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Reprogramación

En biología, la reprogramación se refiere al borrado y remodelado de marcas epigenéticas , como la metilación del ADN , durante el desarrollo de los mamíferos o en cultivos celu...

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En biología, la reprogramación se refiere al borrado y remodelado de marcas epigenéticas , como la metilación del ADN , durante el desarrollo de los mamíferos o en cultivos celulares. [ 1 ] Este control también se asocia a menudo con modificaciones covalentes alternativas de las histonas .

Las reprogramaciones, tanto a gran escala (del 10 % al 100 % de las marcas epigenéticas) como rápidas (de horas a pocos días), ocurren en tres etapas de la vida de los mamíferos. Casi el 100 % de las marcas epigenéticas se reprograman en dos breves periodos al inicio del desarrollo, tras la fecundación del óvulo por el espermatozoide . Además, casi el 10 % de las metilaciones del ADN en las neuronas del hipocampo pueden alterarse rápidamente durante la formación de un recuerdo de miedo intenso.

Tras la fecundación en mamíferos, los patrones de metilación del ADN se borran en gran medida y luego se restablecen durante el desarrollo embrionario temprano. Casi todas las metilaciones de los padres se borran, primero durante la embriogénesis temprana y de nuevo en la gametogénesis , con desmetilación y remetilación ocurriendo en cada caso. La desmetilación durante la embriogénesis temprana ocurre en el período de preimplantación. Después de que un espermatozoide fecunda un óvulo para formar un cigoto , ocurre una rápida desmetilación del ADN paterno y una desmetilación más lenta del ADN materno hasta la formación de una mórula , que prácticamente no tiene metilación. Después de que se forma el blastocisto , puede comenzar la metilación, y con la formación del epiblasto se produce una ola de metilación hasta la etapa de implantación del embrión. Otro período de desmetilación rápida y casi completa ocurre durante la gametogénesis dentro de las células germinales primordiales (CGP). Aparte de las CGP, en la etapa posterior a la implantación, los patrones de metilación en las células somáticas son específicos de la etapa y del tejido , con cambios que presumiblemente definen cada tipo celular individual y se mantienen estables durante mucho tiempo. [ 2 ]

Desarrollo embrionario

Cronología de la metilación del ADN en el genoma del ratón . Rojo: línea germinal femenina ; azul: línea germinal masculina; gris: línea celular somática ; CGP: células germinales primordiales ; CMI: masa celular interna .

El genoma del esperma de ratón está metilado en un 80-90% en sus sitios CpG del ADN, lo que equivale a unos 20 millones de sitios metilados. Tras la fecundación , el cromosoma paterno se desmetila casi por completo en seis horas mediante un proceso activo, antes de la replicación del ADN (línea azul en la figura). En el ovocito maduro , alrededor del 40% de sus sitios CpG están metilados. La desmetilación del cromosoma materno se produce principalmente por el bloqueo de las enzimas metilantes que actúan sobre el ADN de origen materno y por la dilución del ADN materno metilado durante la replicación (línea roja en la figura). La mórula (en la etapa de 16 células) presenta solo una pequeña cantidad de metilación del ADN (línea negra en la figura). La metilación comienza a aumentar a los 3,5 días después de la fecundación en el blastocisto , y luego ocurre una gran ola de metilación entre los días 4,5 y 5,5 en el epiblasto , pasando del 12% al 62% de metilación, y alcanzando el nivel máximo después de la implantación en el útero. [ 3 ] Al séptimo día después de la fecundación, las células germinales primordiales (CGP) recién formadas en el embrión implantado se separan de las células somáticas restantes . En este punto, las CGP tienen aproximadamente el mismo nivel de metilación que las células somáticas.

