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Microscopio electrónico

Un microscopio electrónico de transmisión moderno (TITAN) Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza un haz de electrones como fuente de iluminación. Emplea óptica...

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Un microscopio electrónico de transmisión moderno (TITAN)

Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza un haz de electrones como fuente de iluminación. Emplea óptica electrónica , análoga a las lentes de vidrio de un microscopio óptico, para controlar el haz de electrones, por ejemplo, enfocándolo para producir imágenes ampliadas o patrones de difracción de electrones . Dado que la longitud de onda de un electrón puede ser más de 100 000 veces menor que la de la luz visible, los microscopios electrónicos tienen una resolución mucho mayor , de aproximadamente 0,1  nm, en comparación con los aproximadamente 200  nm de los microscopios ópticos . [ 1 ] Microscopio electrónico puede referirse a:

Encontrará información adicional en los enlaces anteriores. Este artículo contiene información general, principalmente sobre microscopios electrónicos de transmisión y de barrido.

Historia

Muchos avances sentaron las bases de la óptica electrónica utilizada en los microscopios. [ 2 ] Un paso significativo fue el trabajo de Hertz en 1883 [ 3 ] quien creó un tubo de rayos catódicos con deflexión electrostática y magnética, demostrando la manipulación de la dirección de un haz de electrones. Otros avances fueron el enfoque de los electrones mediante un campo magnético axial por Emil Wiechert en 1899, [ 4 ] cátodos recubiertos de óxido mejorados que producían más electrones por Arthur Wehnelt en 1905 [ 5 ] y el desarrollo de la lente electromagnética en 1926 por Hans Busch . [ 6 ] Según Dennis Gabor , el físico Leó Szilárd intentó en 1928 convencerlo de construir un microscopio electrónico, para el cual Szilárd había presentado una patente. [ 7 ]

Reproducción de un microscopio electrónico antiguo construido por Ernst Ruska en la década de 1930.

Hasta el día de hoy, la cuestión de quién inventó el microscopio electrónico de transmisión es controvertida. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] En 1928, en la Technische Hochschule de Charlottenburg (ahora Technische Universität Berlin ), Adolf Matthias (profesor de Tecnología de Alta Tensión e Instalaciones Eléctricas) designó a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores para avanzar en la investigación sobre haces de electrones y osciloscopios de rayos catódicos. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, entre ellos Ernst Ruska . En 1931, Max Knoll y Ernst Ruska [ 12 ] [ 13 ] generaron con éxito imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre una abertura de ánodo. El dispositivo, una réplica del cual se muestra en la figura, utilizaba dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, el primer microscopio electrónico. (Max Knoll falleció en 1969, por lo que no recibió parte del Premio Nobel de 1986 por la invención de los microscopios electrónicos).

Aparentemente independiente de este esfuerzo, Reinhold Rüdenberg trabajó en Siemens-Schuckert . Según la ley de patentes (Patentes de EE. UU. n.° 2058914 [ 14 ] y 2070318 [ 15 ] , ambas presentadas en 1932), es el inventor del microscopio electrónico, pero no está claro cuándo dispuso de un instrumento funcional. En un breve artículo de 1932 [ 16 ] , afirmó que Siemens llevaba varios años trabajando en ello antes de que se presentaran las patentes ese mismo año, alegando que su trabajo era paralelo al desarrollo universitario. Falleció en 1961, por lo que, al igual que Max Knoll, no pudo optar al Premio Nobel de 1986 [ 17 ] .

