Conducto de guía nerviosa

En el traumatismo craneoencefálico (TCE), se inicia una serie de eventos dañinos que conducen a la muerte celular y a una disfunción general, lo que provoca la formación de una cavidad de lesión de forma irregular. ^{[ 8 ]} La cavidad resultante causa muchos problemas para los andamios de ingeniería tisular, ya que se requiere una implantación invasiva y, a menudo, el andamio no se adapta a la forma de la cavidad. Para superar estas dificultades, se han diseñado hidrogeles termosensibles que experimentan transiciones de solución-gelificación (sol-gel), causadas por las diferencias entre la temperatura ambiente y la fisiológica, para facilitar la implantación mediante la gelificación in situ y la adaptación a la forma de la cavidad, lo que permite inyectarlos de forma mínimamente invasiva. ^{[ 8 ]}

La metilcelulosa (MC) es un material con transiciones sol-gel bien definidas en el rango óptimo de temperaturas. La gelificación de la MC ocurre debido a un aumento en las interacciones hidrofóbicas intra e intermoleculares a medida que aumenta la temperatura. ^{[ 8 ]} La transición sol-gel está regida por la temperatura crítica de solución inferior (LCST), que es la temperatura a la cual el módulo elástico es igual al módulo viscoso. La LCST no debe exceder la temperatura fisiológica (37  °C) para que el andamio se gelifique al implantarse, lo que permite una administración mínimamente invasiva. Tras la implantación en una cavidad de lesión por traumatismo craneoencefálico (TCE) o en un conducto de guía de nervio periférico, la MC provoca una respuesta inflamatoria mínima. ^{[ 8 ]} También es muy importante para la administración mínimamente invasiva que la solución de MC tenga una viscosidad a temperaturas inferiores a su LCST, lo que permite inyectarla a través de una aguja de pequeño calibre para su implantación en aplicaciones in vivo . ^{[ 8 ]} La MC se ha utilizado con éxito como agente de administración para terapias farmacéuticas intraópticas y orales. ^{[ 8 ]} Algunas desventajas de la MC incluyen su limitada propensión a la adsorción de proteínas y la adhesión celular neuronal, lo que la convierte en un hidrogel no bioactivo. Debido a estas desventajas, el uso de MC en la regeneración de tejido neural requiere la incorporación de un grupo biológicamente activo a la cadena principal del polímero para mejorar la adhesión celular.

Otro gel termosensible se forma combinando quitosano con sal de glicerofosfato (GP). ^{[ 9 ]} Esta solución experimenta gelificación a temperaturas superiores a 37  °C. La gelificación del quitosano/GP es bastante lenta, tardando media hora en solidificarse inicialmente y 9 horas más en estabilizarse por completo. La resistencia del gel varía de 67 a 1572 Pa dependiendo de la concentración de quitosano; el extremo inferior de este rango se aproxima a la rigidez del tejido cerebral. El quitosano/GP ha demostrado éxito in vitro , pero se necesita la adición de polilisina para mejorar la adhesión de las células nerviosas. La polilisina se unió covalentemente al quitosano para evitar su difusión. Se seleccionó la polilisina por su naturaleza positiva y alta hidrofilicidad, que promueve el crecimiento de las neuritas . La supervivencia neuronal se duplicó, aunque el crecimiento de las neuritas no cambió con la adición de polilisina. ^{[ 9 ]}

Los canales orientados longitudinalmente son estructuras macroscópicas que se pueden agregar a un conducto para proporcionar a los axones en regeneración una guía bien definida para crecer en línea recta a lo largo del andamio. En un andamio con arquitectura de canales microtubulares , los axones en regeneración pueden extenderse a través de canales longitudinales abiertos como lo harían normalmente a través de los tubos endoneurales de los nervios periféricos. ^{[ 10 ]} Además, los canales aumentan el área de superficie disponible para el contacto celular. Los canales generalmente se crean insertando una aguja, alambre o una segunda solución de polímero dentro de un andamio de polímero; después de estabilizar la forma del polímero principal, la aguja, el alambre o el segundo polímero se retira para formar los canales. Por lo general, se crean múltiples canales; sin embargo, el andamio puede consistir en un solo canal grande, que es simplemente un tubo hueco.

Wang et al. crearon una técnica de moldeo para formar un conducto de guía nerviosa con una matriz interna multicanal y una pared externa de tubo de quitosano. ^{[ 10 ]} En su estudio de 2006, Wang et al. insertaron agujas de acupuntura a través de un tubo hueco de quitosano, donde se mantienen en su lugar fijando, en ambos extremos, parches creados con CAD. Luego se inyecta una solución de quitosano en el tubo y se solidifica, tras lo cual se retiran las agujas, creando canales orientados longitudinalmente. Posteriormente, se creó un andamio representativo para su caracterización con 21 canales utilizando agujas de acupuntura de 400  μm de diámetro. Tras la investigación bajo el microscopio, se encontró que los canales eran aproximadamente circulares con ligeras irregularidades; todos los canales estaban alineados con el diámetro interno de la pared externa del tubo. Se confirmó mediante imágenes de micro-CT que los canales atravesaban toda la longitud del andamio. Bajo absorción de agua, los diámetros interno y externo del andamio aumentaron, pero los diámetros de los canales no variaron significativamente, lo cual es necesario para mantener la forma del andamio que guía la extensión de las neuritas. La estructura interna proporciona una mayor resistencia a la compresión en comparación con un tubo hueco solo, lo que puede prevenir el colapso del andamio sobre las neuritas en crecimiento. Las células Neuro-2a pudieron crecer en la matriz interna del andamio y se orientaron a lo largo de los canales. Si bien este método solo se ha probado en quitosano, puede adaptarse a otros materiales. ^{[ 10 ]}

El proceso de liofilización y calentamiento de alambre es otro método para crear canales orientados longitudinalmente, desarrollado por Huang et al. (2005). ^{[ 11 ]} Una solución de quitosano y ácido acético se congeló alrededor de alambres de níquel-cobre (Ni-Cu) en una trampa de nitrógeno líquido ; posteriormente, los alambres se calentaron y se retiraron. Se eligieron alambres de Ni-Cu debido a su alto nivel de resistencia. Se utilizaron liofilizadores con control de temperatura para sublimar el ácido acético. No hubo evidencia de fusión o división de los canales. Después de la liofilización, las dimensiones del andamio se redujeron, lo que provocó que los canales fueran un poco más pequeños que el alambre utilizado. Los andamios se neutralizaron a un valor de pH fisiológico utilizando una base, lo que tuvo efectos drásticos en la estructura porosa. ^{[ 11 ]} Las bases más débiles mantuvieron la estructura porosa uniforme, pero las bases más fuertes la hicieron incontrolable. La técnica utilizada aquí se puede modificar ligeramente para adaptarse a otros polímeros y disolventes. ^{[ 11 ]}

Otra forma de crear canales orientados longitudinalmente es crear un conducto a partir de un polímero con fibras orientadas longitudinalmente incrustadas de otro polímero; luego, disolver selectivamente las fibras para formar canales orientados longitudinalmente. Se incrustaron fibras de policaprolactona (PCL) en un andamio de (hidroxietil)metacrilato (HEMA). Se eligió PCL en lugar de poli(ácido láctico) (PLA) y poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), porque es insoluble en HEMA pero soluble en acetona . Esto es importante porque el HEMA se usó como material principal del conducto y la acetona se usó para disolver selectivamente las fibras de polímero. Las fibras de PCL extruidas se insertaron en un tubo de vidrio y se inyectó la solución de HEMA. El número de canales creados fue consistente de un lote a otro y las variaciones en el diámetro de la fibra se pudieron reducir creando un sistema de extrusión de fibra de PCL más controlado. ^{[ 12 ]} Se confirmó que los canales formados eran continuos y homogéneos mediante el examen de las variaciones de porosidad. Este proceso es seguro, reproducible y tiene dimensiones controlables. ^{[ 12 ]} En un estudio similar realizado por Yu y Shoichet (2005), se copolimerizó HEMA con AEMA para crear un gel P(HEMA-co-AMEA). Se incrustaron fibras de policaprolactona (PCL) en el gel y luego se disolvieron selectivamente con acetona mediante sonicación para crear canales. Se encontró que HEMA en mezcla con 1% de AEMA creó los geles más resistentes. ^{[ 13 ]} En comparación con los andamios sin canales, la adición de 82 a 132 canales puede proporcionar un aumento de aproximadamente 6 a 9 veces en el área superficial, lo que puede ser ventajoso para estudios de regeneración que dependen de señales mediadas por contacto. ^{[ 13 ]}

Itoh et al. (2003) desarrollaron un andamio que consistía en un único canal grande orientado longitudinalmente creado utilizando tendones de quitosano de cangrejos. ^{[ 14 ]} Los tendones se recolectaron de cangrejos (Macrocheira kaempferi) y se lavaron repetidamente con una solución de hidróxido de sodio para eliminar las proteínas y desacetilar la quitina del tendón , que posteriormente se conoció como quitosano de tendón. Una barra de acero inoxidable con sección transversal triangular (cada lado de 2,1  mm de longitud) se insertó en un tubo hueco de quitosano de tendón de sección transversal circular (diámetro: 2  mm; longitud: 15  mm). Al comparar los tubos circulares y triangulares, se encontró que los tubos triangulares tenían una resistencia mecánica mejorada, mantenían mejor su forma y aumentaban el área de superficie disponible. ^{[ 14 ]} Si bien este es un método eficaz para crear un solo canal, no proporciona tanta área de superficie para el crecimiento celular como los andamios multicanal.

