Prueba de detección (liquen)

En liquenología, la prueba de la gota es un análisis puntual que se utiliza para identificar líquenes . Consiste en colocar una gota de un reactivo químico en diferentes partes del liquen y observar el cambio de color (o la ausencia del mismo) asociado a la aplicación del reactivo. Estas pruebas se encuentran habitualmente en las claves dicotómicas para la identificación de especies de líquenes y aprovechan la amplia gama de productos ( metabolitos secundarios ) que producen los líquenes y su singularidad entre los distintos taxones . De este modo, las pruebas de la gota revelan la presencia o ausencia de sustancias químicas en diversas partes de un liquen. Fueron propuestas por primera vez como método para ayudar a identificar especies por el liquenólogo finlandés William Nylander en 1866. ^{[ 1 ]}

Tres pruebas de color comunes utilizan una solución acuosa de KOH al 10 % (prueba K), una solución acuosa saturada de polvo blanqueador o hipoclorito de calcio (prueba C) o una solución alcohólica de p -fenilendiamina al 5 % (prueba P). Los cambios de color se producen debido a la presencia de metabolitos secundarios específicos en el liquen. En la literatura de referencia clave para la identificación, el resultado de las pruebas químicas de color sirve como característica principal para determinar la especie de liquen. Existen otras pruebas de color menos frecuentes y de utilidad más limitada que se emplean en situaciones específicas, como para distinguir entre ciertas especies. Las variaciones de la técnica, que incluyen el uso de papel de filtro para mejorar la visibilidad de las reacciones o el examen bajo un microscopio , se adaptan a diferentes tipos de líquenes y pigmentaciones, y los resultados se resumen generalmente mediante un código corto que indica la sustancia y la reacción observada. Otros métodos de diagnóstico, como la exposición a la luz ultravioleta (UV), pueden ayudar a identificar los metabolitos del liquen y a distinguir entre especies, ya que algunas sustancias fluorescen bajo la luz UV, lo que facilita la diferenciación de especies estrechamente relacionadas.

Las pruebas de cuatro puntos son las que se utilizan con mayor frecuencia para ayudar en la identificación de líquenes. ^{[ 3 ]}

prueba PD

Esto también se conoce como la prueba P. Utiliza una solución etanólica de para -fenilendiamina (PD) al 1-5%, hecha colocando una gota de etanol (70-95%) sobre unos pocos cristales del compuesto químico; esto produce una solución inestable y fotosensible que dura aproximadamente un día. ^{[ 11 ]} Una forma alternativa de esta solución, llamada solución de Steiner, es mucho más duradera, aunque produce reacciones de color menos intensas. Normalmente se prepara disolviendo 1 gramo de PD, 10 gramos de sulfito de sodio y 0,5 mililitros de detergente en 100 mililitros de agua; inicialmente de color rosa, la solución se vuelve púrpura con el tiempo. La solución de Steiner dura meses. ^{[ 5 ]} La fenilendiamina reacciona con aldehídos para producir bases de Schiff según la siguiente reacción: ^{[ 9 ]}

R-CHO + H ₂ N-C ₆ H ₄ -NH ₂ → R-CH=N-C ₆ H ₄ -NH ₂ + H ₂ O

Los productos de esta reacción son de color amarillo a rojo. La mayoría de las depsidonas de β-orcinol y algunos depsidos de β-orcinol reaccionarán positivamente. ^{[ 11 ]} La prueba PD, conocida por su alta especificidad hacia sustancias que producen reacciones amarillas o rojas K+, ha reemplazado en gran medida la prueba K, más simple pero menos concluyente. ^{[ 12 ]} El PD es venenoso tanto en polvo como en solución, y las superficies que entran en contacto con él (incluida la piel) se decoloran. ^{[ 13 ]}

Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos liquénicos con una reacción positiva al fósforo incluyen Parmelia subrudecta , que es PD+ (amarillo) debido a la didepside atranorina, e Hypogymnia physodes , que es PD+ (naranja) debido al ácido fisodálico depsidona. ^{[ 14 ]}

Las pruebas puntuales se realizan colocando una pequeña cantidad del reactivo deseado en la porción del liquen que se va a analizar. A menudo, se analizan tanto la corteza como la médula del liquen, y a veces es útil analizar otras estructuras como los soralia . Un método consiste en aspirar una pequeña cantidad del producto químico en un capilar de vidrio y tocar el talo del liquen; también se utiliza un pincel pequeño para este fin. Las reacciones se visualizan mejor con una lupa o un microscopio estereoscópico . ^{[ 8 ]} Se puede utilizar una cuchilla de afeitar para retirar la corteza y acceder a la médula. Alternativamente, la solución se puede aplicar a las estructuras del liquen que carecen de corteza o que dejan la médula expuesta, como los soralia, las pseudocifelas o la parte inferior de las escamas. ^{[ 20 ]}

