Lysine malonylation

Lysine malonylation (Kmal, maK), protein malonylation or malonylation, is a reversiblepost-translational modification (PTM) in eukaryotic and prokaryotic cells, in which a malonyl group (–CO–CH2–COOH) is added to a lysine (K) residue of a protein.^[1][2][3] It was first identified in 2011 by Peng et al. as an evolutionarily conserved modification and belongs to the acidic acyl modifications such as succinylation and glutarylation.^[4][5] As a dynamically regulated modification, it responds to conditions such as stress responses, metabolic processes, and mutations, thereby influencing the charge, structure, and function of proteins.^[3][6] This involves, among other things, the metabolic pathways of glucose and fatty acids as well as histone-mediated gene regulation, and is increasingly associated with immune regulation, angiogenesis, osteoarthritis, cancer and metabolic diseases such as obesity and type 2 diabetes.^[7][8] Its biological significance is increasingly recognized, but many aspects of its regulation and function remain unresolved, so that its therapeutic potential is still unexplored.^[7]

At physiological pH, the ε-amino group (–NH₂) of the lysine residue exists almost entirely in its protonated form (–NH₃⁺), whereas the carboxyl group (–COOH) of the malonyl group exists almost entirely in its deprotonated form (–COO^-).^[5] Through the covalent attachment of a malonyl group to the ε-amino group, the lysine residue loses its positive charge and assumes the negative charge of the malonyl group, resulting in a charge shift from +1 to −1.^[9][1][5] This complete reversal of charge is thought to disrupt ionic interactions both within the protein itself and with negatively charged components of nucleotides, proteins and small molecules.^[5] Such alterations can occur at multiple lysine residues within a single protein, although their overall frequency varies considerably across the proteome.^[10] In mouse liver, for example, about half of all malonylated proteins contain a single site, while the frequency decreases sharply beyond four sites and only a few are extensively modified, the most heavily modified enzyme being carbamoyl‑phosphate synthetase 1 (CPS1) of the urea cycle with 31 sites.^[10]

In the context of other lysine acylations, malonylation can be positioned as follows:

While acetylation neutralizes lysine's positive charge, malonylation introduces a negative one, placing it among the acidic acylations alongside methylmalonylation, succinylation, glutarylation, 3‑hydroxy‑3‑methylglutarylation, 3‑methylglutaconylation, and 3‑methylglutarylation.^[5][11][12] In size, malonylation (three carbons) is bulkier than acetylation (two) but smaller than succinylation (four) and glutarylation (five).^[5] As a result, such acidic acyl modifications, as discussed for malonylation and succinylation, are expected to exert a greater impact than acetylation at the same lysine site.^[10]

Cada modificación surge del derivado de acil-CoA correspondiente. ^{[ 13 ] [ 4 ] [ 12 ] [ 14 ]} El malonil-CoA se produce en el citosol y las mitocondrias por la acetil-CoA carboxilasa (ACC) y, en las mitocondrias, también por el miembro 3 de la familia de la acil-CoA sintetasa (ACSF3); ^{[ 15 ]} el succinil-CoA proviene del ciclo de TCA y del catabolismo de aminoácidos ; ^{[ 1 ] [ 4 ]} el glutaril-CoA del catabolismo de aminoácidos; ^{[ 1 ]} y el metilmalonil-CoA del metabolismo de aminoácidos y ácidos grasos de cadena impar , que se acumula en la deficiencia de vitamina B12 y en las acidemias metilmalónicas . ^{[ 12 ]} El malonil-CoA es mucho menos reactivo hacia las proteínas que el succinil-CoA o el glutaril-CoA porque, al igual que el acetil-CoA, su cadena de carbono más corta no puede soportar la catálisis intramolecular necesaria para formar un intermedio de anhídrido cíclico reactivo , lo que a su vez permite la modificación en un rango de pH más amplio. ^{[ 16 ]} Los grupos malonilo, succinilo y glutarilo son eliminados por la sirtuína 5 (SIRT5), que muestra poca actividad hacia la acetilación. ^{[ 5 ]}