Newman et al. (2006) insertaron fibras conductoras y no conductoras en un andamio de colágeno-TERP (colágeno reticulado con un terpolímero de poli(N-isopropilacrilamida) (PNiPAAm)). Las fibras se incrustaron envolviéndolas firmemente en un pequeño portaobjetos de vidrio y colocando una solución de colágeno-TERP entre este y otro portaobjetos; los espaciadores entre los portaobjetos establecieron el espesor del gel en 800  μm. Las fibras conductoras eran de fibra de carbono y Kevlar , y las fibras no conductoras eran de nylon-6 y alambre de tungsteno. Las neuritas se extendían en todas direcciones en gruesos haces sobre la fibra de carbono; sin embargo, con las otras tres fibras, las neuritas se extendían en finas conformaciones tipo red. Las neuritas no mostraron crecimiento direccional sobre las fibras de carbono y Kevlar, pero crecieron a lo largo de las fibras de nylon-6 y, en cierta medida, a lo largo del alambre de tungsteno. Los andamios de alambre de tungsteno y fibra de nylon-6 mostraron crecimiento de neuritas dentro del gel cerca de la interfaz fibra-gel, además de crecer a lo largo de la superficie. Todos los geles de fibra, excepto el de Kevlar, mostraron un aumento significativo en la extensión de las neuritas en comparación con los geles sin fibra. No se observaron diferencias en la extensión de las neuritas entre las fibras no conductoras y las conductoras. ^{[ 15 ]}

En su estudio de 2005, Cai et al. añadieron microfilamentos de poli(ácido L-láctico) (PLLA) a tubos huecos de poli(ácido láctico) (PLA) y silicona. Las características de guía de las microfibras se relacionaron inversamente con el diámetro de la fibra, de modo que los diámetros más pequeños promovieron una mejor migración celular orientada longitudinalmente y la regeneración axonal. Las microfibras también promovieron la mielinización durante la reparación del nervio periférico. ^{[ 16 ]}

Se ha demostrado que los tractos axónicos maduros experimentan crecimiento cuando se estiran mecánicamente en la porción central del cilindro axonal. ^{[ 17 ]} Dicho estiramiento mecánico se aplicó mediante un biorreactor de estiramiento y crecimiento axonal personalizado compuesto por cuatro componentes principales: una cámara de expansión axonal diseñada a medida, una mesa de movimiento lineal, un motor paso a paso y un controlador. ^{[ 17 ]} El cultivo de tejido nervioso se coloca dentro de la cámara de expansión con un puerto para el intercambio de gases y un marco de estiramiento extraíble, que puede separar dos grupos de somas (cuerpos celulares neuronales) y así estirar sus axones. ^{[ 17 ]} Se utilizó gel de colágeno para promover el crecimiento de tractos axónicos más grandes que crecieron estirados y que eran visibles a simple vista. Hay dos razones para la mejora del crecimiento debido al recubrimiento de colágeno: 1) el cultivo se volvió hidrofóbico después de que el colágeno se secó, lo que permitió que creciera una concentración más densa de neuronas, y 2) el recubrimiento de colágeno creó un recubrimiento sin obstrucciones a través de los dos sustratos de elongación. ^{[ 17 ]} El examen mediante microscopía electrónica de barrido y TEM no mostró signos de adelgazamiento axonal debido al estiramiento, y el citoesqueleto parecía normal e intacto. Los tractos axónicos cultivados mediante estiramiento se cultivaron en una membrana biocompatible, que podía formarse directamente en una estructura cilíndrica para el trasplante, eliminando la necesidad de transferir los axones a un andamio una vez completado el crecimiento. Los axones cultivados mediante estiramiento pudieron crecer a una velocidad sin precedentes de 1  cm/día después de solo 8 días de aclimatación, lo que es mucho mayor que la  velocidad máxima de crecimiento de 1 mm/día medida para la extensión del cono de crecimiento. La velocidad de 1  mm/día es también la velocidad de transporte promedio para elementos estructurales como los neurofilamentos. ^{[ 17 ]}

La investigación sobre fibras a nanoescala busca imitar el entorno extracelular in vivo para promover el crecimiento direccional y la regeneración. ^{[ 7 ]} Tres métodos distintos para formar andamios nanofibrosos son el autoensamblaje, la separación de fases y la electrohilatura. Sin embargo, existen muchos otros métodos para formar andamios nanofibrosos.

El autoensamblaje de andamios nanofibrosos solo puede ocurrir cuando las fibras mismas están diseñadas para el autoensamblaje. Una forma común de impulsar el autoensamblaje de las fibras del andamio es usar péptidos anfifílicos de modo que en agua la porción hidrofóbica impulse el autoensamblaje. ^{[ 7 ]} La ingeniería cuidadosamente calculada de los péptidos anfifílicos permite un control preciso sobre la matriz autoensamblada. El autoensamblaje puede crear topografías tanto ordenadas como desordenadas. Phillips et al. (2005) desarrollaron y probaron in vitro e in vivo una matriz de colágeno - células de Schwann autoalineada , que permitió la alineación de la extensión de neuritas DRG in vitro . Los geles de colágeno se han utilizado ampliamente como sustratos para el cultivo de tejidos tridimensionales . Las células pueden formar uniones mediadas por integrinas con el colágeno, lo que inicia el ensamblaje del citoesqueleto y la motilidad celular. A medida que las células se mueven a lo largo de las fibras de colágeno generan fuerzas que contraen el gel. Cuando las fibras de colágeno están ancladas en ambos extremos, las fuerzas generadas por las células crean una tensión uniaxial, lo que provoca que las células y las fibras de colágeno se alineen. Las ventajas de esta matriz son su simplicidad y velocidad de preparación. ^{[ 2 ]} La fibronectina plasmática soluble también puede autoensamblarse en fibras insolubles estables cuando se coloca bajo cizallamiento mecánico directo dentro de una solución viscosa. Phillips et al. (2004) investigaron un nuevo método de agregación por cizallamiento que provoca una agregación mejorada. ^{[ 18 ]} El cizallamiento mecánico se creó arrastrando un bolo de 0,2 ml a 3  cm con pinzas; la fibronectina se agrega en fibras insolubles en la interfaz de rápido movimiento en una celda de ultrafiltración. El mecanismo propuesto para esta agregación de fibras es la extensión y elongación de proteínas bajo fuerza de cizallamiento mecánica, lo que conduce al empaquetamiento lateral y la agregación de proteínas de las fibras. Phillips et al. Se demostró que la cizalladura mecánica producida al estirar un gel de fibronectina de alta viscosidad provoca cambios sustanciales en su estructura y que, cuando se aplica mediante extensión uniaxial, un gel de fibronectina viscoso forma agregados fibrosos orientados; además, los agregados fibrosos tienen una solubilidad reducida y pueden soportar diversos tipos de células in vitro. ^{[ 18 ]}

La separación de fases permite crear andamios de fibra submicrométricos tridimensionales sin necesidad de equipos especializados. Los cinco pasos que intervienen en la separación de fases son la disolución del polímero, la separación de fases y la gelificación, la extracción del disolvente del gel, la congelación y la liofilización en agua. ^{[ 7 ]} El producto final es una red continua de fibras. La separación de fases puede modificarse para adaptarse a diversas aplicaciones, y la estructura de los poros puede variarse mediante el uso de diferentes disolventes, lo que puede cambiar todo el proceso de líquido-líquido a sólido-líquido. La porosidad y el diámetro de las fibras también pueden modificarse variando la concentración inicial del polímero; una mayor concentración inicial produce menos poros y fibras de mayor diámetro. Esta técnica puede utilizarse para crear redes de fibras con diámetros que alcanzan los de las fibras de colágeno tipo I. La red fibrosa creada está orientada aleatoriamente y, hasta el momento, no se ha intentado organizar las fibras. La separación de fases es una técnica ampliamente utilizada para crear andamios nanofibrosos altamente porosos con facilidad. ^{[ 7 ]}