Las células germinales primordiales (CGP) recién formadas en el embrión implantado se diferencian de las células somáticas. En este punto, las CGP presentan altos niveles de metilación. Estas células migran desde el epiblasto hacia la cresta gonadal . A continuación, las células proliferan rápidamente y comienzan la desmetilación en dos oleadas. En la primera oleada, la desmetilación se produce por dilución replicativa, mientras que en la segunda se produce mediante un proceso activo. La segunda oleada conduce a la desmetilación de loci específicos . En este punto, los genomas de las CGP muestran los niveles más bajos de metilación del ADN de todas las células en todo el ciclo de vida [en el día embrionario 13,5 (E13,5), véase la segunda figura de esta sección]. [ 4 ]

Dinámica de la metilación del ADN durante el desarrollo embrionario del ratón

Tras la fecundación, algunas células del embrión recién formado migran a la cresta germinal y, finalmente, se convertirán en las células germinales (espermatozoides y ovocitos) de la siguiente generación. Debido al fenómeno de la impronta genómica , los genomas materno y paterno se marcan de forma diferencial y deben reprogramarse adecuadamente cada vez que pasan por la línea germinal. Por lo tanto, durante el proceso de gametogénesis , las células germinales primordiales deben borrar sus patrones de metilación del ADN biparentales originales y restablecerlos según el sexo del progenitor transmisor.

Tras la fecundación, los genomas paterno y materno se desmetilan para borrar sus marcas epigenéticas y adquirir totipotencia . En este punto se observa asimetría: el pronúcleo masculino experimenta una desmetilación rápida y activa, mientras que el pronúcleo femenino se desmetila pasivamente durante las divisiones celulares sucesivas. El proceso de desmetilación del ADN implica la reparación por escisión de bases y probablemente otros mecanismos de reparación del ADN. [ 5 ] A pesar de la naturaleza global de este proceso, existen ciertas secuencias que lo evitan, como las regiones diferencialmente metiladas (DMRS) asociadas a genes improntados, retrotransposones y heterocromatina centromérica . La remetilación es necesaria nuevamente para diferenciar el embrión en un organismo completo. [ 6 ]

Se ha demostrado que la manipulación in vitro de embriones preimplantacionales altera los patrones de metilación en los loci improntados [ 7 ] y desempeña un papel crucial en los animales clonados. [ 8 ]

Aprendizaje y memoria

Regiones cerebrales implicadas en la formación de la memoria

El aprendizaje y la memoria tienen niveles de permanencia, a diferencia de otros procesos mentales como el pensamiento, el lenguaje y la conciencia, que son de naturaleza temporal. El aprendizaje y la memoria pueden acumularse lentamente (tablas de multiplicar) o rápidamente (tocar una estufa caliente), pero una vez adquiridos, pueden recordarse para su uso consciente durante mucho tiempo. Las ratas sometidas a una instancia de condicionamiento de miedo contextual crean una memoria a largo plazo especialmente fuerte. A las 24 h después del entrenamiento, se encontró que el 9,17 % de los genes en los genomas de las neuronas del hipocampo de la rata estaban diferencialmente metilados . Esto incluía más de 2000 genes diferencialmente metilados a las 24 h después del entrenamiento, con más de 500 genes desmetilados. [ 9 ] La región del hipocampo del cerebro es donde se almacenan por primera vez los recuerdos de miedo contextual (ver figura del cerebro, esta sección), pero este almacenamiento es transitorio y no permanece en el hipocampo. En ratas, el condicionamiento del miedo contextual se anula cuando el hipocampo se somete a una hipocampectomía tan solo 1 día después del condicionamiento, pero las ratas conservan una cantidad considerable de miedo contextual cuando se impone un retraso prolongado (28 días) entre el momento del condicionamiento y el momento de la hipocampectomía. [ 10 ]

Etapas moleculares

Se requieren tres etapas moleculares para reprogramar el metiloma del ADN . Etapa 1: Reclutamiento. Las enzimas necesarias para la reprogramación se reclutan en los sitios del genoma que requieren desmetilación o metilación. Etapa 2: Implementación. Se llevan a cabo las reacciones enzimáticas iniciales. En el caso de la metilación, este es un paso corto que resulta en la metilación de la citosina a 5-metilcitosina . Etapa 3: Reparación del ADN por escisión de bases . Los productos intermedios de la desmetilación son catalizados por enzimas específicas de la vía de reparación del ADN por escisión de bases que finalmente restauran la cistosina en la secuencia de ADN.

