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Microscopio electrónico

Un microscopio electrónico de transmisión moderno (TITAN) Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza un haz de electrones como fuente de iluminación. Emplea óptica...

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Un microscopio electrónico de transmisión moderno (TITAN)

Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza un haz de electrones como fuente de iluminación. Emplea óptica electrónica , análoga a las lentes de vidrio de un microscopio óptico, para controlar el haz de electrones, por ejemplo, enfocándolo para producir imágenes ampliadas o patrones de difracción de electrones . Dado que la longitud de onda de un electrón puede ser más de 100 000 veces menor que la de la luz visible, los microscopios electrónicos tienen una resolución mucho mayor , de aproximadamente 0,1  nm, en comparación con los aproximadamente 200  nm de los microscopios ópticos . [ 1 ] Microscopio electrónico puede referirse a:

Encontrará información adicional en los enlaces anteriores.

Este artículo contiene información general sobre los diferentes tipos de estos instrumentos , principalmente sobre microscopios electrónicos de transmisión y de barrido , con algo de información sobre otros tipos y secciones breves con enlaces a artículos más extensos sobre algunas de las formas de utilizar estos instrumentos, cómo preparar muestras y algunas de sus limitaciones .

Historia

Muchos avances sentaron las bases de la óptica electrónica utilizada en los microscopios. [ 2 ] Un paso significativo fue el trabajo de Hertz en 1883 [ 3 ] quien creó un tubo de rayos catódicos con deflexión electrostática y magnética, demostrando la manipulación de la dirección de un haz de electrones. Otros avances fueron el enfoque de los electrones mediante un campo magnético axial por Emil Wiechert en 1899, [ 4 ] cátodos recubiertos de óxido mejorados que producían más electrones por Arthur Wehnelt en 1905 [ 5 ] y el desarrollo de la lente electromagnética en 1926 por Hans Busch . [ 6 ] Según Dennis Gabor , el físico Leó Szilárd intentó en 1928 convencerlo de construir un microscopio electrónico, para el cual Szilárd había presentado una patente. [ 7 ]

Reproducción de un microscopio electrónico antiguo construido por Ernst Ruska en la década de 1930.

Hasta el día de hoy, la cuestión de quién inventó el microscopio electrónico de transmisión es controvertida. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] En 1928, en la Technische Hochschule de Charlottenburg (ahora Technische Universität Berlin ), Adolf Matthias (profesor de Tecnología de Alta Tensión e Instalaciones Eléctricas) designó a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores para avanzar en la investigación sobre haces de electrones y osciloscopios de rayos catódicos. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, entre ellos Ernst Ruska . En 1931, Max Knoll y Ernst Ruska [ 12 ] [ 13 ] generaron con éxito imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre una abertura de ánodo. El dispositivo, una réplica del cual se muestra en la figura, utilizaba dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, el primer microscopio electrónico. (Max Knoll falleció en 1969, por lo que no recibió parte del Premio Nobel de 1986 por la invención de los microscopios electrónicos).

Aparentemente independiente de este esfuerzo, Reinhold Rüdenberg trabajó en Siemens-Schuckert . Según la ley de patentes (Patentes de EE. UU. n.° 2058914 [ 14 ] y 2070318 [ 15 ] , ambas presentadas en 1932), es el inventor del microscopio electrónico, pero no está claro cuándo dispuso de un instrumento funcional. En un breve artículo de 1932 [ 16 ] , afirmó que Siemens llevaba varios años trabajando en ello antes de que se presentaran las patentes ese mismo año, alegando que su trabajo era paralelo al desarrollo universitario. Falleció en 1961, por lo que, al igual que Max Knoll, no pudo optar al Premio Nobel de 1986 [ 17 ] .

Al año siguiente, 1933, Ruska y Knoll construyeron el primer microscopio electrónico que superó la resolución de un microscopio óptico (de luz). [ 18 ] Cuatro años después, en 1937, Siemens financió el trabajo de Ernst Ruska y Bodo von Borries , y empleó a Helmut Ruska , hermano de Ernst, para desarrollar aplicaciones para el microscopio, especialmente con especímenes biológicos. [ 18 ] [ 19 ] También en 1937, Manfred von Ardenne fue pionero del microscopio electrónico de barrido . [ 20 ] Siemens produjo el primer microscopio electrónico comercial en 1938. [ 21 ] Los primeros microscopios electrónicos norteamericanos se construyeron en la década de 1930, en la Universidad Estatal de Washington por Anderson y Fitzsimmons [ 22 ] y en la Universidad de Toronto por Eli Franklin Burton y los estudiantes Cecil Hall, James Hillier y Albert Prebus. Siemens produjo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) en 1939. [ 23 ] Aunque los microscopios electrónicos de transmisión actuales son capaces de alcanzar una magnificación de dos millones de veces, como instrumentos científicos siguen siendo similares pero con ópticas mejoradas.