La electrohilatura proporciona una plataforma robusta para el desarrollo de conductos sintéticos de guía nerviosa. La electrohilatura puede servir para crear andamios con dimensiones controladas y con química y topografía variables. Además, se pueden encapsular diferentes materiales dentro de las fibras, incluyendo partículas, factores de crecimiento e incluso células. ^{[ 19 ]} La electrohilatura crea fibras cargando eléctricamente una gota de polímero fundido o solución y suspendiéndola de un capilar. Luego, se aplica un campo eléctrico en un extremo del capilar hasta que la carga supera la tensión superficial, creando un chorro de polímero que se alarga y se adelgaza. Este chorro de polímero se descarga como un cono de Taylor, dejando atrás polímeros cargados eléctricamente, que se recogen en una superficie conectada a tierra como el disolvente a medida que este se evapora de los chorros. ^{[ 20 ]} Se han hilado fibras con diámetros que van desde menos de 3  nm hasta más de 1  μm. El proceso se ve afectado por parámetros del sistema tales como el tipo de polímero, el peso molecular del polímero y las propiedades de la solución y por parámetros del proceso tales como la velocidad de flujo, el voltaje, el diámetro del capilar, la distancia entre el colector y el capilar y el movimiento del colector. ^{[ 21 ]} La red fibrosa creada es desordenada y contiene una alta relación superficie-volumen como resultado de una alta porosidad; una gran área de superficie de red es ideal para el crecimiento y el transporte de desechos y nutrientes en la ingeniería de tejido neural. ^{[ 7 ]} Las dos características de los andamios electrohilados que son ventajosas para la ingeniería de tejido neural son la morfología y arquitectura, que imitan fielmente la ECM, y los poros, que tienen el rango correcto de tamaños que permite el intercambio de nutrientes pero previene el crecimiento de tejido cicatricial glial (alrededor de 10  μm). ^{[ 22 ]} Se ha demostrado que los andamios electrohilados aleatorios de PLLA tienen una mayor adhesión celular, lo que puede deberse a una mayor rugosidad de la superficie. ^{[ 22 ]} También se ha demostrado que las esteras de fibras electrohiladas modificadas químicamente influyen en la diferenciación de células madre neurales y aumentan la proliferación celular. ^{[ 20 ]} En la última década, los científicos también han desarrollado numerosos métodos para la producción de andamios de nanofibras alineadas, que sirven para proporcionar señales topográficas adicionales a las células. ^{[ 23 ]} Esto es ventajoso porque los andamios alineados tridimensionales a gran escala no se pueden crear fácilmente utilizando técnicas de fabricación tradicionales. ^{[ 7 ]}En un estudio realizado por Yang et al. (2005), se crearon, caracterizaron y compararon andamios de microfibras y nanofibras de poli(ácido L-láctico) (PLLA) electrohiladas, alineadas y aleatorias. Los diámetros de las fibras fueron directamente proporcionales a la concentración inicial del polímero utilizada para la electrohilatura; el diámetro promedio de las fibras alineadas fue menor que el de las fibras aleatorias bajo condiciones de procesamiento idénticas. Se demostró que las células madre neurales se alargaron paralelamente a las fibras electrohiladas alineadas. ^{[ 21 ]} Las nanofibras alineadas tuvieron una longitud promedio de neurita mayor en comparación con las microfibras alineadas, las microfibras aleatorias y las nanofibras aleatorias. Además, se diferenciaron más células en las nanofibras alineadas que en las microfibras alineadas. ^{[ 21 ]} Por lo tanto, los resultados de este estudio demostraron que las nanofibras alineadas pueden ser más beneficiosas que las fibras o microfibras no alineadas para promover la regeneración nerviosa.

Las señales físicas se forman mediante la creación de una estructura superficial ordenada a nivel de microestructura y/o nanoestructura. Se ha demostrado que las señales físicas a nanoescala modulan la adhesión celular, la migración, la orientación, la inhibición por contacto, la expresión génica y la formación del citoesqueleto. Esto permite dirigir procesos celulares como la proliferación, la diferenciación y la extensión. ^{[ 24 ]} Existen numerosos métodos para la fabricación de topografías a micro y nanoescala, que se pueden dividir en aquellos que crean topografías ordenadas y aquellos que crean topografías desordenadas.

Las topografías ordenadas se definen como patrones organizados y geométricamente precisos. ^{[ 7 ]} Si bien existen muchos métodos para crear topografías ordenadas, suelen ser laboriosos, requieren habilidad y experiencia, y el uso de equipos costosos. ^{[ 7 ]}

La fotolitografía consiste en exponer una fuente de luz a una oblea de silicio recubierta con fotorresina; se coloca una máscara con el patrón deseado entre la fuente de luz y la oblea, permitiendo así que la luz se filtre selectivamente y cree el patrón en la fotorresina . El posterior revelado de la oblea hace que el patrón en la fotorresina se haga visible. La fotolitografía realizada en el ultravioleta cercano se considera a menudo el estándar para fabricar topografías a microescala. ^{[ 7 ]} Sin embargo, debido a que el límite inferior para el tamaño es una función de la longitud de onda, este método no se puede utilizar para crear características a nanoescala. ^{[ 7 ]} En su estudio de 2005, Mahoney et al. crearon matrices organizadas de canales de poliimida (11 μm de altura y 20–60 μm de ancho) creados en un sustrato de vidrio mediante fotolitografía. ^{[ 25 ]} Se utilizó poliimida porque se adhiere bien al vidrio, es químicamente estable en solución acuosa y es biocompatible. Se hipotetiza que los microcanales limitaron el rango de ángulos en los que los elementos del citoesqueleto dentro de los conos de crecimiento de las neuritas podían acumularse, ensamblarse y orientarse. ^{[ 25 ]} Hubo una disminución significativa en el número de neuritas que emergían del soma; sin embargo, la disminución fue menor a medida que aumentaba el rango de ángulos en los que emergían las neuritas. Además, las neuritas eran en promedio dos veces más largas cuando las neuronas se cultivaban en los microcanales en comparación con los controles en una superficie plana; esto podría deberse a una alineación más eficiente de los filamentos. ^{[ 25 ]}

En la litografía por haz de electrones (EBL), una resina fotosensible se expone a un haz de electrones de alta energía. Se puede elegir entre una resina positiva o negativa; sin embargo, con las resinas negativas se puede obtener una menor resolución de las características. ^{[ 26 ]} Los patrones se crean programando el haz de electrones para que siga la trayectoria exacta a lo largo de la superficie del material. La resolución se ve afectada por otros factores, como la dispersión de electrones en la resina y la retrodispersión del sustrato. La EBL puede crear características superficiales individuales del orden de 3 a 5  nm. Si se requieren múltiples características en una gran superficie, como en el caso de la ingeniería de tejidos, la resolución disminuye y las características solo se pueden crear de tan solo 30 a 40  nm, y el revelado de la resina comienza a tener mayor peso en la formación del patrón. ^{[ 26 ]} Para evitar la disolución de la resina, se puede utilizar agitación ultrasónica para superar las fuerzas intermoleculares. Además, el alcohol isopropílico (IPA) ayuda a desarrollar matrices de alta densidad. La EBL puede convertirse en un proceso más rápido y menos costoso al replicar patrones nanométricos en materiales poliméricos; el proceso de replicación se ha demostrado con policaprolactona (PCL) utilizando estampado en caliente y moldeo por solvente . ^{[ 7 ]} En un estudio realizado por Gómez et al. (2007), se demostró que los microcanales de 1 y 2  μm de ancho y 400 y 800  nm de profundidad creados por EBL en PDMS mejoran la formación de axones de células hipocampales en cultivo más que las señales químicas inmovilizadas. ^{[ 26 ]}

La litografía de rayos X es otro método para formar patrones ordenados que pueden utilizarse para investigar el papel que desempeña la topografía en la promoción de la neuritogénesis. Los parámetros de la máscara determinan la periodicidad del patrón, pero el ancho y la profundidad de las crestas están determinados por las condiciones de grabado. En un estudio, se crearon crestas con periodos que oscilaban entre 400 y 4000 nm, anchos que oscilaban entre 70 y 1900 nm, y una profundidad de surco de 600 nm; las neuritas en desarrollo demostraron guía por contacto con características tan pequeñas como 70 nm y más del 90 % de las neuritas estaban dentro de los 10 grados de alineación paralela con las crestas y los surcos. ^{[ 27 ]} No hubo una diferencia significativa en la orientación con respecto a los tamaños de las características utilizadas. El número de neuritas por célula estaba limitado por las crestas y los surcos, produciendo fenotipos bipolares en lugar de ramificados. ^{[ 27 ]}

Las topografías desordenadas se crean generalmente mediante procesos que ocurren espontáneamente durante otros procesos; los patrones son aleatorios en orientación y organización, con un control impreciso o nulo sobre la geometría de las características. ^{[ 7 ]} La ventaja de crear topografías desordenadas sobre las ordenadas es que los procesos suelen ser menos laboriosos, menos costosos y no requieren gran habilidad ni experiencia. Las topografías desordenadas se pueden crear mediante la separación de polímeros, la litografía coloidal y el grabado químico.