Desmetilación de 5-metilcitosina. Desmetilación de 5-metilcitosina (5mC) en el ADN neuronal. Como se revisó en 2018, [ 11 ] en las neuronas cerebrales, la 5mC es oxidada por una dioxigenasa TET para generar 5-hidroximetilcitosina (5hmC). En pasos sucesivos, una enzima TET hidroxila aún más la 5hmC para generar 5-formilcitosina (5fC) y 5-carboxilcitosina (5caC). La timidina-ADN glicosilasa (TDG) reconoce las bases intermedias 5fC y 5caC y escinde el enlace glucosídico dando como resultado un sitio apirimidínico (sitio AP). En una vía de desaminación oxidativa alternativa, el 5hmC puede ser desaminado oxidativamente por el complejo de edición de ARNm de la citidina desaminasa inducida por actividad/apolipoproteína B (AID/APOBEC) para formar 5-hidroximetiluracilo (5hmU). El 5mC también puede convertirse en timina (Thy). El 5hmU puede ser escindido por TDG, la uracilo-ADN glicosilasa 1 monofuncional selectiva de cadena simple (SMUG1), la ADN glicosilasa 1 tipo Nei (NEIL1) o la proteína de unión a metil-CpG 4 (MBD4). Los sitios AP y los desajustes T:G son reparados por enzimas de reparación por escisión de bases (BER) para producir citosina (Cyt).

La figura en esta sección indica las funciones centrales de las dioxigenasas de metilcitosina de translocación diez-once (TET) en la desmetilación de 5-metilcitosina para formar citosina. [ 12 ] Como se revisó en 2018, [ 12 ] 5mC es muy a menudo oxidada inicialmente por las dioxigenasas TET para generar 5-hidroximetilcitosina (5hmC). En pasos sucesivos (ver figura) las enzimas TET hidroxilan aún más 5hmC para generar 5-formilcitosina (5fC) y 5-carboxilcitosina (5caC). La timidina-ADN glicosilasa (TDG) reconoce las bases intermedias 5fC y 5caC y escinde el enlace glucosídico dando como resultado un sitio apirimidínico (sitio AP). En una vía alternativa de desaminación oxidativa, la 5hmC puede ser desaminada oxidativamente por las desaminasas APOBEC (AID/APOBEC) para formar 5-hidroximetiluracilo (5hmU), o bien, la 5mC puede convertirse en timina (Thy). La 5hmU puede ser escindida por TDG, SMUG1 , NEIL1 o MBD4 . Los sitios AP y los desajustes T:G son reparados posteriormente por las enzimas de reparación por escisión de bases (BER) para producir citosina (Cyt).

Familia TET

Las isoformas de las enzimas TET incluyen al menos dos isoformas de TET1, una de TET2 y tres isoformas de TET3 . [ 13 ] [ 14 ] La isoforma canónica completa de TET1 parece estar prácticamente restringida a embriones tempranos, células madre embrionarias y células germinales primordiales (CGP). La isoforma dominante de TET1 en la mayoría de los tejidos somáticos, al menos en el ratón, surge del uso de promotores alternativos que dan lugar a un transcrito corto y una proteína truncada denominada TET1s. Las isoformas de TET3 son la forma completa TET3FL, una variante de empalme de forma corta TET3s y una forma que se encuentra en ovocitos y neuronas denominada TET3o. TET3o se crea por el uso de promotores alternativos y contiene un primer exón N-terminal adicional que codifica para 11 aminoácidos . TET3o solo se encuentra en ovocitos y neuronas, y no se expresó en células madre embrionarias ni en ningún otro tipo celular o tejido de ratón adulto analizado. Mientras que la expresión de TET1 apenas se detecta en ovocitos y cigotos, y la de TET2 es moderada, la variante TET3o muestra niveles de expresión extremadamente altos en ovocitos y cigotos, pero está prácticamente ausente en la etapa de dos células. Es posible que TET3o, presente en altas concentraciones en neuronas, ovocitos y cigotos en la etapa de una célula, sea la principal enzima TET utilizada cuando se producen desmetilaciones rápidas a gran escala en estas células.

