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Articulo de referencia

CRISPR

{{PDB|4QYZ}}: {{cite journal | vauthors = Mulepati S, Héroux A, Bailey S| title = Crystal structure of a CRISPR RNA–guided surveillance complex bound to a ssDNA target| journal ...

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Diagrama del mecanismo de defensa antiviral procariota CRISPR [ 2 ]

CRISPR ( / ˈ k r ɪ s p ər / ; acrónimo de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente ) es una familia de secuencias de ADN que se encuentran en los genomas de organismos procariotas como bacterias y arqueas . [ 3 ] Cada secuencia dentro de un CRISPR procariota individual se deriva de un fragmento de ADN de un bacteriófago que había infectado previamente al procariota o a uno de sus ancestros. [ 4 ] [ 5 ] Estas secuencias se utilizan para detectar y destruir el ADN de bacteriófagos similares durante infecciones posteriores. Por lo tanto, estas secuencias desempeñan un papel clave en el sistema de defensa antiviral (es decir, antifago ) de los procariotas y proporcionan una forma de inmunidad hereditaria, [ 4 ] adquirida . [ 3 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] CRISPR se encuentra en aproximadamente el 50% de los genomas bacterianos secuenciados y en casi el 90% de las arqueas secuenciadas. [ 4 ]

Cas9 (o "proteína 9 asociada a CRISPR") es una enzima que utiliza secuencias CRISPR como guía para reconocer y abrir hebras específicas de ADN que son complementarias a la secuencia CRISPR. Las enzimas Cas9 junto con las secuencias CRISPR forman la base de una tecnología conocida como CRISPR-Cas9 que puede utilizarse para editar genes en organismos vivos. [ 9 ] [ 10 ] Este proceso de edición tiene una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo la investigación biológica básica , el desarrollo de productos biotecnológicos y el tratamiento de enfermedades. [ 11 ] [ 12 ] El desarrollo de la técnica de edición del genoma CRISPR-Cas9 fue reconocido con el Premio Nobel de Química en 2020, otorgado a Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna . [ 13 ] [ 14 ]

Historia

El sistema CRISPR/Cas evolucionó en la naturaleza como un mecanismo para que las bacterias se protegieran de virus y bacteriófagos invasores insertando fragmentos de su ADN en el genoma del huésped. Esto permitió que el sistema inmunitario adaptativo respondiera adecuadamente ante una infección posterior. Fue descubierto en Streptococcus pyogenes y posteriormente se encontró en muchas otras especies.

Secuencias repetidas

El descubrimiento de repeticiones de ADN agrupadas tuvo lugar de forma independiente en tres partes del mundo. La primera descripción de lo que más tarde se denominaría CRISPR fue realizada por Ishino et al. en 1987. Clonaron accidentalmente parte de una secuencia CRISPR junto con el gen iap ( conversión de isoenzimas de la fosfatasa alcalina ) de Escherichia coli . [ 15 ] [ 16 ] La organización de las repeticiones les sorprendió, ya que las secuencias repetidas agrupadas suelen estar dispuestas consecutivamente, sin secuencias intercaladas. [ 12 ] [ 16 ]

En 1993, van Solingen et al. publicaron dos artículos sobre un grupo de repeticiones directas interrumpidas (DR) en esa bacteria. El equipo reconoció la diversidad de las secuencias que intervenían en las repeticiones directas entre diferentes cepas de M. tuberculosis [ 17 ] y utilizó esta propiedad para diseñar un método de tipificación llamado espoligotipado , que aún se utiliza. [ 18 ] [ 19 ]

Mojica estudió la función de las repeticiones en los géneros arqueales Haloferax y Haloarcula . El supervisor de Mojica supuso que las repeticiones agrupadas tenían un papel en la segregación del ADN replicado en las células hijas durante la división celular, porque los plásmidos y cromosomas con conjuntos de repeticiones idénticos no podían coexistir en Haloferax volcanii . Observaron la transcripción de las repeticiones interrumpidas por primera vez; la primera caracterización completa de CRISPR. [ 19 ] [ 20 ] Para el año 2000, Mojica y sus estudiantes, después de una búsqueda automatizada de genomas publicados, identificaron repeticiones interrumpidas en 20 especies de microbios como pertenecientes a la misma familia. [ 21 ] Debido a que esas secuencias estaban espaciadas, Mojica inicialmente las llamó "repeticiones cortas espaciadas regularmente" (SRSR). [ 22 ] En 2001, Mojica y Jansen, que buscaban repeticiones interrumpidas adicionales, propusieron el acrónimo CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas) para abarcar los numerosos acrónimos que se usaban entonces. [ 20 ] [ 23 ] En 2002, Tang et al. mostraron evidencia de que las regiones de repetición CRISPR en Archaeoglobus fulgidus se transcribían en largas moléculas de ARN que posteriormente se procesaban en pequeños ARN de longitud unitaria, además de algunas formas más largas de 2, 3 o más unidades de repetición espaciadora. [ 24 ] [ 25 ]

En 2005, Barrangou descubrió que S. thermophilus , después de repetidos desafíos de infección por fagos, desarrolla una mayor resistencia a los fagos debido a la incorporación de secuencias espaciadoras CRISPR adicionales. [ 26 ] [ 27 ]

Sistemas asociados a CRISPR

Un avance importante se produjo con la observación de Jansen de que el grupo de repeticiones procariotas estaba acompañado por cuatro genes homólogos, sistemas asociados a CRISPR, Cas 1-4. Las proteínas Cas mostraron motivos de helicasa y nucleasa , lo que sugiere una función en la estructura dinámica de los loci CRISPR. [ 28 ] Sin embargo, la función de CRISPR seguía siendo enigmática.