En la desmezcla de polímeros , las mezclas de polímeros experimentan una separación de fases espontánea; esto suele ocurrir en condiciones como el recubrimiento por centrifugación sobre obleas de silicio. Las estructuras que se pueden crear mediante este método incluyen fosas, islas y cintas a nanoescala, que se pueden controlar hasta cierto punto ajustando la proporción y la concentración del polímero para cambiar la forma y el tamaño de la estructura, respectivamente. ^{[ 7 ]} El control en la dirección horizontal es limitado, aunque la dirección vertical de las estructuras se puede controlar con precisión. Debido a que el patrón es muy desordenado horizontalmente, este método solo se puede utilizar para estudiar las interacciones celulares con nanotopografías de altura específica . ^{[ 7 ]}

La litografía coloidal es económica y permite crear superficies con alturas y diámetros controlados. Los nanocoloides se utilizan como máscara de grabado, extendiéndolos sobre la superficie del material. Posteriormente, se emplea bombardeo iónico o evaporación de película para grabar alrededor de los nanocoloides, creando nanocolumnas y nanopozos, respectivamente. La estructura superficial final se controla variando el área cubierta por los coloides y su tamaño. El área cubierta por los coloides se modifica ajustando la fuerza iónica de la solución coloidal. Esta técnica permite crear grandes superficies con patrones, lo cual es fundamental para aplicaciones de ingeniería de tejidos. ^{[ 7 ]}

El grabado químico consiste en sumergir la superficie del material en un agente de grabado como el ácido fluorhídrico (HF) o el hidróxido de sodio (NaOH) hasta que la superficie se graba hasta obtener la rugosidad deseada, creada por hoyos y protuberancias a escala nanométrica. ^{[ 7 ]} Tiempos de grabado más prolongados dan como resultado superficies más rugosas (es decir, hoyos y protuberancias superficiales más pequeñas). No es posible crear estructuras con geometría u organización específicas mediante este método rudimentario, ya que, en el mejor de los casos, puede considerarse un tratamiento superficial para modificar la rugosidad de la superficie. Las ventajas significativas de este método son su facilidad de uso y su bajo coste para crear una superficie con nanotopografías . Se grabaron obleas de silicio con HF y se demostró que la adhesión celular mejoraba únicamente en un rango específico de rugosidad (20-50 nm). ^{[ 7 ]}

Además de crear topografía mediante señales físicas, también se puede crear con señales químicas mediante la deposición selectiva de una solución polimérica en patrones sobre la superficie de un sustrato. Existen diferentes métodos para depositar las señales químicas. Dos métodos para dispensar soluciones químicas son la formación de patrones de rayas y la microdispensación piezoeléctrica.

Las películas de polímero con patrón de rayas se pueden formar sobre sustratos sólidos mediante el vertido de una solución de polímero diluida. Este método es relativamente fácil, económico y no tiene restricciones en los materiales de andamiaje que se pueden utilizar. El procedimiento consiste en superponer horizontalmente placas de vidrio manteniéndolas separadas verticalmente por un espacio estrecho lleno de una solución de polímero. La placa superior se mueve a una velocidad constante entre 60 y 100  μm/s. ^{[ 28 ]} Una fina película líquida de solución se forma continuamente en el borde del vidrio deslizante después de la evaporación del disolvente. Los patrones de rayas preparados a velocidades de 60, 70 y 100  μm/s crearon anchos y espaciamientos de surcos de 2,2 y 6,1  μm, 3,6 y 8,4  μm, y 4,3 y 12,7  μm, respectivamente; el rango de alturas para las crestas fue de 50 a 100  nm. ^{[ 28 ]} Tsuruma, Tanaka et al. Se demostró que las células neuronales embrionarias cultivadas en una película recubierta con poli-L-lisina se adhirieron y elongaron paralelamente a las franjas de solución de poli(ε-caprolactona)/cloroformo (1 g/L) con un ancho y espaciado de patrón estrechos (ancho: 2,2  μm, espaciado: 6,1  μm). ^{[ 28 ]} Sin embargo, las neuronas crecieron a través del eje de los patrones con un ancho y espaciado amplios (ancho: 4,3  μm, espaciado: 12,7  μm). En promedio, las neuronas en las películas con patrón de franjas tenían menos neuritas por célula y neuritas más largas en comparación con las neuronas en películas sin patrón. Por lo tanto, los parámetros del patrón de franjas pueden determinar la dirección de crecimiento, la longitud de las neuritas y el número de neuritas por célula. ^{[ 28 ]}

Se utilizó la microdispensación para crear micropatrones en placas de cultivo de poliestireno mediante la dispensación de gotas de soluciones adhesivas de laminina y albúmina de suero bovino (BSA) no adhesiva. ^{[ 29 ]} El microdispensador es un elemento piezoeléctrico unido a una barra de empuje en la parte superior de un canal grabado en silicio, que tiene una entrada en cada extremo y una boquilla en el medio. El elemento piezoeléctrico se expande cuando se aplica voltaje, lo que provoca que el líquido se dispense a través de la boquilla. El microdispensador se mueve utilizando una mesa xy controlada por computadora. La resolución del micropatrón depende de muchos factores: viscosidad del líquido dispensado, paso de gota (la distancia entre el centro de dos gotas adyacentes en una línea o matriz) y el sustrato. ^{[ 29 ]} Con el aumento de la viscosidad, las líneas se vuelven más delgadas, pero si la viscosidad del líquido es demasiado alta, el líquido no puede ser expulsado. Calentar la solución crea líneas de proteína más uniformes. Aunque cierta superposición de gotas es necesaria para crear líneas continuas, la evaporación desigual puede causar una concentración de proteína desigual a lo largo de las líneas; Esto se puede prevenir mediante una evaporación más uniforme, modificando las propiedades de la solución dispensada.

Para patrones que contienen 0,5  mg/mL de laminina, una mayor proporción de neuritas creció en las líneas microdispensadas que entre las líneas. ^{[ 29 ]} En patrones de proteína BSA de 10  mg/mL y 1  mg/mL y patrones de proteína BSA sin ácidos grasos, un número significativo de neuritas evitó las líneas de proteína y creció entre las líneas. Por lo tanto, las líneas de BSA que contienen ácidos grasos fueron tan no permisivas para el crecimiento de neuritas como las líneas que contienen BSA con ácidos grasos. Debido a que la microdispensación no requiere contacto directo con las superficies del sustrato, esta técnica puede utilizar superficies con micro- o nanotopología delicada que podrían destruirse por contacto. Es posible variar la cantidad de proteína depositada dispensando más o menos gotas. Una ventaja de la microdispensación es que los patrones se pueden crear rápidamente en 5-10 minutos. Debido a que el microdispensador piezoeléctrico no requiere calentamiento, se pueden dispensar proteínas y fluidos sensibles al calor, así como células vivas. ^{[ 29 ]}

El colágeno es un componente principal de la matriz extracelular y se encuentra en los tejidos de soporte de los nervios periféricos. Se sintetizó un terpolímero (TERP) mediante copolimerización por radicales libres de sus tres monómeros y se reticuló con colágeno, creando un andamio de hidrogel híbrido biológico-sintético. ^{[ 15 ]} El terpolímero se basa en poli(NIPAAM), conocido por ser un polímero biocompatible. El TERP se utiliza tanto como agente reticulante para aumentar la robustez del hidrogel como sitio para el injerto de péptidos bioactivos o factores de crecimiento, mediante la reacción de algunos de sus grupos acriloxisuccinimida con los grupos –NH2 de los péptidos o factores de crecimiento. ^{[ 15 ]} Debido a que el hidrogel de colágeno-terpolímero (colágeno-TERP) carece de un componente bioactivo, un estudio le unió un péptido de adhesión celular común que se encuentra en la laminina (YIGSR) para mejorar sus propiedades de adhesión celular. ^{[ 15 ]}

