Neurofilament

Los neurofilamentos ( NF ) se clasifican como filamentos intermedios de tipo IV que se encuentran en el citoplasma de las neuronas . Son polímeros de proteínas que miden 10  nm de diámetro y muchos micrómetros de longitud. ^{[ 1 ]} Junto con los microtúbulos (~25  nm) y los microfilamentos (7  nm), forman el citoesqueleto neuronal . Se cree que funcionan principalmente para proporcionar soporte estructural a los axones y regular el diámetro del axón, lo que influye en la velocidad de conducción nerviosa . Las proteínas que forman los neurofilamentos son miembros de la familia de proteínas de filamentos intermedios, que se divide en seis tipos según su organización genética y estructura proteica. Los tipos I y II son las queratinas que se expresan en los epitelios . El tipo III contiene las proteínas vimentina , desmina , periferina y proteína ácida fibrilar glial (GFAP). El tipo IV consta de las proteínas de neurofilamento NF-L, NF-M, NF-H y α-internexina . El tipo V está compuesto por las láminas nucleares , y el tipo VI por la proteína nestina . Todos los genes de filamentos intermedios de tipo IV comparten dos intrones únicos que no se encuentran en otras secuencias de genes de filamentos intermedios, lo que sugiere un origen evolutivo común a partir de un gen primitivo de tipo IV.

Cualquier filamento proteínico que se extiende en el citoplasma de una célula nerviosa también se denomina neurofibrilla . ^{[ 2 ]} Este nombre se utiliza en los ovillos neurofibrilares de algunas enfermedades neurodegenerativas .

La composición proteica de los neurofilamentos varía ampliamente entre los diferentes filos animales. Se conoce la mayor parte de la información sobre los neurofilamentos de mamíferos. Históricamente, se creía que los neurofilamentos de mamíferos estaban compuestos por solo tres proteínas: NF-L (de bajo peso molecular; NF-L ), NF-M (de peso molecular medio; NF-M ) y NF-H (de alto peso molecular; NF-H ). Estas proteínas se descubrieron a partir de estudios del transporte axonal y a menudo se las denomina el "triplete de neurofilamentos". ^{[ 3 ]} Sin embargo, ahora se sabe que los neurofilamentos también contienen la proteína α-internexina ^{[ 4 ]} y que los neurofilamentos del sistema nervioso periférico también pueden contener la proteína periferina. ^{[ 5 ]} (esta es diferente de la periferina 2 que se expresa en la retina ). Por lo tanto, los neurofilamentos de mamíferos son heteropolímeros de hasta cinco proteínas diferentes: NF-L, NF-M, NF-H, α-internexina y periferina. Las cinco proteínas de neurofilamento pueden coensamblarse en diferentes combinaciones en diferentes tipos de células nerviosas y en diferentes etapas del desarrollo. La composición precisa de los neurofilamentos en cualquier célula nerviosa dada depende de los niveles de expresión relativa de las proteínas de neurofilamento en la célula en ese momento. Por ejemplo, la expresión de NF-H es baja en neuronas en desarrollo y aumenta postnatalmente en neuronas con axones mielinizados. ^{[ 6 ]} En el sistema nervioso adulto, los neurofilamentos en axones pequeños no mielinizados contienen más periferina y menos NF-H, mientras que los neurofilamentos en axones grandes mielinizados contienen más NF-H y menos periferina. La subunidad de filamento intermedio tipo III, vimentina , se expresa en neuronas en desarrollo y en algunas neuronas muy inusuales en el adulto en asociación con proteínas tipo IV, como las neuronas horizontales de la retina .

Las proteínas triplete se nombran según su tamaño relativo (bajo, medio, alto). La masa molecular aparente de cada proteína, determinada mediante SDS-PAGE, es mayor que la predicha a partir de la secuencia de aminoácidos. Esto se debe a la migración electroforética anómala de estas proteínas, particularmente extrema para las proteínas de neurofilamento NF-M y NF-H, debido a su alto contenido de aminoácidos cargados y su extensa fosforilación . Las tres proteínas triplete de neurofilamento contienen largas secuencias polipeptídicas ricas en residuos de ácido glutámico y lisina , y NF-M, especialmente NF-H, también contienen múltiples sitios de fosforilación de serina repetidos en tándem . Casi todos estos sitios contienen el péptido lisina-serina-prolina (KSP), y la fosforilación se encuentra normalmente en los neurofilamentos axonales , no en los dendríticos . La NF-M humana tiene 13 de estos sitios KSP, mientras que la NF-H humana se expresa a partir de dos alelos, uno de los cuales produce 44 y el otro 45 repeticiones de KSP.