Diagrama simplificado de un locus CRISPR. Se muestran los tres componentes principales de un locus CRISPR: genes cas , una secuencia líder y una matriz de repeticiones y espaciadores. Las repeticiones se muestran como cajas grises y los espaciadores como barras de colores. La disposición de los tres componentes no siempre es la que se muestra. [ 29 ] [ 30 ] Además, varios CRISPR con secuencias similares pueden estar presentes en un mismo genoma, de los cuales solo uno está asociado a genes cas . [ 31 ]

En 2005, tres grupos de investigación independientes demostraron que algunos espaciadores CRISPR se derivan del ADN de fagos y del ADN extracromosómico , como los plásmidos . [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] En efecto, los espaciadores son fragmentos de ADN obtenidos de virus que previamente atacaron la célula. El origen de los espaciadores fue un indicio de que el sistema CRISPR- Cas podría tener un papel en la inmunidad adaptativa en bacterias . [ 29 ] [ 35 ] Los tres estudios que proponían esta idea fueron inicialmente rechazados por revistas de alto prestigio, pero finalmente aparecieron en otros lugares. [ 36 ]

La primera publicación [ 33 ] que proponía un papel de CRISPR-Cas en la inmunidad microbiana, realizada por Mojica et al., predijo un papel para el transcrito de ARN de los espaciadores en el reconocimiento del objetivo en un mecanismo que podría ser análogo al sistema de interferencia de ARN utilizado por las células eucariotas. Koonin y sus colegas extendieron esta hipótesis de interferencia de ARN al proponer mecanismos de acción para los diferentes subtipos de CRISPR-Cas según la función predicha de sus proteínas. [ 37 ]

El trabajo experimental de varios grupos reveló los mecanismos básicos de la inmunidad CRISPR-Cas. En 2007, se publicó la primera evidencia experimental de que CRISPR era parte del sistema inmunitario adaptativo. [ 7 ] [ 12 ] Una región CRISPR en Streptococcus thermophilus adquirió espaciadores del ADN de un bacteriófago infectante . Los investigadores manipularon la resistencia de S. thermophilus a diferentes tipos de fagos agregando y eliminando espaciadores cuya secuencia coincidía con las encontradas en los fagos. [ 38 ] [ 39 ] En 2008, Brouns y Van der Oost identificaron un complejo de proteínas Cas llamado Cascade, que en E. coli cortó el precursor de ARN CRISPR dentro de las repeticiones en moléculas de ARN maduras que contenían espaciadores llamadas ARN CRISPR (crRNA), que permanecieron unidas al complejo proteico . [ 40 ] Cascade, crRNA y una helicasa/nucleasa ( Cas3 ) fueron necesarios para proporcionar a un huésped bacteriano inmunidad contra la infección por un virus de ADN . Al diseñar un CRISPR antiviral, demostraron que dos orientaciones del crRNA (sentido/antisentido) proporcionaban inmunidad, lo que indicaba que las guías de crRNA se dirigían al dsDNA . Ese año, Marraffini y Sontheimer confirmaron que una secuencia CRISPR de S. epidermidis se dirigía al ADN y no al ARN para prevenir la conjugación . Este hallazgo estaba en desacuerdo con el mecanismo propuesto de interferencia de ARN de la inmunidad CRISPR-Cas, aunque posteriormente se encontró un sistema CRISPR-Cas que se dirige al ARN extraño en Pyrococcus furiosus . [ 12 ] [ 39 ] Un estudio de 2010 informó que CRISPR-Cas corta hebras tanto de ADN de fago como de plásmido en S. thermophilus . [ 41 ]

En 2012, Jinek et al. fusionaron crRNA y tracrRNA en un ARN guía único, simplificando la focalización de Cas9. [ 42 ] Šikšnys, et al., informaron que Cas9 de S. thermophilus puede dirigirse a ADN específico alterando crRNA. [ 43 ] En 2013, Cong, et al., así como Mali, et al., aplicaron CRISPR-Cas9 para editar cultivos de células humanas. [ 44 ] [ 45 ] En 2015, Liang, et al., editaron cigotos tripronucleares humanos , logrando una escisión exitosa en 28 de 54 embriones . [ 46 ]

Cas9

La endonucleasa Cas9 introduce rupturas de doble cadena en sitios específicos del ADN, lo que permite la inactivación, eliminación o inserción de genes a través de mecanismos de reparación celular como la unión de extremos no homólogos o la recombinación homóloga . [ 47 ]

Cas9 fue descubierto en S. pyogenes y posteriormente en S. thermophilus . [ 48 ] Funciona con dos ARN pequeños —crRNA y tracrRNA— para formar un complejo de cuatro componentes. [ 49 ] [ 50 ] En 2012, Doudna y Charpentier fusionaron los ARN en un único ARN guía , lo que permitió a Cas9 cortar secuencias de ADN específicas. Estos avances impulsaron los esfuerzos de modificación del genoma, incluyendo grupos liderados por Zhang y Church, quienes demostraron la edición del genoma en células humanas. [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]