Reclutamiento de TET para ADN

Las enzimas TET no se unen específicamente a la 5-metilcitosina excepto cuando son reclutadas. Sin reclutamiento ni direccionamiento, TET1 se une predominantemente a promotores con alto contenido de CG e islas CpG (CGI) en todo el genoma mediante su dominio CXXC, que puede reconocer CGI no metiladas . [ 15 ] TET2 no tiene afinidad por la 5-metilcitosina en el ADN. [ 16 ] El dominio CXXC de la TET3 de longitud completa, que es la forma predominante expresada en las neuronas, se une con mayor fuerza a los CpG donde la C se convirtió en 5-carboxicitosina (5caC). Sin embargo, también se une a los CpG no metilados . [ 14 ]

Iniciación de la desmetilación del ADN en un sitio CpG . En las células somáticas adultas, la metilación del ADN ocurre típicamente en el contexto de dinucleótidos CpG ( sitios CpG ), formando 5-metilcitosina -pG (5mCpG). Las especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden atacar la guanina en el sitio del dinucleótido, formando 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG), lo que resulta en un sitio de dinucleótido 5mCp-8-OHdG. La enzima de reparación por escisión de bases OGG1 se dirige a 8-OHdG y se une a la lesión sin escisión inmediata. OGG1, presente en un sitio 5mCp-8-OHdG, recluta a TET1 y TET1 oxida la 5mC adyacente a la 8-OHdG. Esto inicia la desmetilación de 5mC [ 17 ] como se muestra en la figura anterior.

Para que una enzima TET inicie la desmetilación, primero debe ser reclutada a un sitio CpG metilado en el ADN. Dos de las proteínas que reclutan una enzima TET a una citosina metilada en el ADN son OGG1 (véase la figura Iniciación de la desmetilación del ADN) [ 17 ] y EGR1 [ 18 ] .

OGG1

La oxoguanina glicosilasa (OGG1) cataliza el primer paso en la reparación por escisión de bases de la base dañada oxidativamente 8-OHdG . OGG1 encuentra 8-OHdG deslizándose a lo largo del ADN lineal a 1000 pares de bases de ADN en 0,1 segundos. [ 19 ] OGG1 encuentra 8-OHdG muy rápidamente. Las proteínas OGG1 se unen al ADN dañado oxidativamente con un tiempo de semimáximo de aproximadamente 6 segundos. [ 20 ] Cuando OGG1 encuentra 8-OHdG, cambia de conformación y forma un complejo con 8-OHdG en el bolsillo de unión de OGG1. [ 21 ] OGG1 no actúa inmediatamente para eliminar el 8-OHdG. La eliminación de la mitad del máximo de 8-OHdG tarda aproximadamente 30 minutos en células HeLa in vitro , [ 22 ] o aproximadamente 11 minutos en los hígados de ratones irradiados . [ 23 ] La oxidación del ADN por especies reactivas de oxígeno ocurre preferentemente en una guanina en un sitio CpG metilado, debido a un potencial de ionización reducido de las bases de guanina adyacentes a la 5-metilcitosina. [ 24 ] TET1 se une (es reclutado) a OGG1 unido a 8-OHdG (ver figura). [ 17 ] Esto probablemente permite que TET1 desmetile una citosina metilada adyacente. Cuando las células epiteliales mamarias humanas (MCF-10A) fueron tratadas con H 2 O 2 , el 8-OHdG aumentó en el ADN en 3,5 veces y esto causó una desmetilación a gran escala de la 5-metilcitosina a aproximadamente el 20% de su nivel inicial en el ADN. [ 17 ]