En una variante de esta técnica, sugerida por el químico sueco Johan Santesson, ^{[ 21 ]} se utiliza un trozo de papel de filtro para intentar que la reacción de color sea más fácilmente observable. El fragmento de liquen se presiona sobre el papel y las sustancias del liquen se extraen con 10-20 gotas de acetona. Tras la evaporación de la acetona, las sustancias del liquen quedan en el papel formando un anillo alrededor del fragmento. A continuación, se puede realizar una prueba puntual en el papel de filtro de la forma habitual. ^{[ 22 ]} En los casos en que los resultados de una prueba puntual en el talo sean inciertos, es posible aplastar una sección fina del tejido en un portaobjetos con una cantidad mínima de agua y reactivo bajo un cubreobjetos. Se observa un cambio de color con un objetivo de microscopio de baja potencia o cuando el portaobjetos se coloca sobre un fondo blanco. ^{[ 8 ]} Esta técnica es útil para analizar líquenes con pigmentos oscuros, como Bryoria . ^{[ 5 ]}

Las pruebas puntuales pueden utilizarse individualmente o en combinación. Los resultados de una prueba puntual se representan normalmente con un código corto que incluye, en orden, (1) una letra que indica el reactivo utilizado, (2) un signo "+" o "−" que indica un cambio de color o la ausencia de cambio de color, respectivamente, y (3) una letra o palabra que indica el color observado. Además, debe tenerse cuidado de indicar qué parte del liquen se analizó. Por ejemplo, "Cortex K+ orange, C−, P−" significa que la corteza de la muestra analizada se tornó naranja con la aplicación de KOH y no cambió con lejía o para -fenilendiamina. Del mismo modo, "Medulla K−, KC+R" indicaría que la médula del liquen fue insensible a la aplicación de KOH, pero la aplicación de KOH seguida inmediatamente de lejía provocó que la médula se tornara roja. ^{[ 12 ]}

En ocasiones, la reacción de color tarda un tiempo en desarrollarse. Por ejemplo, en ciertas especies de Cladonia , la reacción PD con ácido fumarprotocetrárico puede tardar hasta medio minuto. ^{[ 13 ]} En cambio, las reacciones con C y KC suelen ser fugaces y ocurren en un segundo tras la aplicación del reactivo, por lo que un cambio de color puede pasar desapercibido fácilmente. Existen varias razones posibles por las que no se produce un resultado de prueba esperado. Entre las causas se incluyen reactivos viejos y químicamente inactivos, y bajas concentraciones de sustancias liquénicas en la muestra. Si el color del talo es oscuro, un cambio de color podría quedar enmascarado, y otras técnicas serían más apropiadas, como la técnica del papel de filtro. ^{[ 8 ]}

En ocasiones, puede ser útil realizar otras medidas diagnósticas además de las pruebas puntuales. Por ejemplo, algunos metabolitos de líquenes fluorescen bajo radiación ultravioleta, de modo que exponer ciertas partes del liquen a una fuente de luz UV puede revelar la presencia o ausencia de esos metabolitos de forma similar a las pruebas puntuales. Ejemplos de sustancias de líquenes que producen una fluorescencia brillante en UV son los ácidos alectorónico, lobárico y divaricatico , y la lichexantona . En algunos casos, la prueba de luz UV puede utilizarse para ayudar a distinguir entre especies estrechamente relacionadas, como Cladonia deformis (UV−) y Cladonia sulphurina (UV+, debido a la presencia de ácido escamoso ). ^{[ 20 ]} Solo la luz UV de longitud de onda larga es útil para observar los líquenes directamente. ^{[ 5 ]}

Las técnicas analíticas más avanzadas, como la cromatografía de capa fina , la cromatografía líquida de alta resolución y la espectrometría de masas , también pueden ser útiles para caracterizar inicialmente la composición química de los líquenes o cuando las pruebas puntuales no son concluyentes. ^{[ 24 ]}

Se considera que el liquenólogo finlandés William Nylander fue el primero en demostrar el uso de productos químicos para ayudar en la identificación de líquenes. ^{[ 25 ]} En artículos publicados en 1866, sugirió pruebas puntuales utilizando KOH y polvo blanqueador para obtener reacciones de color características, típicamente amarillas, rojas o verdes. ^{[ 1 ] [ 26 ] [ 27 ]} En estos estudios demostró, por ejemplo, que los líquenes ahora conocidos como Cetrelia cetrarioides y C.  olivetorum podían distinguirse como especies distintas debido a sus diferentes reacciones de color: C+ rojo en el segundo, en contraste con la ausencia de reacción en el primero. Nylander demostró cómo se podía usar KOH para distinguir entre las especies parecidas Xanthoria candelaria y Candelaria concolor porque la presencia de parietina en la primera especie produce una fuerte reacción de color. También sabía que, en algunos casos, los productos químicos del liquen no estaban distribuidos uniformemente en la corteza y la médula debido a las diferentes reacciones de color en estas áreas. ^{[ 25 ]} A mediados de la década de 1930, Yasuhiko Asahina creó la prueba con para -fenilendiamina, que produce reacciones de color amarillo a rojo con metabolitos secundarios que tienen un grupo aldehído libre. ^{[ 28 ] [ 29 ]} Posteriormente se demostró que esta prueba puntual era particularmente útil en la taxonomía de la familia Cladoniaceae . ^{[ 30 ] [ 25 ]}

• Microcristalización