La malonilación ocurre principalmente en las mitocondrias, pero también en el citosol y el núcleo . ^{[ 17 ]} En el hígado de ratón, alrededor del 60% de las proteínas maloniladas son mitocondriales, mientras que en los fibroblastos humanos la distribución es más uniforme. ^{[ 17 ]} La succinilación y la glutarilación también se enriquecen en las mitocondrias, pero no son exclusivas de ellas. ^{[ 5 ]} La abundancia relativa de estas modificaciones refleja la disponibilidad de acil-CoA: la acetilación es la más común, la succinilación alcanza el 10-30  % de los niveles de acetilación, la malonilación es al menos diez veces menos frecuente y la glutarilación ocurre solo en cantidades traza. ^{[ 11 ]} Además de sus diferentes frecuencias, la malonilación, la succinilación y la acetilación también pueden dirigirse al mismo sitio de lisina. ^{[ 10 ]} En las mitocondrias del hígado de ratón, aproximadamente el 85  % de los sitios de succinilación se superponen con al menos una de estas modificaciones, y ~6  % pueden contener las tres, principalmente en proteínas involucradas en la oxidación de ácidos grasos, la degradación de glutaril-CoA y la cetogénesis. ^{[ 10 ]} Por el contrario, solo el 55  % de los sitios de malonilación se superponen con la succinilación, mientras que aproximadamente el 45  % son únicos. ^{[ 10 ]} Estos patrones distintos sugieren una función reguladora específica para la malonilación entre las modificaciones de acilo de lisina. ^{[ 10 ]}

El malonil-CoA, donante para la malonilación de la lisina, no puede atravesar las membranas y debe sintetizarse localmente en cada compartimento celular . ^{[ 20 ]}

• En el citosol , la acetil-CoA carboxilasa (ACC) genera malonil-CoA a partir de acetil-CoA y CO₂ _y es responsable de la mayor parte del reservorio celular de malonil-CoA. ^{[ 21 ]} La cantidad de malonil-CoA en el citosol está estrictamente regulada por las actividades opuestas de la ACC y la malonil-CoA descarboxilasa (MCD), que cataliza la reacción inversa para producir acetil-CoA y CO₂ _. [ ^{17 ] El} malonil-CoA citosólico desempeña un papel clave en la regulación del metabolismo de los ácidos grasos. ^{[ 21 ]} Aunque el malonil-CoA en sí mismo no puede entrar en las mitocondrias, el malonato producido a través de la hidrólisis no enzimática del malonil-CoA citosólico puede atravesar las membranas y contribuir al reservorio mitocondrial de malonil-CoA. ^{[ 21 ]}
• En las mitocondrias , el pool de malonil-CoA es generado por el miembro 3 de la familia de la acil-CoA sintetasa (ACSF3), que cataliza la tioesterificación del malonato y la CoA, y por una isoforma mitocondrial de la acetil-CoA carboxilasa 1 (mtACC1), que produce malonil-CoA a través de la carboxilación de acetil-CoA y CO₂ _. [ ^{15 ] Complementando} estas actividades sintéticas, la MCD también opera en las mitocondrias, donde convierte el malonil-CoA de nuevo en acetil-CoA y CO₂ _. [ ^{20 ] El} malonil-CoA mitocondrial es esencial para la malonilación local de proteínas, así como para la síntesis mitocondrial de ácidos grasos (mtFAS). ^{[ 20 ] [ 15 ]}
• En el núcleo , la malonil-CoA es sintetizada por la ACC1, que es principalmente citoplasmática, lo que sugiere una función local y posiblemente no convencional. ^{[ 1 ]}