Los polímeros de la familia PLGA incluyen el poli(ácido láctico) (PLA), el poli(ácido glicólico) (PGA) y su copolímero poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los tres polímeros han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para su uso en diversos dispositivos. Estos polímeros son frágiles y carecen de regiones que permitan modificaciones químicas; además, se degradan en masa en lugar de en superficie, lo que no constituye un proceso de degradación uniforme e ideal. ^{[ 4 ]} Para intentar superar la falta de funcionalidades, se han incorporado aminas libres a sus estructuras, a las que se pueden unir péptidos para controlar la adhesión y el comportamiento celular. ^{[ 4 ]}

El dextrano es un polisacárido derivado de bacterias; generalmente se produce mediante enzimas de ciertas cepas de leuconostoc o Streptococcus . Consiste en residuos de D-glucopiranosa unidos mediante enlaces α-1,6. Las microesferas de hidrogel de dextrano reticulado se han utilizado ampliamente como matrices de baja unión a proteínas para aplicaciones de cromatografía de columna y para la tecnología de cultivo celular con microportadores. ^{[ 34 ]} Sin embargo, no ha sido hasta hace poco que los hidrogeles de dextrano se han investigado en aplicaciones de biomateriales y, específicamente, como vehículos de administración de fármacos. Una ventaja del uso de dextrano en aplicaciones de biomateriales incluye su resistencia a la adsorción de proteínas y a la adhesión celular, lo que permite determinar la adhesión celular específica mediante péptidos unidos deliberadamente de componentes de la ECM. ^{[ 34 ]} El AEMA se copolimerizó con Dex-MA para introducir grupos amina primarios que proporcionen un sitio para la unión de péptidos derivados de la ECM para promover la adhesión celular. Los péptidos pueden inmovilizarse mediante la química de acoplamiento sulfo-SMMC y péptidos con terminación de cisteína. La copolimerización de Dex-MA con AEMA permitió preservar la geometría macroporosa de los andamios, además de promover las interacciones celulares. ^{[ 34 ]}

Se ha desarrollado un nuevo elastómero biodegradable y resistente a partir de poli(glicerol sebacato) (PGS) para su uso en la creación de un conducto de guía nerviosa. ^{[ 30 ]} El PGS se desarrolló originalmente para fines de ingeniería de tejidos blandos con el fin de imitar específicamente las propiedades mecánicas de la matriz extracelular (ECM). Se considera un elastómero porque es capaz de recuperarse de la deformación en entornos mecánicamente dinámicos y de distribuir eficazmente la tensión de manera uniforme a través de los tejidos en regeneración en forma de microtensiones. El PGS se sintetiza mediante una reacción de policondensación de glicerol y ácido sebácico, que puede procesarse por fusión o por solventes para obtener la forma deseada. El PGS tiene un módulo de Young de 0,28 MPa y una resistencia a la tracción máxima superior a 0,5 MPa. ^{[ 30 ]} El nervio periférico tiene un módulo de Young de aproximadamente 0,45 MPa, que es muy cercano al del PGS. Además, el PGS experimenta degradación superficial, acompañada de pérdidas de masa lineal y resistencia durante la reabsorción. ^{[ 30 ]} Tras la implantación, se determinó que la vida media de degradación era de 21 días; la degradación completa se produjo al día 60. ^{[ 30 ]} El PGS experimenta una absorción mínima de agua durante la degradación y no presenta hinchazón detectable; la hinchazón puede causar distorsión, lo que estrecha la luz tubular y puede impedir la regeneración. Es ventajoso que el tiempo de degradación del PGS pueda variarse cambiando el grado de reticulación y la proporción de ácido sebácico a glicerol. ^{[ 30 ]} En un estudio de Sundback et al. (2005), los conductos de PGS y PLGA implantados tuvieron respuestas tisulares tempranas similares; sin embargo, las respuestas inflamatorias del PLGA aumentaron más tarde, mientras que las respuestas inflamatorias del PGS continuaron disminuyendo. ^{[ 30 ]}

Los hidrogeles de polietilenglicol (PEG) son biocompatibles y se ha demostrado su tolerancia en muchos tipos de tejido, incluido el SNC. Mahoney y Anseth formaron hidrogeles de PEG mediante la fotopolimerización de grupos metacrilato unidos covalentemente a macromeros de PEG degradables. La degradación del hidrogel se monitorizó a lo largo del tiempo midiendo la resistencia mecánica (módulo de compresión) y el tamaño medio de la malla a partir de los datos de la relación de hinchamiento. ^{[ 35 ]} Inicialmente, las cadenas poliméricas estaban altamente reticuladas, pero a medida que avanzaba la degradación, los enlaces éster se hidrolizaban, lo que permitía que el gel se hinchara; el módulo de compresión disminuía a medida que aumentaba el tamaño de la malla hasta que el hidrogel se disolvía por completo. Se demostró que las células precursoras neuronales podían fotoencapsularse y cultivarse en los geles de PEG con una mínima muerte celular. Debido a que el tamaño de la malla es inicialmente pequeño, el hidrogel bloquea las señales inflamatorias y otras señales inhibitorias del tejido circundante. A medida que aumenta el tamaño de la malla, el hidrogel puede servir como andamio para la regeneración axonal. ^{[ 35 ]}

El ácido polisialico (PSA) es un material biocompatible y biorreabsorbible relativamente nuevo para conductos nerviosos artificiales. Es un homopolímero de residuos de ácido siálico unidos mediante enlaces α2,8 y una modificación postraduccional regulada dinámicamente de la molécula de adhesión celular neural (NCAM). Estudios recientes han demostrado que la NCAM polisialilada (poliSia-NCAM) promueve la regeneración en el sistema motor. ^{[ 36 ]} El PSA muestra estabilidad en condiciones de cultivo celular y permite la degradación inducida por enzimas. También se ha descubierto recientemente que el PSA está involucrado en procesos de guía como la neuritogénesis, la búsqueda de rutas axonales y la migración de neuroblastos. ^{[ 36 ]} Los animales con PSA genéticamente inactivado expresan un fenotipo letal, que presenta una búsqueda de rutas ineficaz; los nervios que conectan los dos hemisferios cerebrales eran aberrantes o estaban ausentes. ^{[ 36 ]} Por lo tanto, el PSA es vital para el correcto desarrollo del sistema nervioso.

El colágeno es el componente principal de la matriz extracelular y se ha utilizado ampliamente en la regeneración y reparación nerviosa. Debido a su microgeometría lisa y permeabilidad, los geles de colágeno permiten la difusión de moléculas a través de ellos. Las tasas de reabsorción de colágeno se pueden controlar mediante la reticulación del colágeno con compuestos polipoxi. ^{[ 6 ]} Además, los andamios de colágeno tipo I/III han demostrado buena biocompatibilidad y son capaces de promover la proliferación de células de Schwann. Sin embargo, los conductos de colágeno rellenos de células de Schwann utilizados para unir defectos nerviosos en ratas han mostrado una regeneración nerviosa sorprendentemente ineficaz en comparación con los autoinjertos nerviosos. ^{[ 6 ]} Esto se debe a que la biocompatibilidad no es el único factor necesario para una regeneración nerviosa exitosa; otros parámetros como el diámetro interno, la microtopografía interna, la porosidad, el grosor de la pared y la densidad de siembra de células de Schwann deberán examinarse en estudios futuros para mejorar los resultados obtenidos con estos geles de colágeno I/III. ^{[ 6 ]}

Se ha demostrado que las fibras de seda de araña promueven la adhesión, proliferación y vitalidad celular. Allmeling, Jokuszies et al. demostraron que las células de Schwann se adhieren rápida y firmemente a las fibras de seda, creciendo en forma bipolar; las tasas de proliferación y supervivencia fueron normales en las fibras de seda. ^{[ 37 ]}

Utilizaron fibras de seda de araña para crear un conducto nervioso con células de Schwann y venas xenogénicas acelularizadas. Las células de Schwann formaron columnas a lo largo de las fibras de seda en poco tiempo, y estas columnas eran similares a las bandas de Bungner que crecen in vivo después de una lesión del SNP. ^{[ 37 ]} Hasta ahora, la seda de araña no se había utilizado en ingeniería de tejidos debido a la naturaleza depredadora de las arañas y al bajo rendimiento de seda de cada araña. Se ha descubierto que la especie Nephila clavipes produce una seda menos inmunogénica que la del gusano de seda; tiene una resistencia a la tracción de 4 x 10⁹ N/m, seis veces la resistencia a la rotura del acero. ^{[ 37 ]} Debido a que la seda de araña se degrada proteolíticamente, no hay un cambio en el pH con respecto al pH fisiológico durante la degradación. Otras ventajas de la seda de araña incluyen su resistencia a la descomposición por hongos y bacterias durante semanas y el hecho de que no se hincha. Además, la estructura de la seda promueve la adhesión y migración celular. Sin embargo, la recolección de seda sigue siendo una tarea tediosa y su composición exacta varía entre especies e incluso entre individuos de la misma especie, dependiendo de la dieta y el entorno. Se han realizado intentos para fabricar seda de araña sintéticamente. Se necesitan más estudios para probar la viabilidad del uso de un conducto nervioso de seda de araña in vitro e in vivo . ^{[ 37 ]}