Cas12a

Cas12a (proteína 12a asociada a CRISPR, anteriormente Cpf1) es una endonucleasa - exonucleasa asociada a CRISPR de tipo V de clase II . [ 54 ] En bacterias como F. ​​novicida , [ 55 ] [ 56 ] su contexto natural, Cas12a se dirige y destruye el material genético de virus y otros elementos genéticos móviles extraños . En un organismo objetivo, el crRNA contiene una región constante que Cas12a reconoce y una región "espaciadora" que es complementaria a un fragmento de ácido nucleico extraño (por ejemplo, una porción del genoma de un fago ) que infectó previamente la célula. [ 57 ]

Cas12a se distingue de Cas9: genera cortes escalonados en el ADN de doble cadena, a diferencia de los extremos romos; [ 58 ] se basa en un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) rico en timina (típicamente 5'-TTTV-3', donde V es A, C o G), que ofrece sitios alternativos en comparación con los PAM ricos en guanina (típicamente 5'-NGG-3') preferidos por Cas9; [ 59 ] y solo requiere un ARN CRISPR (crRNA) para una focalización efectiva, mientras que Cas9 necesita tanto un crRNA como un crRNA transactivador (tracrRNA) . [ 60 ]

CRISPR guiado por ADN

Introducidas originalmente por el laboratorio de Jain en una preimpresión, las versiones modificadas de los sistemas de Clase II (específicamente Cas12a) funcionan con una guía de ADN monocatenario artificial en lugar de ARN natural. [ 61 ] Dentro de este nuevo paradigma, la actividad endonucleasa del sistema ahora se redirige hacia la escisión de ARN monocatenario en lugar de ADN bicatenario. [ 62 ] [ 63 ] Con el ADN como guía, ya no se requiere la preparación y conservación complejas del ARN, lo que permite a los efectores de Clase II una mayor versatilidad en la focalización programable de ARN y la biotecnología traslacional. [ 62 ] [ 64 ]

Cas13

Cas13 es una familia de endonucleasas asociadas a CRISPR ortólogas que se dirigen al ARN (a diferencia de Cas9 y Cas12 , que se dirigen al ADN ). Cas13 emplea una sola endonucleasa para unirse y escindir ARN monocatenarios específicos con complementariedad de secuencia a un ARN guía . Cas13 realiza dos funciones de ribonucleasa distintas : el procesamiento de su propio ARN CRISPR (crRNA) y la catálisis de la escisión del ARN diana. [ 65 ] [ 66 ] [ 67 ] La especificidad del sistema permite la corrección de mutaciones a nivel de transcripción .

Cas13 permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssRNA no discriminatoriamente. [ 68 ] Esta propiedad de escisión colateral se explota en el desarrollo de varias tecnologías de diagnóstico. [ 69 ] [ 70 ] [ 71 ] Se ha utilizado para reparar eficientemente el ARNm KRAS -G12D en modelos de cáncer de páncreas minimizando los efectos en las células sanas; [ 65 ] adaptado en herramientas como la plataforma REPAIR, que edita bases de ARN para tratar trastornos genéticos, incluido el síndrome de Usher , en modelos animales; y utilizado en plataformas de diagnóstico como SHERLOCK para detectar patógenos, ADN tumoral y variantes virales con alta sensibilidad. [ 67 ] Su focalización independiente de PAM y los efectos fuera de objetivo reducidos lo hacen adecuado para imágenes de ARN, ingeniería del genoma de fagos y regulación génica transitoria. [ 66 ]

Estructura del locus

Repeticiones y espaciadores

El conjunto CRISPR está compuesto por una secuencia líder rica en AT seguida de repeticiones cortas separadas por espaciadores únicos. [ 72 ] Las repeticiones CRISPR suelen tener un tamaño de entre 28 y 37 pares de bases (pb), aunque pueden tener tan solo 23 pb y hasta 55 pb. [ 73 ] Algunas muestran simetría diádica , lo que implica la formación de una estructura secundaria como un bucle de tallo ('horquilla') en el ARN, mientras que otras están diseñadas para no tener estructura. El tamaño de los espaciadores en diferentes conjuntos CRISPR suele ser de 32 a 38 pb (rango de 21 a 72 pb). [ 73 ] Pueden aparecer nuevos espaciadores rápidamente como parte de la respuesta inmune a la infección por fagos. [ 74 ] Normalmente hay menos de 50 unidades de la secuencia de repetición-espaciador en un conjunto CRISPR. [ 73 ]

Estructuras de ARN CRISPR

Genes Cas y subtipos CRISPR

Pequeños grupos de genes cas suelen estar ubicados junto a las secuencias repetidas-espaciadoras de CRISPR. En conjunto, los 93 genes cas se agrupan en 35 familias según la similitud de secuencia de las proteínas codificadas. Once de las 35 familias forman el núcleo cas , que incluye las familias de proteínas Cas1 a Cas9. Un locus CRISPR-Cas completo tiene al menos un gen perteneciente al núcleo cas . [ 75 ]

Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases. Los sistemas de clase 1 utilizan un complejo de múltiples proteínas Cas para degradar ácidos nucleicos extraños. Los sistemas de clase 2 utilizan una única proteína Cas grande para el mismo propósito. La clase 1 se divide en tipos I, III y IV; la clase 2 se divide en tipos II, V y VI. [ 76 ] Los 6 tipos de sistemas se dividen en 33 subtipos. [ 77 ] Cada tipo y la mayoría de los subtipos se caracterizan por un "gen firma" que se encuentra casi exclusivamente en la categoría. La clasificación también se basa en el complemento de genes cas que están presentes. La mayoría de los sistemas CRISPR-Cas tienen una proteína Cas1. La filogenia de las proteínas Cas1 generalmente concuerda con el sistema de clasificación, [ 78 ] pero existen excepciones debido a la recombinación de módulos. [ 75 ] Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas, lo que sugiere que son compatibles y pueden compartir componentes. [ 79 ] [ 80 ] La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR-Cas sugiere que el sistema CRISPR-Cas está sujeto a transferencia horizontal de genes durante la evolución microbiana .

Mecanismo

Las etapas de la inmunidad CRISPR para cada uno de los 3 tipos principales de inmunidad adaptativa. (1) La adquisición comienza con el reconocimiento del ADN invasor por Cas1 y Cas2 y la escisión de un protoespaciador. (2) El protoespaciador se liga a la repetición directa adyacente a la secuencia líder y (3) la extensión de cadena simple repara el CRISPR y duplica la repetición directa. Las etapas de procesamiento e interferencia del crRNA ocurren de manera diferente en cada uno de los tres sistemas CRISPR principales. (4) El transcrito CRISPR primario es escindido por genes cas para producir crRNAs. (5) En los sistemas de tipo I, Cas6e/Cas6f escinden en la unión de ssRNA y dsRNA formada por bucles en horquilla en la repetición directa. Los sistemas de tipo II utilizan un ARN transactivador (tracr) para formar dsRNA, que es escindido por Cas9 y RNasaIII. Los sistemas de tipo III utilizan un homólogo de Cas6 que no requiere bucles en horquilla en la repetición directa para la escisión. (6) En los sistemas de tipo II y tipo III, el recorte secundario se realiza en el extremo 5' o 3' para producir crRNA maduros. (7) Los crRNA maduros se asocian con proteínas Cas para formar complejos de interferencia. (8) En los sistemas de tipo I y tipo II, las interacciones entre la proteína y la secuencia PAM son necesarias para la degradación del ADN invasor. Los sistemas de tipo III no requieren una secuencia PAM para una degradación exitosa y en los sistemas de tipo III-A el apareamiento de bases ocurre entre el crRNA y el ARNm en lugar del ADN, que es el objetivo de los sistemas de tipo III-B.
El locus genético CRISPR proporciona a las bacterias un mecanismo de defensa para protegerlas de infecciones repetidas por fagos.
Transcripciones del locus genético CRISPR y maduración del pre-crRNA
Estructura 3D del complejo de interferencia CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9, como herramienta molecular, introduce rupturas de doble cadena de ADN dirigidas.
Las roturas de doble cadena de ADN introducidas por CRISPR-Cas9 permiten una mayor manipulación genética mediante la explotación de los mecanismos endógenos de reparación del ADN.

La inmunidad CRISPR-Cas es un proceso natural de bacterias y arqueas. [ 97 ] CRISPR-Cas previene la infección por bacteriófagos, la conjugación y la transformación natural al degradar los ácidos nucleicos extraños que ingresan a la célula. [ 39 ]

Adquisición de espaciadores

Cuando un microbio es invadido por un bacteriófago , la primera etapa de la respuesta inmune consiste en capturar el ADN del fago e insertarlo en un locus CRISPR en forma de espaciador. Cas1 y Cas2 se encuentran en ambos tipos de sistemas inmunes CRISPR-Cas, lo que indica que participan en la adquisición del espaciador. Estudios de mutación confirmaron esta hipótesis, demostrando que la eliminación de Cas1 o Cas2 detuvo la adquisición del espaciador, sin afectar la respuesta inmune CRISPR. [ 98 ] [ 99 ] [ 100 ] [ 101 ] [ 102 ]

Se han caracterizado múltiples proteínas Cas1 y se han resuelto sus estructuras. [ 103 ] [ 104 ] [ 105 ] Las proteínas Cas1 tienen secuencias de aminoácidos diversas. Sin embargo, sus estructuras cristalinas son similares y todas las proteínas Cas1 purificadas son nucleasas/ integrasas dependientes de metales que se unen al ADN de manera independiente de la secuencia. [ 79 ] Se han caracterizado proteínas Cas2 representativas y poseen actividad endorribonucleasa específica para ARN monocatenario (ssRNA) [ 106 ] o ADN bicatenario (dsDNA) [ 107 ] [ 108 ] .