El grado de malonilación aumenta con la disponibilidad de malonil-CoA, particularmente en condiciones como estrés metabólico o deficiencias enzimáticas , por ejemplo, deficiencia de malonil-CoA descarboxilasa . ^{[ 17 ] [ 22 ]}

La malonilación no enzimática ocurre espontáneamente a través de la transferencia directa de un grupo malonilo de malonil-CoA al grupo ε-amino (–NH₂ ₎ de un residuo de lisina desprotonado, sin la participación de enzimas . ^{[ 9 ]} Solo el residuo de lisina desprotonado puede reaccionar de esta manera porque su grupo ε-amino lleva un par de electrones libres que pueden atacar el carbono carbonilo del tioéster de malonil-CoA altamente reactivo, cuyo grupo carboxilo atractor de electrones aumenta aún más su reactividad. ^{[ 9 ]} Sin embargo, dado que el residuo de lisina tiene un pKₐ _de aproximadamente 10,5, existe casi completamente en su forma protonada a pH fisiológico (~7,4), con menos del 0,1% desprotonado según lo calculado a partir de la ecuación de Henderson-Hasselbalch . Los microambientes proteicos locales, como cerca de residuos con carga negativa o dentro de bolsillos hidrofóbicos , pueden permitir adicionalmente la desprotonación de la lisina, mientras que condiciones más amplias, como el pH más alcalino (~8,0) de la matriz mitocondrial, aumentan la fracción de residuos de lisina desprotonados a aproximadamente 0,3%, ^{[ nota 1 ]} favoreciendo así la malonilación no enzimática. ^{[ 9 ] [ 1 ]} En compartimentos con pH casi neutro (~7,2), como el citosol o el núcleo, los residuos de lisina están, por lo tanto, casi completamente protonados y dependen más de la malonilación enzimática allí, lo que sugiere que ambos mecanismos contribuyen al patrón general de malonilación en las células. ^{[ 1 ]}

En la malonilación enzimática, los residuos de lisina protonados (–NH ₃ ⁺ ), que es la forma en la que existen casi todos (≈ 99,9%) ^{[ nota 1 ]} a pH fisiológico (~7,4), también pueden modificarse. ^{[ 1 ] [ 23 ]} Las similitudes estructurales entre acetil-CoA y malonil-CoA sugieren que ciertas lisina acetiltransferasas (KAT) también pueden catalizar la malonilación. ^{[ 5 ]} KAT2A (GCN5) se ha vinculado experimentalmente a la malonilación de histonas y actualmente es el candidato más fuerte, mientras que p300 también se ha propuesto y se sabe que media otras modificaciones de acilo como la crotonilación . ^{[ 1 ] [ 3 ]} De forma análoga al mecanismo de acetilación de GCN5, se cree que el grupo ε-amino se desprotona transitoriamente por una base catalítica dentro del sitio activo de la enzima , lo que permite la misma reacción con malonil-CoA que en la malonilación no enzimática. ^{[ 23 ] [ 1 ]} Sin embargo, aún no se han identificado de forma definitiva enzimas específicas conocidas como maloniltransferasas . ^{[ 1 ]}

La desmalonilación es catalizada por la enzima Sirtuina 5 (SIRT5), una histona deacetilasa de clase III que requiere NAD ⁺ para su actividad pero es inhibida por la nicotinamida . ^{[ 4 ]} SIRT5 se expresa globalmente en los compartimentos mitocondrial, citoplasmático y nuclear, y también puede eliminar otras modificaciones acilo con carga negativa. ^{[ 5 ] [ 12 ]} Cataliza la desmalonilación en la siguiente reacción: ^{[ 5 ]}