Además de las arañas, los gusanos de seda son otra fuente de seda. La proteína de los gusanos de seda Bombyx mori es un núcleo de fibroína rodeado de sericina, una familia de proteínas con propiedades adhesivas. La fibroína se ha caracterizado como una cadena pesada con una secuencia hidrofóbica y cristalizable repetida: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (donde X representa Ser o Tyr). La sericina circundante es más hidrofílica debido a la presencia de numerosos residuos polares, aunque también presenta algunas porciones hidrofóbicas de lámina β. La seda se ha utilizado durante mucho tiempo como sutura debido a su alta resistencia mecánica, flexibilidad y permeabilidad al agua y al oxígeno. Además, la fibroína de seda se puede manipular y esterilizar fácilmente. Sin embargo, su uso se interrumpió cuando se reportaron reacciones inmunológicas indeseables. Recientemente, se descubrió que la causa de estos problemas inmunológicos reside exclusivamente en la sericina circundante. ^{[ 38 ]} Desde este descubrimiento, la seda sin sericina se ha utilizado en numerosas aplicaciones farmacéuticas y biomédicas. Debido a que es necesario eliminar la sericina que rodea la fibroína antes de poder utilizar la seda, se requiere desarrollar un procedimiento eficiente para su eliminación, conocido como desgomado. Un método de desgomado utiliza una solución acuosa de Na₂CO₃ hirviendo _, que _elimina la sericina sin dañar la fibroína. Yang, Chen et al. demostraron que la fibroína de seda y el fluido de extracto de fibroína de seda presentan buena biocompatibilidad con las células de Schwann, sin efectos citotóxicos sobre la proliferación. ^{[ 38 ]}

El quitosano y la quitina pertenecen a una familia de biopolímeros compuestos por subunidades de N-acetil-D-glucosamina y D-glucosamina unidas mediante enlaces β(1–4). ^{[ 39 ]} El quitosano se forma por N-desacetilación alcalina de la quitina, que es el segundo polímero natural más abundante después de la celulosa. ^{[ 14 ]} El quitosano es un polisacárido biodegradable que ha sido útil en muchas aplicaciones biomédicas, como agente quelante, transportador de fármacos, membrana y aditivo para el tratamiento de agua. ^{[ 11 ]} El quitosano es soluble en soluciones acuosas diluidas, pero precipita en forma de gel a pH neutro. ^{[ 11 ]} No favorece bien la adhesión y proliferación de células neuronales, pero puede mejorarse mediante la adhesión de péptidos derivados de la matriz extracelular. El quitosano también presenta propiedades mecánicas débiles, que son más difíciles de superar. ^{[ 9 ]}

El grado de acetilación (GA) del quitosano soluble varía del 0% al 60%, dependiendo de las condiciones de procesamiento. ^{[ 39 ]} Se realizó un estudio para caracterizar cómo la variación del GA afecta las propiedades del quitosano. La variación del GA se obtuvo utilizando anhídrido acético o hidrólisis alcalina . Se encontró que la disminución de la acetilación produjo un aumento en la resistencia a la compresión. ^{[ 39 ]} La biodegradación se examinó mediante el uso de lisozima, que se sabe que es la principal responsable de degradar el quitosano in vivo al hidrolizar sus enlaces glucosídicos y es liberada por las células fagocíticas después de una lesión nerviosa. Los resultados revelan que hubo una pérdida de masa acelerada con GA intermedios, en comparación con GA altos y bajos durante el período de tiempo estudiado. ^{[ 39 ]} Cuando las células DRG se cultivaron en el quitosano N-acetilado, la viabilidad celular disminuyó con el aumento del GA. Además, el quitosano tiene una densidad de carga creciente con la disminución del GA, lo que es responsable de una mayor adhesión celular. ^{[ 39 ]} Por lo tanto, controlar el grado de degradación del quitosano es importante para regular su tiempo de degradación. Este conocimiento podría ayudar en el desarrollo de un conducto de guía nerviosa a partir de quitosano.

Recientemente se ha demostrado que los andamios de aragonita favorecen el crecimiento de neuronas del hipocampo de ratas. Shany et al. (2006) demostraron que las matrices de aragonita pueden favorecer el crecimiento de redes astrocíticas in vitro e in vivo . Por lo tanto, los andamios de aragonita podrían ser útiles para la reparación y regeneración del tejido nervioso. Se hipotetiza que el Ca²⁺ derivado de la aragonita ^es esencial para promover la adhesión celular y el contacto célula-célula. Esto probablemente se lleva a cabo con la ayuda de moléculas de adhesión dependientes de Ca²⁺, ^como las cadherinas. ^{[ 40 ]} Las matrices cristalinas de aragonita presentan muchas ventajas sobre los hidrogeles. Tienen poros más grandes, lo que permite un mejor crecimiento celular, y el material es bioactivo debido a la liberación de Ca²⁺ ^, que promueve la adhesión y supervivencia celular. Además, las matrices de aragonita tienen mayor resistencia mecánica que los hidrogeles, lo que les permite soportar mayor presión al ser presionadas sobre un tejido lesionado. ^{[ 40 ]}

El alginato es un polisacárido que forma cadenas fácilmente; puede entrecruzarse en sus grupos carboxílicos con cationes multivalentes como Cu²⁺ ^, Ca²⁺ ^o Al³⁺ ^para formar un hidrogel mecánicamente más estable. ^{[ 41 ]} Los alginatos de calcio forman polímeros que son biocompatibles y no inmunogénicos y se han utilizado en aplicaciones de ingeniería de tejidos. Sin embargo, no pueden soportar el crecimiento orientado longitudinalmente, que es necesario para la reconexión del extremo proximal con su objetivo. Para superar este problema, se han desarrollado hidrogeles capilares anisotrópicos (ACH). Estos se crean superponiendo soluciones acuosas de alginato de sodio con soluciones acuosas de cationes multivalentes en capas. ^{[ 41 ]} Después de la formación, los iones electrolíticos se difunden en las capas de la solución polimérica, y un proceso convectivo disipativo hace que los iones precipiten, creando capilares. El proceso convectivo disipativo resulta de la oposición de los gradientes de difusión y la fricción entre las cadenas de polielectrolitos . ^{[ 41 ]} Las paredes capilares están revestidas con el alginato metálico precipitado, mientras que el lumen está lleno con el agua extruida.

Prang et al. (2006) evaluaron la capacidad de los geles ACH para promover el crecimiento axonal dirigido en el SNC de mamíferos lesionado. Los iones multivalentes utilizados para crear los geles ACH a base de alginato fueron iones de cobre, cuya difusión en las capas de alginato de sodio creó geles capilares anisotrópicos con estructura hexagonal. ^{[ 41 ]} Después de la precipitación, todo el gel fue atravesado por capilares orientados longitudinalmente. Los andamios ACH promovieron la supervivencia de las NPC adultas y la regeneración axonal altamente orientada. ^{[ 41 ]} Este es el primer caso de uso de alginatos para producir geles capilares con estructura anisotrópica. Se necesitan estudios futuros para estudiar la estabilidad física a largo plazo de los andamios ACH, porque la regeneración axonal del SNC puede tardar muchos meses; sin embargo, además de poder proporcionar soporte a largo plazo, los andamios también deben ser degradables. De todos los biopolímeros biológicos y sintéticos investigados por Prang et al. (2006), solo los geles a base de agarosa pudieron compararse con la regeneración lineal causada por los andamios de ACH. Los estudios futuros también deberán investigar si los andamios de ACH permiten la reinervación del objetivo in vivo después de una lesión de la médula espinal. ^{[ 41 ]}

El ácido hialurónico (AH) es un biomaterial ampliamente utilizado debido a su excelente biocompatibilidad y su diversidad de funciones fisiológicas. Es abundante en la matriz extracelular (MEC), donde se une a grandes glicosaminoglicanos (GAG) y proteoglicanos a través de interacciones específicas AH-proteína. El AH también se une a receptores de la superficie celular como CD44, lo que resulta en la activación de cascadas de señalización intracelular que regulan la adhesión y la motilidad celular y promueven la proliferación y diferenciación. ^{[ 42 ]} También se sabe que el AH apoya la angiogénesis porque sus productos de degradación estimulan la proliferación y migración de células endoteliales. Por lo tanto, el AH juega un papel fundamental en el mantenimiento de los procesos normales necesarios para la supervivencia del tejido. El AH no modificado se ha utilizado en aplicaciones clínicas como cirugía ocular, cicatrización de heridas y cirugía plástica. ^{[ 42 ]} El AH se puede reticular para formar hidrogeles. En un estudio realizado por Hou et al., se implantaron hidrogeles de HA, tanto sin modificar como modificados con laminina, en una lesión del sistema nervioso central de un adulto y se evaluó su capacidad para inducir la formación de tejido neural. Estos hidrogeles demostraron su capacidad para favorecer el crecimiento celular y la angiogénesis, además de inhibir la formación de cicatrices gliales. Asimismo, los hidrogeles de HA modificados con laminina fueron capaces de promover la extensión de neuritas. ^{[ 42 ]} Estos resultados respaldan el uso de los geles de HA como un biomaterial prometedor para la creación de conductos de guía nerviosa.