En la década de 1940, se desarrollaron microscopios electrónicos de alta resolución, lo que permitió una mayor magnificación y resolución. [ 24 ] En 1965, Albert Crewe, de la Universidad de Chicago, introdujo el microscopio electrónico de transmisión de barrido utilizando una fuente de emisión de campo , [ 25 ] lo que permitió microscopios de barrido de alta resolución. [ 26 ] A principios de la década de 1980, las mejoras en la estabilidad mecánica, así como el uso de voltajes de aceleración más altos, permitieron la obtención de imágenes de materiales a escala atómica. [ 27 ] [ 28 ] En la década de 1980, el cañón de emisión de campo se hizo común para los microscopios electrónicos, mejorando la calidad de la imagen debido a la coherencia adicional y las menores aberraciones cromáticas. La década de 2000 estuvo marcada por avances en la microscopía electrónica con corrección de aberraciones, lo que permitió mejoras significativas en la resolución y la claridad de las imágenes. [ 29 ] [ 30 ]

Tipos de microscopios electrónicos

Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de transmisión

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Microscopio electrónico de transmisión

La forma original del microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión (TEM), utiliza un haz de electrones de alto voltaje para iluminar la muestra y crear una imagen. Un cañón de electrones produce un haz de electrones , cuyos electrones suelen tener energías en el rango de 20 a 400 keV, se enfocan mediante lentes electromagnéticas y se transmiten a través de una muestra delgada. Al emerger de la muestra, el haz de electrones transporta información sobre su estructura, que luego es magnificada por las lentes del microscopio. La variación espacial de esta información (la "imagen") se puede observar proyectando la imagen electrónica magnificada sobre un detector . Por ejemplo, un operador puede observar la imagen directamente mediante una pantalla fluorescente recubierta con un fósforo o un material centelleador , como el sulfuro de zinc . Más comúnmente, un fósforo de alta resolución se acopla, mediante un sistema óptico de lentes o una guía de luz de fibra óptica , al sensor de una cámara digital . [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]

For many years the resolution of TEMs was limited by aberrations of the electron optics, primarily the spherical aberration. In most recent instruments hardware correctors can reduce spherical aberration and other aberrations, improving the resolution in high-resolution transmission electron microscopy (HRTEM) to below 0.5 angstrom (50 picometres),[35] enabling magnifications of more than 50 million times.[36] The ability of HRTEM to determine the positions of atoms within materials is useful for many areas of research and development.[37]

Scanning electron microscope (SEM)

Operating principle of a scanning electron microscope

An SEM produces images by probing the specimen with a focused electron beam that is scanned across the specimen (raster scanning). When the electron beam interacts with the specimen, it loses energy and is scattered in different directions by a variety of mechanisms. These interactions lead to, among other events, emission of low-energy secondary electrons and high-energy backscattered electrons, light emission (cathodoluminescence) or X-ray emission. All of these signals carrying information about the specimen, such as the surface topography and composition. The image displayed when using an SEM shows the variation in the intensity of any of these signals as an image. In these each position in the image corresponding to a position of the beam on the specimen when the signal was generated.[38]:1–15

TESCAN S8000X SEM

SEMs are different from TEMs in that they use electrons with much lower energy, generally below 20 keV,[39] while TEMs generally use electrons with energies in the range of 80-300 keV.[40] Thus, the electron sources and optics of the two microscopes have different designs, and they are normally separate instruments.[41]

Scanning transmission electron microscope (STEM)

A STEM combines features of both a TEM and a SEM by rastering a focused incident probe across a specimen, but now mainly using the electrons which are transmitted through the sample. Many types of imaging are common to both TEM and STEM, but some such as annular dark-field imaging and other analytical techniques are much easier to perform with higher spatial resolutions in a STEM instrument. One drawback is that image data is acquired in serial rather than in parallel fashion.[38]:75–138

Low-voltage electron microscope

Un instrumento de bajo voltaje utiliza voltajes de aceleración mucho menores, típicamente de unos pocos kiloelectronvoltios (keV) o menos. Se pueden utilizar como instrumentos de transmisión con muestras muy delgadas. [ 42 ] Un tipo de microscopio ligeramente diferente, llamado LEEM , utiliza los electrones difractados de vuelta desde una muestra. [ 43 ] [ 44 ]

