia de secuencia es demasiado grande para que los cebadores se unan. En consecuencia, la especie puede presentar artificialmente una menor diversidad. En este caso, los alelos nulos a veces se manifiestan mediante una frecuencia excesiva de homocigotos que provoca desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg.

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • Todas las repeticiones cortas en tándem que causan enfermedades conocidas
  • Base de datos de microsatélites
  • Herramientas de búsqueda:
    • FireMuSat2+ archivado el 21/02/2014 en Wayback Machine .
    • IMEx archivado el 14 de septiembre de 2013 en Wayback Machine.
    • Buscador de SSR imperfectos : encuentra SSR perfectos o imperfectos en secuencias FASTA .
    • JSTRING: Búsqueda en Java de repeticiones en tándem en genomas
    • Buscador de repeticiones de microsatélites
    • MISA: herramienta de identificación de microsatélites
    • MREPATT archivado el 9 de febrero de 2009 en Wayback Machine.
    • Mreps archivado el 29/09/2011 en la Wayback Machine.
    • Phobos —una herramienta de búsqueda de repeticiones en tándem para repeticiones perfectas e imperfectas— el tamaño máximo del patrón depende únicamente de la potencia computacional.
    • escuela politécnica
    • SciRoKo
    • Buscador de SSR
    • ESTRELLA
    • SERF Análisis de genoma de novo y buscador de repeticiones en tándem
    • Buscador de repeticiones en tándem
    • TandemSWAN
    • TRED
    • GNOMO
    • Zebrafish Repeats (Archivado el 12 de septiembre de 2019 en Wayback Machine)
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