Al igual que otras proteínas de filamentos intermedios, las proteínas de neurofilamento comparten una región central alfa helicoidal común , conocida como dominio de varilla debido a su estructura terciaria en forma de varilla, flanqueada por dominios amino terminales y carboxi terminales que son en gran medida no estructurados. Los dominios de varilla de dos proteínas de neurofilamento se dimerizan para formar una hélice alfa enrollada . Dos dímeros se asocian de manera escalonada antiparalela para formar un tetrámero. Se cree que este tetrámero es la subunidad básica (es decir, el bloque de construcción) del neurofilamento. Las subunidades del tetrámero se asocian lado a lado para formar filamentos de longitud unitaria, que luego se unen extremo con extremo para formar el polímero de neurofilamento maduro, pero se desconoce la organización precisa de estas subunidades dentro del polímero, principalmente debido a la composición heterogénea de la proteína y la imposibilidad de cristalizar neurofilamentos o proteínas de neurofilamento. Los modelos estructurales generalmente asumen ocho tetrámeros (32 polipéptidos de neurofilamento) en una sección transversal del filamento, pero las mediciones de densidad de masa lineal sugieren que esto puede variar.

Los dominios amino terminales de las proteínas de neurofilamento contienen numerosos sitios de fosforilación y parecen ser importantes para las interacciones entre subunidades durante el ensamblaje del filamento. Los dominios carboxi terminales parecen ser dominios intrínsecamente desordenados que carecen de hélice alfa o lámina beta. Los diferentes tamaños de las proteínas de neurofilamento se deben en gran medida a las diferencias en la longitud de los dominios carboxi terminales. Estos dominios son ricos en residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Los dominios carboxi terminales de NF-M y NF-H son los más largos y se modifican extensamente mediante modificaciones postraduccionales como la fosforilación y la glicosilación in vivo. Se proyectan radialmente desde la cadena principal del filamento para formar un denso borde en cepillo de dominios altamente cargados y no estructurados, análogos a las cerdas de un cepillo para botellas. Se ha propuesto que estos dominios, que se mueven entrópica y frenéticamente, definen una zona de exclusión alrededor de cada filamento, espaciándolos eficazmente entre sí. De esta manera, las proyecciones carboxi terminales maximizan las propiedades de llenado espacial de los polímeros de neurofilamento. Mediante microscopía electrónica, estos dominios aparecen como proyecciones llamadas brazos laterales que parecen estar en contacto con filamentos vecinos.

Los neurofilamentos se encuentran en las neuronas de vertebrados en concentraciones especialmente altas en los axones, donde se alinean en paralelo a lo largo del eje longitudinal del axón, formando una red superpuesta continua. Se ha propuesto que funcionan como estructuras que rellenan el espacio y aumentan el diámetro axonal. Su contribución al diámetro del axón está determinada por el número de neurofilamentos en el axón y su densidad de empaquetamiento. Se cree que el número de neurofilamentos en el axón está determinado por la expresión del gen de los neurofilamentos ^{[ 7 ]} y el transporte axonal. La densidad de empaquetamiento de los filamentos está determinada por sus brazos laterales, que definen el espacio entre filamentos vecinos. Se cree que la fosforilación de los brazos laterales aumenta su extensibilidad, incrementando el espacio entre filamentos vecinos ^{[ 8 ]} mediante la unión de cationes divalentes entre los brazos laterales de filamentos adyacentes ^{[ 9 ] [ 10 ].}

En las primeras etapas del desarrollo, los axones son prolongaciones estrechas que contienen relativamente pocos neurofilamentos. Los axones que se mielinizan acumulan más neurofilamentos, lo que impulsa la expansión de su calibre. Después de que un axón ha crecido y se ha conectado con su célula diana , el diámetro del axón puede aumentar hasta cinco veces. ^{[ 11 ]} Esto se debe a un aumento en el número de neurofilamentos exportados desde el cuerpo de la célula nerviosa, así como a una disminución en su velocidad de transporte. En los axones mielinizados maduros, los neurofilamentos pueden ser la estructura citoplasmática más abundante y ocupar la mayor parte del área de la sección transversal del axón. Por ejemplo, un axón mielinizado grande puede contener miles de neurofilamentos en una sección transversal.