Microscopio electrónico de alto voltaje

Un microscopio electrónico de alto voltaje es aquel que opera utilizando energías mucho mayores para los electrones. [ 45 ] Estos instrumentos se utilizaban principalmente para obtener imágenes de muestras más gruesas o para aplicaciones especializadas, como el estudio del daño por radiación. [ 45 ] [ 46 ] Estos instrumentos son mucho más grandes que los microscopios electrónicos de transmisión estándar; por ejemplo, un microscopio en Osaka, Japón, ostenta el récord de voltaje, operando con electrones de energía de hasta 3 MeV, y tenía aproximadamente cuatro pisos de altura. [ 47 ]

Instrumentos con corrección de aberraciones

Microscopio electrónico de transmisión de barrido equipado con un corrector de aberración esférica de tercer orden.

La microscopía electrónica de transmisión con corrección de aberraciones (AC-TEM) es el término general para los microscopios electrónicos en los que se introducen componentes electroópticos para reducir las aberraciones que, de otro modo, limitarían la resolución de las imágenes. Históricamente, los microscopios electrónicos presentaban aberraciones bastante severas, y hasta principios del siglo XXI la resolución era limitada, pudiendo obtener imágenes de la estructura atómica de los materiales si los átomos estaban lo suficientemente separados. [ 48 ] Alrededor del cambio de siglo, los componentes electroópticos se acoplaron al control informático de las lentes y su alineación, lo que permitió la corrección de las aberraciones. La primera demostración de corrección de aberraciones en modo TEM fue realizada por Harald Rose y Maximilian Haider en 1998 utilizando un corrector hexapolar, y en modo STEM por Ondrej Krivanek y Niklas Dellby en 1999 utilizando un corrector cuadrupolar/octupolar. [ 49 ]

A partir de 2025, la corrección de aberraciones geométricas es estándar en muchos microscopios electrónicos comerciales y se utilizan ampliamente en diversas áreas de la ciencia. [ 50 ] [ 51 ] También se han utilizado correctores similares a energías mucho más bajas para instrumentos LEEM . [ 52 ]

microscopio electrónico de reflexión (REM)

En un microscopio electrónico de reflexión (REM), al igual que en el TEM, un haz de electrones incide sobre una superficie, pero en lugar de utilizar los electrones de transmisión (TEM) o secundarios (SEM), se detecta el haz reflejado de electrones dispersados ​​elásticamente . Esta técnica se suele combinar con la difracción de electrones de alta energía por reflexión (RHEED) y la espectroscopia de pérdida de energía de alta energía por reflexión (RHELS) . [ 53 ] Otra variante es la microscopía electrónica de baja energía con polarización de espín ( SPLEEM ), que se utiliza para observar la microestructura de dominios magnéticos . [ 54 ]

Modos de funcionamiento principales

Imagen de una hormiga en un microscopio electrónico de barrido (SEM).

Los métodos más comunes para obtener imágenes en un microscopio electrónico implican seleccionar diferentes direcciones para los electrones que han sido transmitidos a través de una muestra, y/o electrones de diferentes energías. [ 31 ] [ 33 ] Hay una gran cantidad de métodos para hacer esto, aunque no todos son muy comunes.

electrones secundarios

Volumen de interacción electrón-materia y tipos de señal generada en un microscopio electrónico de barrido (SEM).

En un microscopio electrónico de barrido (SEM), las señales resultan de las interacciones del haz de electrones con los átomos dentro de la muestra. El modo más común es utilizar los electrones secundarios (SE) para producir imágenes. Los electrones secundarios tienen energías muy bajas, del orden de 50 eV , lo que limita su recorrido libre medio en materia sólida a unos pocos nanómetros por debajo de la superficie de la muestra. [ 55 ] Los electrones son detectados por un detector Everhart-Thornley , [ 56 ] que es un tipo de sistema colector- centelleador - fotomultiplicador . La señal de los electrones secundarios tiende a estar altamente localizada en el punto de impacto del haz de electrones primario, lo que permite obtener imágenes de la superficie de la muestra con una resolución mejor que 1 nm y con instrumentos especializados a escala atómica. [ 57 ]