Las células de Schwann (CS) son cruciales para la regeneración del nervio periférico; desempeñan funciones tanto estructurales como funcionales. Las células de Schwann participan en la degeneración walleriana y en las bandas de Bungner. Cuando un nervio periférico se daña, las células de Schwann alteran su morfología, comportamiento y proliferación para involucrarse en la degeneración walleriana y las bandas de Bungner. ^{[ 38 ]} En la degeneración walleriana, las células de Schwann crecen en columnas ordenadas a lo largo del tubo endoneural, creando una banda de Bungner (boB) que protege y preserva el canal endoneural. Además, liberan factores neurotróficos que mejoran el crecimiento junto con los macrófagos. El uso de células de Schwann en la ingeniería de tejidos neurales presenta algunas desventajas; por ejemplo, es difícil aislar selectivamente las células de Schwann y, una vez aisladas, muestran una proliferación deficiente. Una forma de superar esta dificultad es inducir artificialmente a otras células, como las células madre, a fenotipos similares a las CS. ^{[ 43 ]}

Eguchi et al. (2003) investigaron el uso de campos magnéticos para alinear células de Schwann. Utilizaron un imán superconductor horizontal que produce un campo de 8 T en su centro. Tras 60 horas de exposición, las células de Schwann se alinearon paralelamente al campo; durante el mismo intervalo, las células de Schwann no expuestas se orientaron de forma aleatoria. Se hipotetiza que las diferencias en la susceptibilidad al campo magnético de los componentes de la membrana y los elementos del citoesqueleto pueden causar la orientación magnética. ^{[ 44 ]} Las fibras de colágeno también se expusieron al campo magnético y, en 2 horas, se alinearon perpendicularmente al campo magnético, mientras que las fibras de colágeno formaron un patrón de red aleatorio sin exposición al campo magnético. Cuando se cultivaron sobre las fibras de colágeno, las células de Schwann se alinearon a lo largo del colágeno orientado magnéticamente después de dos horas de exposición al campo magnético de 8 T. Por el contrario, las células de Schwann se orientaron aleatoriamente sobre las fibras de colágeno sin exposición al campo magnético. De este modo, el cultivo en fibras de colágeno permitió que las células de Schwann se orientaran perpendicularmente al campo magnético y mucho más rápidamente. ^{[ 44 ]}

Estos hallazgos podrían ser útiles para alinear las células de Schwann en una lesión del sistema nervioso y así promover la formación de las bandas de Bungner, cruciales para mantener el tubo endoneural que guía los axones en regeneración hacia sus dianas. Es prácticamente imposible alinear las células de Schwann mediante técnicas físicas externas; por lo tanto, el descubrimiento de una técnica alternativa para la alineación es significativo. Sin embargo, la técnica desarrollada aún presenta desventajas, principalmente que requiere una cantidad considerable de energía para mantener el campo magnético durante periodos prolongados.

Se han realizado estudios para intentar mejorar la capacidad migratoria de las células de Schwann. La migración de las células de Schwann está regulada por integrinas con moléculas de la ECM como la fibronectina y la laminina. Además, se sabe que la molécula de adhesión celular neural ( NCAM ) mejora la motilidad de las células de Schwann in vitro . ^{[ 45 ]} La NCAM es una glicoproteína que se expresa en las membranas de los axones y las células de Schwann. El ácido polisialico (PSA) se sintetiza en la NCAM por la polisialiltransferasa (PST) y la sialiltransferasa X (STX). ^{[ 45 ]} Durante el desarrollo del SNC, la expresión de PSA en la NCAM se regula positivamente hasta las etapas posnatales. Sin embargo, en el cerebro adulto, el PSA se encuentra solo en regiones con alta plasticidad . La expresión de PSA no ocurre en las células de Schwann.

Lavdas et al. (2006) investigaron si la expresión sostenida de PSA en las células de Schwann mejora su migración. Las células de Schwann se transfectaron con un vector retroviral que codificaba STX para inducir la expresión de PSA. Las células de Schwann que expresaban PSA obtuvieron una mayor motilidad, como se demostró en un ensayo de puenteo de brechas y después del injerto en cultivos de cortes de prosencéfalo postnatal. ^{[ 45 ]} La expresión de PSA no alteró la diferenciación molecular ni morfológica. Las células de Schwann que expresaban PSA fueron capaces de mielinizar axones del SNC en cortes cerebelosos, lo que normalmente no es posible in vivo . Se espera que estas células de Schwann que expresan PSA puedan migrar por todo el SNC sin perder sus capacidades mielinizantes y que puedan ser útiles para la regeneración y mielinización de axones en el sistema nervioso central. ^{[ 45 ]}

Los astrocitos son células gliales abundantes en el sistema nervioso central. Son cruciales para el soporte metabólico y trófico de las neuronas; además, proporcionan amortiguación de iones y eliminación de neurotransmisores. Los axones en crecimiento son guiados por señales creadas por los astrocitos; por lo tanto, los astrocitos pueden regular la búsqueda de rutas de las neuritas y, posteriormente, la formación de patrones en el cerebro en desarrollo. ^{[ 40 ]} La cicatriz glial que se forma después de una lesión en el sistema nervioso central está formada por astrocitos y fibroblastos ; es el obstáculo más importante para la regeneración. La cicatriz glial consiste en astrocitos hipertrofiados, tejido conectivo y ECM. Dos objetivos de la ingeniería de tejidos neurales son comprender la función de los astrocitos y desarrollar el control sobre su crecimiento. Estudios de Shany et al. (2006) han demostrado que las tasas de supervivencia de los astrocitos aumentan en matrices de aragonita 3D en comparación con los cultivos celulares 2D convencionales. La capacidad de las prolongaciones celulares para extenderse a través de curvas y poros permite la formación de múltiples capas celulares con configuraciones 3D complejas.

Las tres formas distintas por las que las células adquirieron una forma 3D son: ^{[ 40 ]}

1. adhiriéndose a la superficie y siguiendo el contorno 3D
2. estirar algunos procesos entre 2 curvaturas
3. procesos de extensión en 3D dentro de las capas celulares cuando se encuentran dentro de un tejido multicapa

En el cultivo celular convencional, el crecimiento se restringe a un plano, lo que provoca la formación de monocapas con la mayoría de las células en contacto con la superficie; sin embargo, la curvatura 3D de la superficie de aragonita permite el desarrollo de múltiples capas y que los astrocitos distantes entre sí entren en contacto. Es importante promover la formación de prolongaciones similares a las condiciones 3D in vivo , ya que la morfología de las prolongaciones astrocíticas es esencial para guiar la direccionalidad de los axones en regeneración. ^{[ 40 ]} La topografía de la aragonita proporciona una alta relación superficie-volumen y carece de bordes, lo que reduce el efecto de borde del cultivo. ^{[ 40 ]} Las matrices cristalinas como la aragonita aquí mencionada permiten promover una formación compleja de tejido 3D que se aproxima a las condiciones in vivo .

El sistema olfativo primario de los mamíferos ha conservado la capacidad de regenerarse continuamente durante la edad adulta. ^{[ 46 ]} Las neuronas receptoras olfativas tienen una vida útil promedio de 6 a 8 semanas y, por lo tanto, deben ser reemplazadas por células diferenciadas a partir de las células madre que se encuentran dentro de una capa en la base del epitelio cercano. Las nuevas neuronas receptoras olfativas deben proyectar sus axones a través del SNC hasta un bulbo olfatorio para ser funcionales. El crecimiento axonal está guiado por la composición glial y la citoarquitectura del bulbo olfatorio, además de la presencia de células envolventes olfativas (CEO). ^{[ 46 ]}

Se postula que las OEC se originan en la placoda olfativa , lo que sugiere un origen de desarrollo diferente al de otras microglías similares del sistema nervioso.