En el sistema IE de E. coli , Cas1 y Cas2 forman un complejo donde un dímero de Cas2 une dos dímeros de Cas1. [ 109 ] En este complejo, Cas2 realiza una función de andamiaje no enzimático, [ 109 ] uniendo fragmentos de doble cadena del ADN invasor, mientras que Cas1 se une a los flancos de cadena simple del ADN y cataliza su integración en matrices CRISPR. [ 110 ] [ 111 ] [ 112 ] Por lo general, se agregan nuevos espaciadores al comienzo del CRISPR junto a la secuencia líder creando un registro cronológico de infecciones virales. [ 113 ] En E. coli, una proteína similar a la histona llamada factor de integración del huésped ( IHF ), que se une a la secuencia líder, es responsable de la precisión de esta integración. [ 114 ] IHF también mejora la eficiencia de integración en el sistema tipo IF de Pectobacterium atrosepticum , [ 115 ] pero en otros sistemas, pueden ser necesarios diferentes factores del huésped [ 116 ]

Motivos adyacentes al protoespaciador (PAM)

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que fueron escindidas como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que no fueron seleccionados aleatoriamente sino que se encontraron adyacentes a secuencias de ADN cortas (3–5 pb) denominadas motivos adyacentes al protoespaciador (PAM). El análisis de sistemas CRISPR-Cas mostró que los PAM son importantes para los sistemas de tipo I y tipo II, pero no para los de tipo III durante la adquisición. [ 34 ] [ 117 ] [ 118 ] [ 119 ] [ 120 ] [ 121 ] En los sistemas de tipo I y tipo II, los protoespaciadores se escinden en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador cortado mediante un mecanismo de regla, manteniendo así la regularidad del tamaño del espaciador en la matriz CRISPR. [ 122 ] [ 123 ] La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar vinculada evolutivamente a Cas1 y la secuencia líder . [ 121 ] [ 124 ]

Se añaden nuevos espaciadores a una matriz CRISPR de forma direccional, [ 32 ] ocurriendo preferentemente, [ 74 ] [ 117 ] [ 118 ] [ 125 ] [ 126 ] pero no exclusivamente, adyacentes [ 120 ] [ 123 ] a la secuencia líder. El análisis del sistema de tipo IE de E. coli demostró que la primera repetición directa adyacente a la secuencia líder se copia, con el espaciador recién adquirido insertado entre la primera y la segunda repetición directa. [ 101 ] [ 122 ]

La secuencia PAM parece ser importante durante la inserción del espaciador en los sistemas de tipo IE. Esa secuencia contiene un nucleótido (nt) final fuertemente conservado adyacente al primer nt del protoespaciador. Este nt se convierte en la base final en la primera repetición directa. [ 102 ] [ 127 ] [ 128 ] Esto sugiere que la maquinaria de adquisición del espaciador genera salientes monocatenarios en la penúltima posición de la repetición directa y en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo, no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen compartir este mecanismo, ya que los PAM en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final. [ 124 ] Es probable que en esos sistemas, se genere un extremo romo en el extremo de la repetición directa y del protoespaciador durante la adquisición.

Variantes de inserción

El análisis de los CRISPR de Sulfolobus solfataricus reveló complejidades adicionales al modelo canónico de inserción de espaciadores, ya que uno de sus seis loci CRISPR insertó nuevos espaciadores aleatoriamente a lo largo de su matriz CRISPR, en lugar de insertarlos lo más cerca posible de la secuencia líder. [ 123 ]

Múltiples sistemas CRISPR contienen muchos espaciadores del mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno se descubrió en el sistema de tipo IE de E. coli . Se detectó una mejora significativa en la adquisición de espaciadores donde estos ya apuntan al fago, incluso con desajustes respecto al protoespaciador. Este "cebado" requiere que las proteínas Cas involucradas tanto en la adquisición como en la interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores recién adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma hebra que el espaciador de cebado. [ 102 ] [ 127 ] [ 128 ] Esta observación llevó a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición se desliza a lo largo del ADN extraño después del cebado para encontrar un nuevo protoespaciador. [ 128 ]

Biogénesis

El ARN-CRISPR (crRNA), que posteriormente guía a la nucleasa Cas hacia el objetivo durante el paso de interferencia, debe generarse a partir de la secuencia CRISPR. El crRNA se transcribe inicialmente como parte de un único transcrito largo que abarca gran parte del conjunto CRISPR. [ 30 ] Este transcrito es luego escindido por las proteínas Cas para formar crRNAs. El mecanismo para producir crRNAs difiere entre los sistemas CRISPR-Cas. En los sistemas de tipo IE y tipo IF, las proteínas Cas6e y Cas6f, respectivamente, reconocen bucles de tallo [ 129 ] [ 130 ] [ 131 ] creados por el apareamiento de repeticiones idénticas que flanquean el crRNA. [ 132 ] Estas proteínas Cas escinden el transcrito más largo en el borde de la región apareada, dejando un único crRNA junto con un pequeño remanente de la región de repetición apareada.