The brightness of the signal depends on the number of secondary electrons reaching the detector. If the beam enters the sample perpendicular to the surface, then the electrons come out symmetrically about the axis of the beam. As the angle of incidence increases, the interaction volume from which they cone increases and the "escape" distance from one side of the beam decreases, resulting in more secondary electrons being emitted from the sample. Thus steep surfaces and edges tend to be brighter than flat surfaces, which results in images with a well-defined, three-dimensional appearance that is similar to a reflected light image.[55]

Backscattered electrons

Backscattered electrons (BSE) are those emitted back out from the specimen due to beam-specimen interactions where the electrons undergo elastic and inelastic scattering. They are conventionally defined as having energies from 50 eV up to the energy of the primary beam. Backscattered electrons can be used for both imaging and to form an electron backscatter diffraction (EBSD) image, the latter can be used to determine the crystallography of the specimen.[55]

Electron backscatter diffraction pattern for (001) single crystal silicon crystals taken at 20kV using Oxford S2 detector

Heavy elements (high atomic number) backscatter electrons more strongly than light elements (low atomic number), and thus appear brighter in the image, BSE images can therefore be used to detect areas with different chemical compositions.[55] To optimize the signal, dedicated backscattered electron detectors are positioned above the sample in a "doughnut" type arrangement, concentric with the electron beam, maximizing the solid angle of collection. BSE detectors are usually either scintillator or semiconductor types. When all parts of the detector are used to collect electrons symmetrically about the beam, atomic number contrast is produced. However, strong topographic contrast is produced by collecting back-scattered electrons from one side above the specimen using an asymmetrical, directional BSE detector; the resulting contrast appears as if there was illumination of the topography from that side. Semiconductor detectors can be made in radial segments that can be switched in or out to control the type of contrast produced and its directionality.[55]

Diffraction contrast imaging

El contraste de difracción utiliza la variación en la dirección de los electrones difractados o en su amplitud, o en ambas, en función de la posición como mecanismo de contraste. El método consiste en utilizar una apertura del objetivo debajo de la muestra y seleccionar solo una o varias direcciones de difracción diferentes, para luego utilizarlas para formar una imagen. Cuando la apertura incluye la dirección del haz incidente, las imágenes se denominan de campo claro , ya que, en ausencia de muestra, el campo de visión sería uniformemente brillante. Cuando la apertura excluye el haz incidente, las imágenes se denominan de campo oscuro , ya que, de forma similar, sin muestra, la imagen sería uniformemente oscura. [ 32 ] [ 33 ] Una variante de este método se denomina microscopía de campo oscuro de haz débil y puede utilizarse para obtener imágenes de alta resolución de defectos como dislocaciones. [ 58 ]

Imágenes de alta resolución

Imagen de alta resolución de CuTe

En la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (también llamada a veces microscopía electrónica de alta resolución), se permite que varios haces difractados diferentes atraviesen la apertura del objetivo. Estos interfieren, dando lugar a imágenes que representan la estructura atómica del material. Estas imágenes pueden incluir la dirección del haz incidente o, en el caso de los microscopios electrónicos de transmisión de barrido, suelen corresponder a un rango de haces difractados, excluyendo el haz incidente. [ 28 ] Dependiendo del grosor de las muestras y de las aberraciones del microscopio, estas imágenes pueden interpretarse directamente en términos de las posiciones de las columnas de átomos o requerir un análisis más cuidadoso mediante cálculos de la dispersión múltiple de los electrones [ 59 ] y el efecto de la función de transferencia de contraste del microscopio. [ 60 ]

Existen muchas otras variantes de imágenes que también pueden proporcionar información a nivel atómico. La holografía electrónica utiliza la interferencia de electrones que han atravesado la muestra y un haz de referencia. [ 61 ] La microscopía electrónica de transmisión de barrido 4D (4D STEM) recopila datos de difracción en cada punto mediante un instrumento de escaneo y luego los procesa para producir diferentes tipos de imágenes. [ 62 ]

microanálisis de rayos X

Espectro EDS de la costra mineral del camarón de ventilación Rimicaris exoculata [ 63 ] La mayoría de estos picos son líneas K-alfa y K-beta . Un pico es de la concha L de hierro.

El microanálisis de rayos X es un método para obtener información química local dentro de microscopios electrónicos de todo tipo, aunque se utiliza con mayor frecuencia en instrumentos de barrido. Cuando los electrones de alta energía interactúan con los átomos, pueden expulsar electrones, particularmente aquellos en las capas internas y los electrones del núcleo . Estos se llenan entonces con electrones de valencia , y la diferencia de energía entre los estados de valencia y del núcleo se puede convertir en rayos X que son detectados por un espectrómetro. Las energías de estos rayos X son algo específicas para la especie atómica, por lo que se puede investigar la química local. [ 55 ]

EELS

Espectro experimental de pérdida de energía de electrones, que muestra las características principales: pico de pérdida cero, picos de plasmones y borde de pérdida del núcleo.