El perfil proteómico del hígado de ratón reveló que SIRT5 regula aproximadamente el 16% de todos los sitios de malonil-lisina identificados, la mayoría de los cuales contienen solo un único residuo de lisina malonilada. ^{[ 10 ]} Las proteínas reguladas de esta manera participan principalmente en la glucólisis , la gluconeogénesis , la oxidación de ácidos grasos y el ciclo de la urea . ^{[ 10 ]} La reducción moderada en la malonilación observada tras la inactivación de SIRT5 sugiere, a su vez, la presencia de demalonilasas adicionales no identificadas . ^{[ 2 ]} También se ha propuesto que las demalonilasas y las desacetilasas funcionan menos como enzimas reguladoras dedicadas y más como parte de un mecanismo de control de calidad de proteínas. ^{[ 21 ]}

El análisis proteómico reveló que las proteínas maloniladas estaban enriquecidas en vías relacionadas con el metabolismo de la glucosa y los ácidos grasos , así como en el ciclo de la urea, que involucra enzimas tanto mitocondriales como citosólicas. ^{[ 2 ] [ 10 ]} También se detectó malonilación en proteínas nucleares como la histona H2B . ^{[ 1 ]}

A continuación se presenta una lista de proteínas seleccionadas que han sido verificadas experimentalmente para sufrir malonilación:

• Acetil-CoA carboxilasa 1 (ACC1) ^{[ 24 ]}
• Carbamoil fosfato sintetasa 1 (CPS1) ^{[ 10 ] [ 25 ]}
• Carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) ^{[ 17 ]}
• Enolasa 1 (ENO1) ^{[ 4 ]}
• Formiltetrahidrofolato deshidrogenasa, 10- (ALDH1L1) ^{[ 25 ]}
• Fructosa bifosfato aldolasa B (ALDOB) ^{[ 2 ]}
• Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) ^{[ 3 ]}
• Histona H2B ^{[ 1 ]}
• Deshidrogenasa de 3-hidroxiacil-CoA de cadena larga (LCHAD) ^{[ 17 ]}
• deshidrogenasa de acil-CoA de cadena muy larga (VLCAD) ^{[ 17 ]}

En el trastorno metabólico de aciduria malónica y metilmalónica combinada (CMAMMA), la enzima mitocondrial ACSF3 está defectuosa, la cual contribuye al reservorio mitocondrial de malonil-CoA mediante la conversión de malonato . ^{[ 15 ]} La disponibilidad reducida del donante malonil-CoA conduce a una disminución de la malonilación de lisina mitocondrial. ^{[ 20 ]} En modelos de ratón, se ha demostrado que esta hipomalonilación altera vías metabólicas clave como la glucólisis, la gluconeogénesis, la oxidación de ácidos grasos y el metabolismo del NADPH , lo que en última instancia perjudica el equilibrio energético. ^{[ 25 ]}

En el trastorno metabólico aciduria malónica , la enzima malonil-CoA descarboxilasa (MCD) es defectuosa, necesaria para la conversión de malonil-CoA a acetil-CoA. ^{[ 26 ]} Esto conduce a la acumulación de malonil-CoA y a un marcado aumento de la malonilación de lisina. ^{[ 17 ]} Los análisis proteómicos y funcionales han demostrado que esta hipermalonilación perjudica la respiración mitocondrial y reduce la capacidad de oxidación de ácidos grasos, lo que sugiere un papel directo de la malonilación de proteínas en la disfunción metabólica de la enfermedad. ^{[ 17 ]} Las similitudes clínicas entre los defectos de MCD y ACSF3 sugieren su implicación en una vía común. ^{[ 20 ]}

La malonilación también ocurre en proteínas nucleares, incluidas las histonas , donde regula procesos asociados a la cromatina . ^{[ 1 ]} Se ha demostrado que la malonilación de histonas aumenta la expresión del ARN ribosómico (ARNr) y el tamaño del nucléolo, características ambas asociadas al envejecimiento celular . ^{[ 1 ]} Los tejidos de ratones envejecidos exhiben un aumento global de la malonilación, posiblemente debido a la elevada expresión de la acetil-CoA carboxilasa y a la actividad reducida de la deacilasa SIRT5, que depende de la disminución de los niveles de NAD ⁺ . ^{[ 1 ]} Estos hallazgos sugieren un papel para la malonilación de histonas en la regulación epigenética de los procesos de envejecimiento . ^{[ 1 ]}