Los sistemas de tipo III también utilizan Cas6; sin embargo, sus repeticiones no producen bucles de tallo. En cambio, la escisión se produce cuando el transcrito más largo se enrolla alrededor de Cas6 para permitir la escisión justo antes de la secuencia repetida. [ 133 ] [ 134 ] [ 135 ]

Los sistemas de tipo II carecen del gen Cas6 y, en su lugar, utilizan la RNasa III para la escisión. Los sistemas funcionales de tipo II codifican un ARN pequeño adicional que es complementario a la secuencia repetida, conocido como ARNcr transactivador (tracrRNA). [ 136 ] La transcripción del tracrRNA y del transcrito CRISPR primario da como resultado el apareamiento de bases y la formación de ARN bicatenario en la secuencia repetida, que posteriormente es atacado por la RNasa III para producir crRNA. A diferencia de los otros dos sistemas, el crRNA no contiene el espaciador completo, sino que está truncado en un extremo. [ 88 ]

Los ARNcr se asocian con proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Los ARNcr no muestran preferencia entre las hebras codificantes y no codificantes, lo que indica un sistema de direccionamiento de ADN guiado por ARN. [ 8 ] [ 41 ] [ 98 ] [ 102 ] [ 137 ] [ 138 ] [ 139 ] El complejo de tipo IE (comúnmente denominado Cascade) requiere cinco proteínas Cas unidas a un único ARNcr. [ 140 ] [ 141 ]

Interferencia

Durante la fase de interferencia en los sistemas de tipo I, la secuencia PAM se reconoce en la hebra complementaria del crRNA y es necesaria junto con el apareamiento del crRNA. En los sistemas de tipo I, el apareamiento correcto de bases entre el crRNA y el protoespaciador desencadena un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II dependen de una única proteína multifuncional, Cas9 , para el paso de interferencia. [ 88 ] Cas9 requiere tanto el crRNA como el tracrRNA para funcionar y cortar el ADN utilizando sus dominios endonucleasa duales HNH y RuvC/RNaseH. El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago es necesario en los sistemas de tipo II. Sin embargo, el PAM se reconoce en la misma hebra que el crRNA (la hebra opuesta a la de los sistemas de tipo I).

Los sistemas de tipo III, al igual que los de tipo I, requieren seis o siete proteínas Cas que se unen a los crRNA. [ 142 ] [ 143 ] Los sistemas de tipo III analizados de S. solfataricus y P. furiosus se dirigen al ARNm de los fagos en lugar del genoma de ADN del fago, [ 80 ] [ 143 ] lo que puede hacer que estos sistemas sean excepcionalmente capaces de dirigirse a genomas de fagos basados ​​en ARN. [ 79 ] También se encontró que los sistemas de tipo III se dirigen al ADN además del ARN utilizando una proteína Cas diferente en el complejo, Cas10. [ 144 ] Se demostró que la escisión del ADN dependía de la transcripción. [ 145 ]

El mecanismo para distinguir el ADN propio del extraño durante la interferencia está integrado en los crRNA y, por lo tanto, es probable que sea común a los tres sistemas. A lo largo del proceso de maduración distintivo de cada tipo principal, todos los crRNA contienen una secuencia espaciadora y alguna porción de la repetición en uno o ambos extremos. Es la secuencia de repetición parcial la que impide que el sistema CRISPR-Cas se dirija al cromosoma, ya que el apareamiento de bases más allá de la secuencia espaciadora señala lo propio e impide la escisión del ADN. [ 146 ] Las enzimas CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción de tipo V.

Evolución

Se cree que los genes cas en los módulos adaptador y efector del sistema CRISPR-Cas evolucionaron a partir de dos módulos ancestrales diferentes. Un elemento similar a un transposón llamado casposón, que codifica la integrasa similar a Cas1 y potencialmente otros componentes del módulo de adaptación, se insertó junto al módulo efector ancestral, que probablemente funcionaba como un sistema inmunitario innato independiente. [ 147 ] Los genes cas1 y cas2 altamente conservados del módulo adaptador evolucionaron a partir del módulo ancestral, mientras que una variedad de genes cas efectores de clase 1 evolucionaron a partir del módulo efector ancestral. [ 148 ] La evolución de estos diversos genes cas del módulo efector de clase 1 fue guiada por varios mecanismos, como eventos de duplicación. [ 149 ] Por otro lado, cada tipo de módulo efector de clase 2 surgió de inserciones independientes posteriores de elementos genéticos móviles. [ 150 ] Estos elementos genéticos móviles tomaron el lugar de los módulos efectores de múltiples genes para crear módulos efectores de un solo gen que producen grandes proteínas que realizan todas las tareas necesarias del módulo efector. [ 150 ] Las regiones espaciadoras de los sistemas CRISPR-Cas se toman directamente de elementos genéticos móviles extraños y, por lo tanto, su evolución a largo plazo es difícil de rastrear. [ 151 ] Se ha descubierto que la evolución no aleatoria de estas regiones espaciadoras depende en gran medida del entorno y de los elementos genéticos móviles extraños particulares que contiene. [ 152 ]

CRISPR-Cas puede inmunizar bacterias contra ciertos fagos y, por lo tanto, detener la transmisión. Por esta razón, Koonin describió CRISPR-Cas como un mecanismo de herencia lamarckiana . [ 153 ] Sin embargo, esto fue refutado por un crítico que señaló: «Debemos recordar [a Lamarck] por el bien que aportó a la ciencia, no por cosas que se asemejan a su teoría solo superficialmente. De hecho, pensar en CRISPR y otros fenómenos como lamarckianos solo oscurece la forma simple y elegante en que realmente funciona la evolución». [ 154 ] Pero a medida que se han realizado estudios más recientes, se ha hecho evidente que las regiones espaciadoras adquiridas de los sistemas CRISPR-Cas son, de hecho, una forma de evolución lamarckiana porque son mutaciones genéticas que se adquieren y luego se transmiten. [ 155 ] Por otro lado, la evolución de la maquinaria genética Cas que facilita el sistema evoluciona a través de la evolución darwiniana clásica. [ 155 ]