De forma similar al microanálisis de rayos X, las energías de los electrones que se han transmitido a través de una muestra pueden analizarse y proporcionar información que abarca desde detalles de la estructura electrónica local hasta información química. [ 64 ]

Difracción de electrones

Los microscopios electrónicos de transmisión se pueden utilizar en modo de difracción de electrones, donde se produce un mapa de los ángulos de los electrones que salen de la muestra. Las ventajas de la difracción de electrones sobre la cristalografía de rayos X radican principalmente en el tamaño de los cristales. En la cristalografía de rayos X, los cristales suelen ser visibles a simple vista y generalmente tienen cientos de micrómetros de longitud. En comparación, los cristales para la difracción de electrones deben tener menos de unos pocos cientos de nanómetros de espesor y no tienen un límite inferior de tamaño. Además, la difracción de electrones se realiza en un TEM, que también se puede utilizar para obtener otros tipos de información, en lugar de requerir un instrumento aparte. [ 65 ] [ 40 ]

Variaciones en CBED con el espesor para Si (001)

Existen muchas variantes de la difracción de electrones, dependiendo del tipo exacto de condiciones de iluminación que se utilicen. Si se utiliza un haz paralelo con una apertura para limitar la región expuesta a los electrones, normalmente se observan características de difracción nítidas, una técnica denominada difracción de electrones de área seleccionada . [ 32 ] Esta suele ser la técnica principal utilizada. Otro enfoque común utiliza iluminación cónica y se denomina difracción de electrones de haz convergente (CBED). Esta es útil para determinar la simetría de los materiales. Una tercera es la difracción de electrones por precesión , donde un haz paralelo gira alrededor de un ángulo grande, produciendo un tipo de patrón de difracción promedio. [ 66 ] Estos suelen tener menos dispersión múltiple. [ 67 ]

Otras técnicas de microscopía electrónica

Preparación de la muestra

Un insecto recubierto de oro para su observación con un microscopio electrónico de barrido (MEB).

Las muestras para microscopios electrónicos generalmente no se pueden observar directamente. Es necesario prepararlas para estabilizarlas y mejorar el contraste. Las técnicas de preparación varían considerablemente según la muestra, sus características específicas y el microscopio utilizado. Encontrará más detalles en los artículos principales mencionados anteriormente.

Desventajas

Microscopio electrónico de transmisión y barrido JEOL fabricado a mediados de la década de 1970.

Los microscopios electrónicos son costosos de construir y mantener. Los microscopios diseñados para lograr altas resoluciones deben estar ubicados en edificios estables (a veces subterráneos) con servicios especiales como sistemas de cancelación de campos magnéticos y soportes antivibración. [ 68 ]

Las muestras deben observarse principalmente en vacío , ya que las moléculas que componen el aire dispersarían los electrones. Una excepción es la microscopía electrónica en fase líquida [ 69 ], que utiliza una celda líquida cerrada o una cámara ambiental, por ejemplo, en el microscopio electrónico de barrido ambiental , que permite observar muestras hidratadas en un entorno húmedo de baja presión (hasta 20 Torr o 2,7 kPa ). También se han desarrollado diversas técnicas para la microscopía electrónica in situ de muestras gaseosas. [ 70 ]  

Virión pleolipoviral (HRPV-6) [ 71 ]

Las muestras de materiales hidratados, incluyendo casi todos los especímenes biológicos, deben prepararse de diversas maneras para estabilizarlas, reducir su grosor (corte ultrafino) y aumentar su contraste óptico electrónico (tinción). Estos procesos pueden generar artefactos , pero estos generalmente se pueden identificar comparando los resultados obtenidos con métodos de preparación de muestras radicalmente diferentes. Desde la década de 1980, el análisis de especímenes criofijados y vitrificados también se ha vuelto cada vez más común. [ 72 ] [ 73 ] [ 74 ]

Muchas muestras sufren daños por radiación que pueden alterar sus estructuras internas. Esto puede deberse a procesos radiolíticos o balísticos, o a ambos, por ejemplo, mediante cascadas de colisión . [ 75 ] Esto puede ser un problema grave para las muestras biológicas. [ 76 ] [ 77 ]

Véase también

Referencias

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