Al año siguiente, 1933, Ruska y Knoll construyeron el primer microscopio electrónico que superó la resolución de un microscopio óptico (de luz). [ 18 ] Cuatro años después, en 1937, Siemens financió el trabajo de Ernst Ruska y Bodo von Borries , y empleó a Helmut Ruska , hermano de Ernst, para desarrollar aplicaciones para el microscopio, especialmente con especímenes biológicos. [ 18 ] [ 19 ] También en 1937, Manfred von Ardenne fue pionero del microscopio electrónico de barrido . [ 20 ] Siemens produjo el primer microscopio electrónico comercial en 1938. [ 21 ] Los primeros microscopios electrónicos norteamericanos se construyeron en la década de 1930, en la Universidad Estatal de Washington por Anderson y Fitzsimmons [ 22 ] y en la Universidad de Toronto por Eli Franklin Burton y los estudiantes Cecil Hall, James Hillier y Albert Prebus. Siemens produjo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) en 1939. [ 23 ] Aunque los microscopios electrónicos de transmisión actuales son capaces de alcanzar una magnificación de dos millones de veces, como instrumentos científicos siguen siendo similares pero con ópticas mejoradas.

En la década de 1940, se desarrollaron microscopios electrónicos de alta resolución, lo que permitió una mayor magnificación y resolución. [ 24 ] En 1965, Albert Crewe, de la Universidad de Chicago, introdujo el microscopio electrónico de transmisión de barrido utilizando una fuente de emisión de campo , [ 25 ] lo que permitió microscopios de barrido de alta resolución. [ 26 ] A principios de la década de 1980, las mejoras en la estabilidad mecánica, así como el uso de voltajes de aceleración más altos, permitieron la obtención de imágenes de materiales a escala atómica. [ 27 ] [ 28 ] En la década de 1980, el cañón de emisión de campo se hizo común para los microscopios electrónicos, mejorando la calidad de la imagen debido a la coherencia adicional y las menores aberraciones cromáticas. La década de 2000 estuvo marcada por avances en la microscopía electrónica con corrección de aberraciones, lo que permitió mejoras significativas en la resolución y la claridad de las imágenes. [ 29 ] [ 30 ]

Tipos de microscopios electrónicos

Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de transmisión

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Microscopio electrónico de transmisión

La forma original del microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión (TEM), utiliza un haz de electrones de alto voltaje para iluminar la muestra y crear una imagen. Este haz se produce mediante un cañón de electrones , cuyos electrones suelen tener energías comprendidas entre 20 y 400 keV. Los electrones se enfocan mediante lentes electromagnéticas y se transmiten a través de una muestra delgada. Al emerger de la muestra, el haz de electrones contiene información sobre su estructura, que posteriormente es magnificada por las lentes del microscopio. La variación espacial de esta información (la "imagen") se puede observar proyectando la imagen electrónica magnificada sobre un detector . Por ejemplo, un operador puede visualizar la imagen directamente mediante una pantalla fluorescente recubierta con un fósforo o un material centelleador , como el sulfuro de zinc . Más comúnmente, un fósforo de alta resolución se acopla, mediante un sistema óptico de lentes o una guía de luz de fibra óptica , al sensor de una cámara digital . Otro enfoque consiste en utilizar un detector de electrones directo que no tiene centelleador, lo que resuelve algunas de las limitaciones de las cámaras acopladas a centelleadores. [ 31 ]

Durante muchos años, la resolución de los TEM estuvo limitada por las aberraciones de la óptica electrónica, principalmente la aberración esférica . En los instrumentos más recientes, los correctores de hardware pueden reducir la aberración esférica y otras aberraciones, mejorando la resolución en la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) a menos de 0,5 angstroms (50 picómetros ), [ 32 ] lo que permite aumentos de más de 50 millones de veces. [ 33 ] La capacidad de la HRTEM para determinar las posiciones de los átomos dentro de los materiales es útil para muchas áreas de investigación y desarrollo. [ 34 ]

Microscopio electrónico de barrido (MEB)

Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de barrido

Un microscopio electrónico de barrido (SEM) produce imágenes al sondear la muestra con un haz de electrones enfocado que la recorre ( barrido raster ). Cuando el haz de electrones interactúa con la muestra, pierde energía y se dispersa en diferentes direcciones mediante diversos mecanismos. Estas interacciones dan lugar, entre otros fenómenos, a la emisión de electrones secundarios de baja energía y electrones retrodispersados ​​de alta energía, emisión de luz ( catodoluminiscencia ) o emisión de rayos X. Todas estas señales contienen información sobre la muestra, como la topografía y la composición de la superficie. La imagen que se muestra al usar un SEM representa la variación en la intensidad de cualquiera de estas señales. En estas imágenes, cada posición corresponde a una posición del haz sobre la muestra en el momento en que se generó la señal. [ 35 ] : 1–15