Además de su función estructural en los axones, los neurofilamentos también son cargas del transporte axonal . ^{[ 3 ]} La mayoría de las proteínas de neurofilamento en los axones se sintetizan en el cuerpo de la célula nerviosa, donde se ensamblan rápidamente en polímeros de neurofilamento en aproximadamente 30 minutos. ^{[ 12 ]} Estos polímeros de neurofilamento ensamblados se transportan a lo largo del axón en vías de microtúbulos impulsadas por proteínas motoras de microtúbulos . ^{[ 13 ]} Los filamentos se mueven bidireccionalmente, es decir, tanto hacia la punta del axón (anterógrado) como hacia el cuerpo celular (retrógrado), pero la dirección neta es anterógrada. Los filamentos se mueven a velocidades de hasta 8  μm/s en escalas de tiempo cortas (segundos o minutos), con velocidades promedio de aproximadamente 1  μm/s. ^{[ 14 ]} Sin embargo, la velocidad promedio en escalas de tiempo más largas (horas o días) es lenta porque los movimientos son muy infrecuentes, consistiendo en breves carreras interrumpidas por largas pausas. ^{[ 15 ] [ 16 ]} Por lo tanto, en escalas de tiempo largas, los neurofilamentos se mueven en el componente lento del transporte axonal.

Se han desarrollado y comercializado numerosos anticuerpos específicos contra las proteínas de los neurofilamentos. Estos anticuerpos permiten detectar dichas proteínas en células y tejidos mediante microscopía de inmunofluorescencia o inmunohistoquímica . Se utilizan ampliamente para identificar neuronas y sus prolongaciones en cortes histológicos y cultivos celulares . La proteína Nestina, un filamento intermedio de tipo VI, se expresa en neuronas y células gliales en desarrollo. Nestina se considera un marcador de células madre neuronales, y su presencia se emplea comúnmente para definir la neurogénesis . Esta proteína se pierde a medida que avanza el desarrollo.

Los anticuerpos contra neurofilamentos también se utilizan comúnmente en neuropatología diagnóstica . La tinción con estos anticuerpos permite distinguir las neuronas (positivas para proteínas de neurofilamento) de las células gliales (negativas para proteínas de neurofilamento).

También existe un considerable interés clínico en el uso de proteínas de neurofilamento como biomarcadores de daño axonal en enfermedades que afectan el sistema nervioso central. ^{[ 17 ] [ 18 ]} Cuando las neuronas o los axones degeneran, las proteínas de neurofilamento se liberan en la sangre o el líquido cefalorraquídeo. Los inmunoensayos de proteínas de neurofilamento en el líquido cefalorraquídeo y el plasma pueden servir como indicadores de daño axonal en trastornos neurológicos. ^{[ 19 ]} Los niveles de NF-L en sangre y LCR son, por lo tanto, marcadores útiles para el seguimiento de la enfermedad en la esclerosis lateral amiotrófica , ^{[ 20 ]} esclerosis múltiple , ^{[ 21 ]} atrofia muscular espinal y, más recientemente, la enfermedad de Huntington . ^{[ 22 ]} También se ha evaluado como un marcador pronóstico para el resultado funcional después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo. ^{[ 23 ]} Después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo, los niveles sanguíneos de NF-L aumentan continuamente durante la primera semana, alcanzando niveles máximos alrededor de dos semanas después del inicio de los síntomas. ^{[ 24 ] [ 25 ]} Los ratones mutantes con anomalías en los neurofilamentos presentan fenotipos similares a la esclerosis lateral amiotrófica . ^{[ 26 ]} Un trabajo reciente realizado en colaboración entre EnCor Biotechnology Inc. y la Universidad de Florida demostró que los anticuerpos NF-L empleados en los ensayos NF-L más utilizados son específicos para las formas escindidas de NF-L generadas por la proteólisis inducida por la muerte celular. ^{[ 27 ]}

• tinción de Bielschowsky