En la diabetes tipo 2 , la malonilación de lisina está significativamente elevada en el tejido hepático, como se muestra en modelos de ratones obesos como los ratones db/db y ob/ob. ^{[ 2 ]} Muchas de las proteínas afectadas están involucradas en el metabolismo de la glucosa y los lípidos , y se ha demostrado que la malonilación de las enzimas glucolíticas suprime su actividad, lo que conduce a una reducción del flujo glucolítico . ^{[ 2 ] [ 10 ]} Seis de las diez enzimas glucolíticas están maloniladas en sitios regulados por la demalonilasa SIRT5, que contrarresta esta inhibición y puede servir como objetivo terapéutico, junto con otras enzimas aún no identificadas que regulan la malonilación. ^{[ 10 ] [ 2 ]}

En la osteoartritis , la expresión de SIRT5 disminuye en el cartílago durante el envejecimiento, mientras que la malonilación de lisina aumenta. ^{[ 27 ]} En ratones, la combinación de deficiencia de Sirt5 y obesidad inducida por una dieta rica en grasas exacerba la degeneración articular , acompañada de hipermalonilación generalizada de enzimas glucolíticas y alteración del metabolismo de los condrocitos . ^{[ 27 ]} Una rara mutación de sentido erróneo en SIRT5 humana (F101L) encontrada en la osteoartritis familiar confirma aún más un vínculo directo entre la hipermalonilación y la osteoartritis. ^{[ 27 ]}

En los macrófagos en reposo , la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se une a los ARNm inflamatorios como el TNFα y suprime su traducción. ^{[ 3 ]} En los macrófagos activados, la malonilación de lisina funciona como una señal reguladora durante las respuestas inflamatorias . ^{[ 3 ]} La estimulación inflamatoria con lipopolisacárido (LPS) aumenta los niveles citosólicos de malonil-CoA y conduce a la malonilación de GAPDH en la lisina 213. ^{[ 3 ]} La malonilación interrumpe esta unión, promoviendo así la traducción de citocinas proinflamatorias como el TNFα. ^{[ 3 ]} Estos hallazgos establecen la malonilación de lisina como un vínculo entre el metabolismo celular y la activación inmunitaria. ^{[ 3 ]}

La inhibición de la sintasa de ácidos grasos (FASN) aumenta los niveles de malonil-CoA en las células endoteliales , lo que conduce a la malonilación de la lisina de mTOR en la lisina 1218. ^{[ 28 ]} Esto perjudica la actividad quinasa del complejo mTOR 1 , lo que reduce la proliferación endotelial y, en última instancia, conduce a una angiogénesis deficiente . ^{[ 28 ]} El efecto se observó tanto en el desarrollo vascular normal como en la angiogénesis relacionada con enfermedades, como la neovascularización retiniana en un modelo de ratón de retinopatía del prematuro (ROP). ^{[ 28 ]} Estos hallazgos vinculan la malonilación con la regulación angiogénica a través de la señalización de mTOR. ^{[ 28 ]}

La malonillisina es químicamente inestable y puede descarboxilarse a acetillisina al calentarse, lo que complica su análisis y puede llevar a una identificación errónea. ^{[ 29 ]} En espectrometría de masas en tándem , esta reacción se asocia con una pérdida característica de 44 Da correspondiente a la liberación de CO _2. ^{[ 4 ]} Para superar esto, se desarrolló un isóstero estable de malonillisina basado en tetrazol que resiste dicha descomposición . ^{[ 29 ]} Es compatible con la síntesis de péptidos y muestra un reconocimiento reducido pero detectable por anticuerpos específicos de malonilo y SIRT5, lo que permite estudios de malonilación sin artefactos de descarboxilación . ^{[ 29 ]}

• Sirtuina