TESCAN S8000X SEM

Los microscopios electrónicos de barrido (SEM) se diferencian de los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) en que utilizan electrones con energías mucho menores, generalmente inferiores a 20 keV, [ 36 ] mientras que los TEM suelen utilizar electrones con energías comprendidas entre 80 y 300 keV. [ 37 ] Por lo tanto, las fuentes de electrones y la óptica de ambos microscopios tienen diseños diferentes y, por lo general, son instrumentos separados. [ 38 ]

Microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM)

Un microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM) combina características de un microscopio electrónico de transmisión (TEM) y un microscopio electrónico de barrido (SEM) al barrer una muestra con una sonda incidente enfocada, pero ahora utilizando principalmente los electrones que se transmiten a través de la muestra. Muchos tipos de imágenes son comunes a ambos microscopios, pero algunos, como la imagen de campo oscuro anular y otras técnicas analíticas, son mucho más fáciles de realizar con mayor resolución espacial en un instrumento STEM. Una desventaja es que los datos de imagen se adquieren en serie en lugar de en paralelo. [ 35 ] : 75–138

Modos de funcionamiento principales

Imagen de una hormiga en un microscopio electrónico de barrido (SEM).

Los métodos más comunes para obtener imágenes en un microscopio electrónico consisten en seleccionar diferentes direcciones para los electrones que atraviesan la muestra, y/o electrones de diferentes energías. Existen numerosos métodos para lograrlo, aunque no todos son de uso común.

electrones secundarios

Volumen de interacción electrón-materia y tipos de señal generada en un microscopio electrónico de barrido (SEM).

En un microscopio electrónico de barrido (SEM), las señales resultan de las interacciones del haz de electrones con los átomos dentro de la muestra. El modo más común es utilizar los electrones secundarios (SE) para producir imágenes. Los electrones secundarios tienen energías muy bajas, del orden de 50 eV , lo que limita su recorrido libre medio en materia sólida a unos pocos nanómetros por debajo de la superficie de la muestra. [ 39 ] Los electrones son detectados por un detector Everhart-Thornley , [ 40 ] que es un tipo de sistema colector- centelleador - fotomultiplicador . La señal de los electrones secundarios tiende a estar altamente localizada en el punto de impacto del haz de electrones primario, lo que permite obtener imágenes de la superficie de la muestra con una resolución mejor que 1 nm y con instrumentos especializados a escala atómica. [ 41 ]

El brillo de la señal depende del número de electrones secundarios que llegan al detector . Si el haz incide perpendicularmente sobre la superficie de la muestra, los electrones salen simétricamente respecto al eje del haz. A medida que aumenta el ángulo de incidencia, el volumen de interacción desde el que se propagan aumenta y la distancia de "escape" desde un lado del haz disminuye, lo que provoca que se emitan más electrones secundarios desde la muestra. Por lo tanto, las superficies y los bordes pronunciados tienden a ser más brillantes que las superficies planas, lo que da como resultado imágenes con una apariencia tridimensional bien definida, similar a la de una imagen de luz reflejada. [ 39 ]

electrones retrodispersados

Los electrones retrodispersados ​​(BSE) son aquellos que se emiten desde la muestra debido a las interacciones entre el haz y la muestra, donde los electrones experimentan dispersión elástica e inelástica . Convencionalmente, se definen como aquellos con energías comprendidas entre 50 eV y la energía del haz primario. Los electrones retrodispersados ​​pueden utilizarse tanto para la obtención de imágenes como para la formación de imágenes de difracción de electrones retrodispersados ​​(EBSD), las cuales pueden emplearse para determinar la cristalografía de la muestra. [ 39 ]

Patrón de difracción de electrones retrodispersados ​​para cristales de silicio monocristalino (001) tomado a 20 kV utilizando un detector Oxford S2.