Coevolución

El análisis de secuencias CRISPR reveló la coevolución de los genomas del huésped y del virus. [ 156 ]

El modelo básico de la evolución de CRISPR consiste en la incorporación de espaciadores que impulsan a los fagos a mutar sus genomas para evitar la respuesta inmune bacteriana, creando diversidad tanto en las poblaciones de fagos como de huéspedes. Para resistir una infección por fagos, la secuencia del espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen objetivo del fago. Los fagos pueden seguir infectando a sus huéspedes debido a mutaciones puntuales en el espaciador. [ 146 ] Se requiere una rigurosidad similar en PAM o la cepa bacteriana permanece sensible a los fagos. [ 118 ] [ 146 ]

Tarifas

Un estudio de 124 cepas de S. thermophilus mostró que el 26% de todos los espaciadores eran únicos y que los diferentes loci CRISPR presentaban diferentes tasas de adquisición de espaciadores. [ 117 ] Algunos loci CRISPR evolucionan más rápidamente que otros, lo que permitió determinar las relaciones filogenéticas de las cepas. Un análisis genómico comparativo mostró que E. coli y S. enterica evolucionan mucho más lentamente que S. thermophilus . Las cepas de este último, que divergieron hace 250 000 años, aún contenían el mismo conjunto de espaciadores. [ 157 ]

El análisis metagenómico de dos biopelículas de drenaje ácido de minas mostró que uno de los CRISPR analizados contenía deleciones extensas y adiciones de espaciadores en comparación con la otra biopelícula, lo que sugiere una mayor actividad/prevalencia de fagos en una comunidad que en la otra. [ 74 ] En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que entre el 7 y el 22 % de los espaciadores se compartieron durante 17 meses dentro de un individuo, mientras que menos del 2 % se compartieron entre individuos. [ 126 ]

En el mismo entorno, se rastreó una cepa individual utilizando cebadores de PCR específicos para su sistema CRISPR. Los resultados generales de presencia/ausencia de espaciadores mostraron una diversidad significativa. Sin embargo, este CRISPR añadió tres espaciadores en 17 meses, [ 126 ] lo que sugiere que incluso en un entorno con una diversidad CRISPR significativa, algunos loci evolucionan lentamente.

Se analizaron los CRISPR a partir de los metagenomas producidos para el Proyecto Microbioma Humano . [ 158 ] Aunque la mayoría eran específicos de un sitio corporal, algunos dentro de un mismo sitio corporal se comparten ampliamente entre individuos. Uno de estos loci se originó en especies de estreptococos y contenía aproximadamente 15 000 espaciadores, el 50 % de los cuales eran únicos. De forma similar a los estudios dirigidos de la cavidad oral, algunos mostraron poca evolución a lo largo del tiempo. [ 158 ]

La evolución de CRISPR se estudió en quimiostatos utilizando S. thermophilus para examinar directamente las tasas de adquisición de espaciadores. En una semana, las cepas de S. thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores al ser desafiadas con un solo fago. [ 159 ] Durante el mismo intervalo, el fago desarrolló polimorfismos de un solo nucleótido que se fijaron en la población, lo que sugiere que la focalización había impedido la replicación del fago en ausencia de estas mutaciones. [ 159 ]

Otro experimento con S. thermophilus demostró que los fagos pueden infectar y replicarse en huéspedes que poseen un único espaciador de direccionamiento. Otro más demostró que los huéspedes sensibles pueden existir en entornos con altos títulos de fagos. [ 160 ] Los estudios en quimiostato y observacionales sugieren muchos matices en la (co)evolución de CRISPR y los fagos.

Identificación

Los CRISPR están ampliamente distribuidos entre bacterias y arqueas [ 84 ] y muestran algunas similitudes de secuencia [ 132 ] . Su característica más notable son sus espaciadores repetitivos y repeticiones directas. Esta característica hace que los CRISPR sean fácilmente identificables en largas secuencias de ADN, ya que el número de repeticiones disminuye la probabilidad de una coincidencia falsa positiva [ 161 ].

El análisis de CRISPR en datos metagenómicos es más complejo, ya que los loci CRISPR no suelen ensamblarse debido a su naturaleza repetitiva o a la variación de cepas, lo que confunde a los algoritmos de ensamblaje. Cuando se dispone de muchos genomas de referencia, se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los conjuntos CRISPR y analizar el contenido de los espaciadores. [ 117 ] [ 126 ] [ 162 ] [ 163 ] [ 164 ] [ 165 ] Sin embargo, este enfoque solo proporciona información para CRISPR específicos y para organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para diseñar cebadores de PCR de polimerasa fiables. Se pueden utilizar cebadores degenerados específicos de repetición para amplificar los espaciadores CRISPR directamente a partir de muestras ambientales; los amplicones que contienen dos o tres espaciadores se pueden ensamblar computacionalmente para reconstruir conjuntos CRISPR largos. [ 165 ]

La alternativa es extraer y reconstruir matrices CRISPR a partir de datos metagenómicos de secuenciación masiva. Esto es computacionalmente más difícil, particularmente con tecnologías de secuenciación de segunda generación (por ejemplo, 454, Illumina), ya que las longitudes cortas de las lecturas impiden que aparezcan más de dos o tres unidades repetidas en una sola lectura. La identificación de CRISPR en lecturas crudas se ha logrado utilizando una identificación puramente de novo [ 166 ] o utilizando secuencias de repetición directa en matrices CRISPR parcialmente ensambladas a partir de contigs (segmentos de ADN superpuestos que juntos representan una región de consenso de ADN) [ 158 ] y secuencias de repetición directa de genomas publicados [ 167 ] como un gancho para identificar repeticiones directas en lecturas individuales.