EGR1

El gen proteína de respuesta de crecimiento temprano 1 ( EGR1 ) es un gen de respuesta temprana inmediata (IEG). La característica definitoria de los IEG es la regulación positiva rápida y transitoria —en cuestión de minutos— de sus niveles de ARNm independientemente de la síntesis de proteínas. [ 25 ] EGR1 puede ser inducido rápidamente por la actividad neuronal. [ 26 ] En la edad adulta, EGR1 se expresa ampliamente en todo el cerebro, manteniendo niveles de expresión basales en varias áreas clave del cerebro, incluyendo la corteza prefrontal medial , el cuerpo estriado , el hipocampo y la amígdala . [ 25 ] Esta expresión está vinculada al control de la cognición, la respuesta emocional, el comportamiento social y la sensibilidad a la recompensa. [ 25 ] EGR1 se une al ADN en sitios con los motivos 5′-GCGTGGGCG-3′ y 5'-GCGGGGGCGG-3′ y estos motivos se encuentran principalmente en las regiones promotoras de los genes. [ 26 ] La isoforma corta TET1s se expresa en el cerebro. EGR1 y TET1s forman un complejo mediado por las regiones C-terminales de ambas proteínas, independientemente de su asociación con el ADN. [ 26 ] EGR1 recluta a TET1s a las regiones genómicas que flanquean los sitios de unión de EGR1. [ 26 ] En presencia de EGR1, TET1s es capaz de desmetilar locus-específicamente y activar la expresión de genes posteriores regulados por EGR1. [ 26 ]

Historia

Las primeras investigaciones sobre reprogramación implicaban el uso de inducción hormonal para diferenciar células en otras formas. En 1960, la bióloga vegetal Mary Clutter demostró que el tejido vascular de las plantas de tabaco podía alterarse forzosamente de esta manera. [ 27 ] En 1961 anunció que había utilizado el mismo proceso para convertir células del floema en células del xilema . [ 28 ] La primera persona en demostrar con éxito la reprogramación en células animales fue John Gurdon , quien en 1962 demostró que las células somáticas diferenciadas podían reprogramarse de nuevo a un estado embrionario cuando logró obtener renacuajos nadadores tras la transferencia de células epiteliales intestinales diferenciadas a huevos de rana enucleados. [ 29 ] Por este logro recibió el Premio Nobel de Medicina de 2012 junto con Shinya Yamanaka . [ 30 ] Yamanaka fue el primero en demostrar (en 2006) que este proceso de transferencia nuclear de células somáticas o reprogramación basada en ovocitos (véase más adelante), descubierto por Gurdon, podía ser recapitulado (en ratones) por factores definidos ( Oct4 , Sox2 , Klf4 y c-Myc ) para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSC). [ 31 ] También se han utilizado otras combinaciones de genes, incluyendo LIN25 [ 32 ] y la proteína homeobox NANOG . [ 32 ] [ 33 ]

Fases de reprogramación

Con el descubrimiento de que el destino celular podía alterarse, la pregunta de qué progresión de eventos ocurre indica que una célula está experimentando una reprogramación. Dado que el producto final de la reprogramación de iPSC era similar en morfología , proliferación, expresión génica , pluripotencia y actividad de la telomerasa , se utilizaron marcadores genéticos y morfológicos para determinar qué fase de la reprogramación estaba ocurriendo. [ 34 ] La reprogramación se define en tres fases: iniciación, maduración y estabilización. [ 35 ]