Los elementos pesados ​​(de alto número atómico) retrodispersan los electrones con mayor intensidad que los elementos ligeros (de bajo número atómico), por lo que aparecen más brillantes en la imagen. Por consiguiente, las imágenes BSE pueden utilizarse para detectar áreas con diferentes composiciones químicas. [ 39 ] Para optimizar la señal, se colocan detectores de electrones retrodispersados ​​específicos sobre la muestra en una disposición tipo "rosquilla", concéntrica con el haz de electrones, maximizando así el ángulo sólido de captación. Los detectores BSE suelen ser de tipo centelleador o semiconductor. Cuando todas las partes del detector se utilizan para captar electrones simétricamente alrededor del haz, se produce un contraste de número atómico. Sin embargo, se produce un fuerte contraste topográfico al captar los electrones retrodispersados ​​desde un lado sobre la muestra utilizando un detector BSE direccional y asimétrico; el contraste resultante aparece como si la topografía estuviera iluminada desde ese lado. Los detectores semiconductores pueden fabricarse en segmentos radiales que pueden activarse o desactivarse para controlar el tipo de contraste producido y su direccionalidad. [ 39 ]

Imágenes de contraste por difracción

El contraste por difracción utiliza la variación en la dirección de los electrones difractados o en su amplitud, o ambas, en función de la posición, como mecanismo de contraste. Es uno de los métodos más sencillos para obtener imágenes en un microscopio electrónico de transmisión y se utiliza ampliamente.

La idea consiste en utilizar una apertura del objetivo debajo de la muestra y seleccionar solo una o varias direcciones de difracción diferentes, para luego usarlas para formar una imagen. Cuando la apertura incluye la dirección del haz incidente, las imágenes se denominan de campo claro , ya que en ausencia de cualquier muestra el campo de visión sería uniformemente brillante. Cuando la apertura excluye el haz incidente, las imágenes se denominan de campo oscuro , ya que, de manera similar, sin una muestra la imagen sería uniformemente oscura. [ 42 ] [ 43 ] Una variante de esto se denomina microscopía de campo oscuro de haz débil y puede utilizarse para obtener imágenes de alta resolución de defectos como dislocaciones. [ 44 ]

Imágenes de alta resolución

Imagen de alta resolución de CuTe

En la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (también llamada a veces microscopía electrónica de alta resolución), se permite que varios haces difractados diferentes atraviesen la apertura del objetivo. Estos interfieren, dando lugar a imágenes que representan la estructura atómica del material. Estas imágenes pueden incluir la dirección del haz incidente o, en el caso de los microscopios electrónicos de transmisión de barrido, suelen corresponder a un rango de haces difractados, excluyendo el haz incidente. [ 28 ] Dependiendo del grosor de las muestras y de las aberraciones del microscopio, estas imágenes pueden interpretarse directamente en términos de las posiciones de las columnas de átomos o requerir un análisis más cuidadoso mediante cálculos de la dispersión múltiple de los electrones [ 45 ] y el efecto de la función de transferencia de contraste del microscopio. [ 46 ]

Existen muchas otras variantes de imágenes que también pueden proporcionar información a nivel atómico. La holografía electrónica utiliza la interferencia de electrones que han atravesado la muestra y un haz de referencia. [ 47 ] La microscopía electrónica de transmisión de barrido 4D (4D STEM) recopila datos de difracción en cada punto mediante un instrumento de escaneo y luego los procesa para producir diferentes tipos de imágenes. [ 48 ]

microanálisis de rayos X

Espectro EDS de la costra mineral del camarón de ventilación Rimicaris exoculata [ 49 ] La mayoría de estos picos son líneas K-alfa y K-beta . Un pico es de la concha L de hierro.