Otro concepto interesante es que las OEC se encuentran tanto en las porciones del sistema nervioso periférico como central del sistema olfativo primario, es decir, el epitelio y el bulbo olfatorio. ^{[ 46 ]}

Las OEC son similares a las células de Schwann en que proporcionan una regulación positiva del receptor p75 de NGF de baja afinidad después de una lesión; sin embargo, a diferencia de las células de Schwann, producen niveles más bajos de neurotrofinas . Varios estudios han mostrado evidencia de que las OEC pueden apoyar la regeneración de axones lesionados, pero estos resultados a menudo no se pueden reproducir. ^{[ 46 ]} No obstante, las OEC se han investigado exhaustivamente en relación con lesiones de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades neurodegenerativas. Los investigadores sugieren que estas células poseen una capacidad única para remielinizar neuronas lesionadas. ^{[ 47 ]}

Las OEC tienen propiedades similares a las de los astrocitos , ^{[ 48 ]} ambos identificados como susceptibles a la infección viral. ^{[ 47 ] [ 48 ]}

Las células madre adultas no pueden proliferar ni diferenciarse tan eficazmente in vitro como in vivo . Pueden provenir de diversos tejidos, pero aislarlas resulta difícil debido a su comportamiento y no a marcadores de superficie. Aún no se ha desarrollado un método para distinguir claramente entre las células madre y las células diferenciadas que las rodean. Sin embargo, los marcadores de superficie pueden utilizarse hasta cierto punto para eliminar la mayoría de las células diferenciadas no deseadas. La plasticidad de las células madre es la capacidad de diferenciarse a través de los límites de la línea germinal embrionaria. No obstante, la existencia de plasticidad ha sido objeto de intenso debate. Algunos afirman que la plasticidad se debe a la heterogeneidad entre las células o a eventos de fusión celular. Actualmente, las células pueden diferenciarse a través de líneas celulares con rendimientos que oscilan entre el 10 % y el 90 %, según las técnicas utilizadas. ^{[ 49 ]} Se necesitan más estudios para estandarizar el rendimiento mediante la transdiferenciación. La transdiferenciación de células madre multipotentes es una vía potencial para obtener células madre que no están disponibles o no se obtienen fácilmente en el adulto. ^{[ 4 ]}

Las células madre mesenquimales son células madre adultas que se encuentran en la médula ósea; son capaces de diferenciarse en linajes de origen mesodérmico. Algunos ejemplos de tejidos que forman son hueso , cartílago , grasa y tendón . Las MSC se obtienen mediante aspiración de médula ósea. Muchos factores promueven el crecimiento de las MSC, entre ellos: el factor de crecimiento derivado de plaquetas , el factor de crecimiento epidérmico β y el factor de crecimiento similar a la insulina-1 . Además de sus vías de diferenciación normales, las MSC pueden transdiferenciarse a lo largo de linajes no mesenquimales como astrocitos, neuronas y células mielinizantes del SNP. Las MSC son potencialmente útiles para estrategias de regeneración nerviosa porque: ^{[ 50 ]}

1. Su uso no es una cuestión ética.
2. No se necesita inmunosupresión
3. son un recurso abundante y accesible
4. Toleran las manipulaciones genéticas.

Keilhoff et al. (2006) realizaron un estudio comparando la capacidad de regeneración nerviosa de MSC no diferenciadas y transdiferenciadas con la de las células de Schwann en injertos musculares desvitalizados que unían un espacio de 2 cm en el nervio ciático de la rata. Todas las células eran autólogas. Las MSC transdiferenciadas se cultivaron en una mezcla de factores para promover la formación de células similares a las de Schwann. Las MSC no diferenciadas no mostraron capacidad regenerativa, mientras que las MSC transdiferenciadas sí mostraron cierta capacidad regenerativa, aunque no alcanzó la capacidad de las células de Schwann. ^{[ 50 ]}

La dificultad de aislar las células de Schwann y posteriormente inducir su proliferación es un gran obstáculo. Una solución es inducir selectivamente células como las células madre ectomesenquimales (EMSC) a fenotipos similares a las células de Schwann. Las EMSC son células de la cresta neural que migran desde la cresta neural craneal hacia el primer arco branquial durante el desarrollo temprano del sistema nervioso periférico. ^{[ 43 ]} Las EMSC son multipotentes y poseen capacidad de autorrenovación. Se las puede considerar células progenitoras de Schwann porque están asociadas con el desarrollo del ganglio de la raíz dorsal y el nervio motor. La diferenciación de las EMSC parece estar regulada por programas genéticos intrínsecos y señales extracelulares en el entorno circundante. ^{[ 43 ]} Las células de Schwann son la fuente de factores neurotróficos y neurotróficos esenciales para la regeneración de los nervios y un andamio para guiar el crecimiento. Nie, Zhang et al. realizaron un estudio que investigó los beneficios del cultivo de EMSC dentro de conductos de PLGA. La adición de foskolina y BPE a un cultivo de EMSC provocó la formación de prolongaciones celulares alargadas, características comunes de las células de Schwann in vitro . ^{[ 43 ]} Por lo tanto, la foskolina y el BPF pueden inducir la diferenciación en fenotipos similares a las células de Schwann. El BPE contiene las citocinas GDNF , factor de crecimiento de fibroblastos básico y factor de crecimiento derivado de plaquetas , que provocan la diferenciación y proliferación de células gliales y de Schwann mediante la activación de las MAP quinasas . Al implantarse en los conductos de PLGA, las EMSC mantuvieron una supervivencia a largo plazo y promovieron la regeneración del nervio periférico a través de un  espacio de 10 mm, que normalmente muestra poca o ninguna regeneración. Se observaron axones mielinizados dentro de los injertos y se formaron láminas basales dentro de la mielina. Estas observaciones sugieren que las EMSC pueden promover la mielinización de las fibras nerviosas regeneradas dentro del conducto.

Insertar neuronas en un conducto nervioso bioartificial parece el método más obvio para reemplazar nervios dañados; sin embargo, las neuronas no pueden proliferar y suelen tener una vida corta en cultivo. Por lo tanto, las células progenitoras neurales son candidatas más prometedoras para reemplazar neuronas dañadas y degeneradas porque son autorrenovables, lo que permite la producción in vitro de muchas células con un mínimo de material donante. ^{[ 31 ]} Para confirmar que las nuevas neuronas formadas a partir de células progenitoras neurales son parte de una red funcional, se requiere la presencia de formación de sinapsis. Un estudio de Ma, Fitzgerald et al. es la primera demostración de la formación de sinapsis funcionales y redes neuronales derivadas de células madre y progenitoras neurales murinas en una matriz de colágeno 3D. Las células progenitoras neurales se expandieron y se diferenciaron espontáneamente en neuronas excitables y formaron sinapsis; además, conservaron la capacidad de diferenciarse en los tres linajes de tejido neural. ^{[ 31 ]} También se demostró que no solo ocurría un reciclaje activo de vesículas sinápticas, sino que también se formaban conexiones excitatorias e inhibitorias capaces de generar potenciales de acción espontáneamente. ^{[ 31 ]} Por lo tanto, las células progenitoras neuronales son una fuente viable y relativamente ilimitada para crear neuronas funcionales.

Las células madre neurales (CMN) tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en linajes neuronales y gliales. Se han desarrollado muchos métodos de cultivo para dirigir la diferenciación de las CMN; sin embargo, la creación de biomateriales para este fin se considera una tecnología más relevante y útil desde el punto de vista clínico. Un enfoque para desarrollar un biomaterial que dirija la diferenciación de las CMN consiste en combinar componentes de la matriz extracelular (MEC) y factores de crecimiento. Un estudio muy reciente de Nakajima, Ishimuro et al. examinó los efectos de diferentes pares moleculares, compuestos por un factor de crecimiento y un componente de la MEC, en la diferenciación de las CMN en astrocitos y células neuronales. Los componentes de la MEC investigados fueron la laminina-1 y la fibronectina, componentes naturales de la MEC, y ProNectin F plus (Pro-F) y ProNectin L (Pro-L), componentes artificiales de la MEC, así como poli(etilenoimina) (PEI). Los factores neurotróficos utilizados fueron el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos -2 (FGF-2), el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF). Las combinaciones de pares se inmovilizaron en matrices celulares, sobre las cuales se cultivaron las células madre neurales (CMN). Después de 2 días de cultivo, las células se tiñeron con anticuerpos contra nestina , β- tubulina III y GFAP , que son marcadores de CMN, células neuronales y astrocitos, respectivamente. ^{[ 51 ]} Los resultados proporcionan información valiosa sobre combinaciones ventajosas de componentes de la matriz extracelular (MEC) y factores de crecimiento como un método práctico para desarrollar un biomaterial que dirija la diferenciación de las CMN. ^{[ 51 ]}