Iniciación

La fase de iniciación se asocia con la regulación negativa de genes específicos del tipo celular y la regulación positiva de genes de pluripotencia. [ 35 ] A medida que las células se acercan a la pluripotencia, la actividad de la telomerasa se reactiva para extender los telómeros . La morfología celular puede afectar directamente el proceso de reprogramación, ya que la célula se modifica para prepararse para la expresión génica de la pluripotencia. [ 36 ] El principal indicador de que la fase de iniciación ha finalizado es la expresión de los primeros genes asociados a la pluripotencia. Esto incluye la expresión de Oct-4 o la proteína homeobox NANOG , mientras se produce una transición mesenquimal-epitelial (TME), y la pérdida de la apoptosis y la senescencia . [ 37 ]

Si la célula se reprograma directamente de una célula somática a otra, los genes asociados con cada tipo de célula comienzan a regularse al alza y a la baja según corresponda. [ 35 ] Esto puede ocurrir mediante la reprogramación celular directa o mediante la creación de un intermediario, como una iPSC, y su diferenciación en el tipo de célula deseado. [ 37 ]

La fase de iniciación se completa a través de una de tres vías: transferencia nuclear , fusión celular o factores definidos ( microARN , factor de transcripción , marcadores epigenéticos y otras moléculas pequeñas). [ 32 ] [ 37 ]

Transferencia nuclear de células somáticas

Transferencia nuclear de células somáticas . El núcleo de una célula somática se transfiere a un ovocito al que se le ha extraído su núcleo original. [ 38 ] Ese ovocito incorporará el material genético de la célula somática y se dividirá en una célula totipotente. [ 37 ]

Un ovocito puede reprogramar un núcleo adulto a un estado embrionario después de la transferencia nuclear de células somáticas , de modo que se pueda desarrollar un nuevo organismo a partir de dicha célula. [ 38 ]

La reprogramación es distinta del desarrollo de un epitipo somático , [ 39 ] ya que los epitipos somáticos pueden alterarse potencialmente después de que un organismo haya abandonado la etapa de desarrollo de la vida. [ 40 ] Durante la transferencia nuclear de células somáticas, el ovocito desactiva los genes específicos de tejido en el núcleo de la célula somática y vuelve a activar los genes específicos embrionarios. Este proceso se ha demostrado mediante la clonación, como se observa en John Gurdon con los renacuajos [ 29 ] y la oveja Dolly . [ 41 ] Cabe destacar que estos eventos han demostrado que el destino celular es un proceso reversible.

Fusión celular

Fusión celular . Dos células pueden fusionarse y compartir ADN nuclear, creando un heterocarionte , que luego puede fusionarse mediante nucleasa, creando un híbrido. [ 37 ]

[ 37 ] La fusión celularse utiliza para crear una célula multinucleada llamadaheterocarionte. [ 37 ] Las células fusionadas permiten que genes que de otro modo estarían silenciados se reactiven y se expresen. A medida que los genes se reactivan, las células pueden rediferenciarse. Hay casos en los que todavía se necesitan factores de transcripción, como los factores de Yamanaka, para ayudar en laheterocarionte. [ 42 ]

Factores definidos

Factores definidos. La adición de microARN , factores de transcripción , marcadores epigenéticos y otras moléculas pequeñas, o una combinación de estos, puede inducir la reprogramación celular al provocar la expresión de otros genes. [ 32 ] [ 37 ]

A diferencia de la transferencia nuclear y la fusión celular, los factores definidos no requieren un genoma completo, solo factores de reprogramación. Estos factores de reprogramación incluyen microARN , factores de transcripción , marcadores epigenéticos y otras moléculas pequeñas. [ 37 ] Los factores de transcripción originales, que conducen al desarrollo de iPSC, descubiertos por Yamanaka incluyen Oct4 , Sox2 , Klf4 y c-Myc (factores OSKM). [ 31 ] [ 34 ] Aunque se ha demostrado que los factores OSKM inducen y ayudan en la pluripotencia, otros factores de transcripción como la proteína homeobox NANOG , [ 43 ] LIN25, [ 32 ] TRA-1-60, [ 43 ] y C/EBPα [ 44 ] ayudan en la eficiencia de la reprogramación. El uso de microARN y otros procesos impulsados ​​por moléculas pequeñas se ha utilizado como un medio para aumentar la eficiencia de la diferenciación de células somáticas a pluripotencia. [ 37 ]