Uso por fagos

Otra forma en que las bacterias se defienden de la infección por fagos es mediante islas cromosómicas . Un subtipo de islas cromosómicas llamado isla cromosómica inducible por fagos (PICI) se escinde de un cromosoma bacteriano tras la infección por fagos y puede inhibir la replicación del fago. [ 168 ] Las PICI son inducidas, escindidas, replicadas y finalmente empaquetadas en pequeñas cápsides por ciertos fagos templados estafilocócicos. Las PICI utilizan varios mecanismos para bloquear la reproducción del fago. En el primer mecanismo, la Ppi codificada por la PICI bloquea diferencialmente la maduración del fago al unirse o interactuar específicamente con TerS del fago, bloqueando así la formación del complejo TerS/TerL del fago responsable del empaquetamiento del ADN del fago. En el segundo mecanismo, PICI CpmAB redirige la proteína morfogenética de la cápside del fago para producir una cápside del tamaño de SaPI del 95%, y el ADN del fago solo puede empaquetar 1/3 de su genoma en estas cápsides pequeñas, convirtiéndose así en un fago no viable. [ 169 ] El tercer mecanismo involucra dos proteínas, PtiA y PtiB, que se dirigen a LtrC, responsable de la producción de proteínas de lisis y del virión. Este mecanismo de interferencia está modulado por una proteína moduladora, PtiM, que se une a una de las proteínas mediadoras de la interferencia, PtiA, logrando así el nivel de interferencia requerido. [ 170 ]

Un estudio demostró que el fago lítico ICP1, que ataca específicamente al serogrupo O1 de Vibrio cholerae , ha adquirido un sistema CRISPR-Cas que ataca un elemento similar al PICI de V. cholerae . El sistema tiene 2 loci CRISPR y 9 genes Cas. Parece ser homólogo al sistema IF encontrado en Yersinia pestis . Además, al igual que el sistema CRISPR-Cas bacteriano, el sistema CRISPR-Cas de ICP1 puede adquirir nuevas secuencias, lo que permite la coevolución del fago y el huésped. [ 171 ] [ 172 ]

Se ha demostrado que ciertos virus arqueales portan matrices mini-CRISPR que contienen uno o dos espaciadores. Se ha demostrado que los espaciadores dentro de las matrices CRISPR portadas por virus se dirigen a otros virus y plásmidos, lo que sugiere que las matrices mini-CRISPR representan un mecanismo de exclusión de superinfección heterotípica y participan en conflictos intervirales. [ 165 ]

Aplicaciones

La edición genética CRISPR es una tecnología revolucionaria que permite modificaciones precisas y dirigidas al ADN de los organismos vivos. Desarrollado a partir de un mecanismo de defensa natural presente en las bacterias, CRISPR-Cas9 es el sistema más utilizado. La edición genética con CRISPR-Cas9 implica una nucleasa Cas9 y un ARN guía diseñado , que se combinan para permitir el "corte" preciso de una o ambas hebras de ADN en ubicaciones específicas dentro del genoma. [ 173 ] Utiliza los sistemas naturales de reparación del ADN de la célula, incluyendo la unión de extremos no homólogos , la reparación dirigida por homología o la reparación de errores de apareamiento , para modificar, insertar o eliminar material genético en estos sitios de corte específicos. [ 173 ] [ 174 ] Esta tecnología ha transformado campos como la genética, la medicina, [ 175 ] [ 176 ] [ 177 ] y la agricultura, [ 178 ] ofreciendo posibles tratamientos para trastornos genéticos, avances en la ingeniería de cultivos e investigación sobre el funcionamiento fundamental de la vida. Sin embargo, sus implicaciones éticas y posibles consecuencias no deseadas han generado un debate significativo. [ 179 ] [ 180 ]

Experiencias con CRISPR

En febrero de 2025 se documentó el primer caso de terapia de edición genética CRISPR en un niño. Se utilizó para tratar la deficiencia grave de carbamoilfosfato sintetasa 1. Se administró en el Hospital Infantil de Filadelfia y actualmente se utiliza con éxito para contrarrestar la enfermedad. [ 181 ]

Véase también

Notas

  1. ↑ El subtipo IG se conocía anteriormente como subtipo IU . [ 78 ]
  2. ↑ El subtipo VK se conocía anteriormente como subtipo VU 5. [ 86 ]

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Banco de datos de proteínas

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  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P76632 (subunidad Cascade del sistema CRISPR CasB) en el PDBe-KB .
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q46899 (subunidad Cascade del sistema CRISPR CasC) en el PDBe-KB .
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q46898 (subunidad Cascade del sistema CRISPR CasD) en el PDBe-KB .
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q46897 (subunidad Cascade del sistema CRISPR CasE) en el PDBe-KB .