Maduración

La fase de maduración comienza al final de la fase de iniciación, cuando se expresan los primeros genes pluripotentes. [ 35 ] La célula se prepara para ser independiente de los factores definidos que iniciaron el proceso de reprogramación. Los primeros genes que se detectan en las iPSC son Oct4 , la proteína homeobox NANOG y Esrrb, seguidos posteriormente por Sox2 . [ 37 ] En las etapas posteriores de la maduración, el silenciamiento del transgén marca el inicio de la independencia de la célula respecto del factor de transcripción inducido . Una vez que la célula es independiente, finaliza la fase de maduración y comienza la fase de estabilización.

Como la eficiencia de la reprogramación ha demostrado ser un proceso variable y de baja eficiencia, no todas las células completan la fase de maduración y alcanzan la pluripotencia . [ 44 ] Algunas células que se someten a reprogramación aún permanecen en apoptosis al comienzo de la etapa de maduración debido al estrés oxidativo provocado por el cambio en la expresión génica. El uso de microARN , proteínas y diferentes combinaciones de los factores OSKM ha comenzado a conducir a una mayor tasa de eficiencia de reprogramación.

Estabilización

La fase de estabilización se refiere a los procesos celulares que ocurren después de que la célula alcanza la pluripotencia . Un marcador genético es la expresión de Sox2 y la reactivación del cromosoma X , mientras que los cambios epigenéticos incluyen la extensión de los telómeros por la telomerasa [ 32 ] y la pérdida de la memoria epigenética celular. [ 35 ] La memoria epigenética de una célula se restablece mediante cambios en la metilación del ADN, [ 45 ] utilizando la citidina desaminasa inducida por activación (AID), las enzimas TET (TET) y la ADN metiltransferasa (DMNT), comenzando en la fase de maduración y en la etapa de estabilización. [ 35 ] Una vez que se pierde la memoria epigenética de la célula, se logra la posibilidad de diferenciación en las tres capas germinales. [ 34 ] Esta se considera una célula completamente reprogramada, ya que puede ser pasada sin revertir a su tipo celular somático original. [ 37 ]

En sistemas de cultivo celular

Las células madre se definen como células indiferenciadas que pueden diferenciarse en las tres capas germinales . La capacidad de autorrenovación, mediante la telomerasa que alarga los telómeros de los cromosomas , permite que la población de células madre se mantenga constante. A medida que las células madre pluripotentes inducidas se cultivan, la memoria epigenética de las células disminuye y estas tienden gradualmente a diferenciarse en cualquier tipo celular en lugar del tipo celular somático original. [ 35 ]

La reprogramación también puede inducirse artificialmente mediante la introducción de factores exógenos, generalmente factores de transcripción . En este contexto, suele referirse a la creación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células maduras, como los fibroblastos adultos . Esto permite la producción de células madre para la investigación biomédica , como la investigación en terapias con células madre , sin el uso de embriones. Se lleva a cabo mediante la transfección de genes asociados a células madre en células maduras utilizando vectores virales como los retrovirus .

Factores de transcripción

Uno de los primeros factores de transcripción descubiertos que modifican una célula se halló en un mioblasto cuando se expresó el ADN complementario (ADNc) que codifica para MyoD , transformando un fibroblasto en un mioblasto. Otro factor de transcripción que transforma directamente una célula linfoide en una célula mieloide es C/EBPα. MyoD y C/EBPα son ejemplos de un pequeño número de factores individuales capaces de transformar células. Con mayor frecuencia, una combinación de factores de transcripción actúa conjuntamente para reprogramar una célula.

OSKM

Los factores OSKM ( Oct4 , Sox2 , Klf4 y c-Myc ) fueron descubiertos inicialmente por Yamanaka en 2006, mediante la inducción de fibroblastos de ratón en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). [ 31 ] Al año siguiente, estos factores se utilizaron para inducir fibroblastos humanos en iPSC. [ 34 ]

Oct4 forma parte de los genes reguladores esenciales para la pluripotencia, como se observa tanto en células madre embrionarias como en tumores. [ 46 ] Incluso en pequeñas cantidades, el uso de Oct4 permite iniciar la diferenciación hacia la pluripotencia. Oct4 actúa en conjunto con Sox2 para la expresión de FGF4, lo que podría favorecer la diferenciación.

Sox2 es un gen utilizado para mantener la pluripotencia en las células madre. Oct4 y Sox2 trabajan juntos para regular cientos de genes utilizados en la pluripotencia. [ 46 ] Sin embargo, Sox2 no es el único miembro posible de la familia Sox que participa en la regulación genética con Oct4:  Sox4 , Sox11 y Sox15 también participan, ya que la proteína Sox es redundante en todo el genoma de la célula madre .

Klf4 es un factor de transcripción utilizado en la proliferación , diferenciación , apoptosis y reprogramación de células somáticas . Cuando se utiliza en la reprogramación celular, Klf4 previene la división celular de las células dañadas mediante su capacidad apoptótica y ayuda en la actividad de la histona acetiltransferasa . [ 34 ]

c-Myc también se conoce como un oncogén y, en ciertas condiciones, puede causar cáncer. [ 47 ] En la reprogramación celular, c-Myc se utiliza para la progresión del ciclo celular , la apoptosis y la transformación celular para una mayor diferenciación. Debido a las propiedades oncogénicas de c-Myc, la evidencia indica que expresar solo Oct4, Sox2 y Klf4 (OSK) y combinarlo con la terapia génica TERT es un método más seguro y eficiente para la reprogramación in vivo para retrasar el envejecimiento . [ 48 ]

NANOG

La proteína homeobox NANOG (NANOG) es un factor de transcripción que se utiliza para ayudar a la eficiencia de la generación de iPSC al mantener la pluripotencia [ 49 ] y suprimir los factores de determinación celular . [ 50 ] NANOG funciona promoviendo la accesibilidad de la cromatina a través de la represión de marcadores de histonas , como H3K27me3 . NANOG ayuda al reclutamiento de Oct4 , Sox2 y Esrrb utilizados en la transcripción , mientras que también recluta el gen relacionado con Brahma-1 (BRG1) para la accesibilidad de la cromatina .

C/EBPα

CEBPA es un factor comúnmente utilizado en la reprogramación de células, no solo en iPSC, sino también en otros tipos celulares. C/EBPα ha demostrado ser un factor transactivador único durante la reprogramación directa de una célula linfoide en una célula mieloide. [ 44 ] C/EBPα se considera un "interventor" que ayuda a preparar la célula para la captación de los factores OSKM y eventos de transcripción específicos. [ 43 ] También se ha demostrado que C/EBPα aumenta la eficiencia de los eventos de reprogramación. [ 35 ]

Variabilidad

Las propiedades de las células obtenidas tras la reprogramación pueden variar significativamente, en particular entre las células iPSC. [ 51 ] Entre los factores que influyen en la variación del rendimiento de la reprogramación y las características funcionales de los productos finales se incluyen el trasfondo genético, la fuente tisular, la estequiometría del factor de reprogramación y los factores de estrés relacionados con el cultivo celular. [ 51 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Reik W, Dean W, Walter J (agosto de 2001). "Reprogramación epigenética en el desarrollo de mamíferos". Science (Revisión). 293 (5532): 1089– 1093. doi : 10.1126/science.1063443 . PMID 11498579 . S2CID 17089710 .  
  2. ↑ Cedar H, Bergman Y (julio de 2012). "Programación de patrones de metilación del ADN" . Annual Review of Biochemistry . 81 : 97–117 . doi : 10.1146/annurev-biochem-052610-091920 . PMID 22404632 . 
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