El microanálisis de rayos X es un método para obtener información química local dentro de microscopios electrónicos de todo tipo, aunque se utiliza con mayor frecuencia en instrumentos de barrido. Cuando los electrones de alta energía interactúan con los átomos, pueden expulsar electrones, particularmente aquellos en las capas internas y los electrones del núcleo . Estos se llenan entonces con electrones de valencia , y la diferencia de energía entre los estados de valencia y del núcleo se puede convertir en rayos X que son detectados por un espectrómetro. Las energías de estos rayos X son algo específicas para la especie atómica, por lo que se puede investigar la química local. [ 39 ]

EELS

Espectro experimental de pérdida de energía de electrones, que muestra las características principales: pico de pérdida cero, picos de plasmones y borde de pérdida del núcleo.

De forma similar al microanálisis de rayos X, las energías de los electrones que se han transmitido a través de una muestra pueden analizarse y proporcionar información que abarca desde detalles de la estructura electrónica local hasta información química. [ 50 ]

Difracción de electrones

Los microscopios electrónicos de transmisión se pueden utilizar en modo de difracción de electrones, donde se produce un mapa de los ángulos de los electrones que salen de la muestra. Las ventajas de la difracción de electrones sobre la cristalografía de rayos X radican principalmente en el tamaño de los cristales. En la cristalografía de rayos X, los cristales suelen ser visibles a simple vista y generalmente tienen cientos de micrómetros de longitud. En comparación, los cristales para la difracción de electrones deben tener menos de unos pocos cientos de nanómetros de espesor y no tienen un límite inferior de tamaño. Además, la difracción de electrones se realiza en un TEM, que también se puede utilizar para obtener otros tipos de información, en lugar de requerir un instrumento aparte. [ 51 ] [ 37 ]

Variaciones en CBED con el espesor para Si (001)

Existen muchas variantes de la difracción de electrones, dependiendo del tipo exacto de condiciones de iluminación utilizadas. Si se utiliza un haz paralelo con una apertura para limitar la región expuesta a los electrones, normalmente se observan patrones de difracción nítidos, una técnica denominada difracción de electrones de área seleccionada . Esta suele ser la técnica principal utilizada. Otro enfoque común utiliza iluminación cónica y se denomina difracción de electrones de haz convergente (CBED). Esta es útil para determinar la simetría de los materiales. Una tercera es la difracción de electrones por precesión , donde un haz paralelo gira alrededor de un ángulo grande, produciendo un tipo de patrón de difracción promedio. [ 52 ] Estos suelen tener menos dispersión múltiple. [ 53 ]

Otras técnicas de microscopía electrónica

Instrumentos con corrección de aberraciones

Microscopio electrónico de transmisión de barrido equipado con un corrector de aberración esférica de tercer orden.

La microscopía electrónica de transmisión con corrección de aberraciones (AC-TEM) es el término general para los microscopios electrónicos en los que se introducen componentes electroópticos para reducir las aberraciones que, de otro modo, limitarían la resolución de las imágenes. Históricamente, los microscopios electrónicos presentaban aberraciones bastante severas, y hasta principios del siglo XXI la resolución era limitada, pudiendo obtener imágenes de la estructura atómica de los materiales si los átomos estaban lo suficientemente separados. [ 54 ] Alrededor del cambio de siglo, los componentes electroópticos se acoplaron al control informático de las lentes y su alineación, lo que permitió la corrección de las aberraciones. La primera demostración de corrección de aberraciones en modo TEM fue realizada por Harald Rose y Maximilian Haider en 1998 utilizando un corrector hexapolar, y en modo STEM por Ondrej Krivanek y Niklas Dellby en 1999 utilizando un corrector cuadrupolar/octupolar. [ 55 ]

A partir de 2025, la corrección de aberraciones geométricas es estándar en muchos microscopios electrónicos comerciales y se utilizan ampliamente en diversas áreas de la ciencia. [ 56 ] [ 57 ] También se han utilizado correctores similares a energías mucho más bajas para instrumentos LEEM . [ 58 ]

Preparación de la muestra

Un insecto recubierto de oro para su observación con un microscopio electrónico de barrido (MEB).

Las muestras para microscopios electrónicos generalmente no se pueden observar directamente. Es necesario prepararlas para estabilizarlas y mejorar el contraste. Las técnicas de preparación varían considerablemente según la muestra, sus características específicas y el microscopio utilizado. Encontrará más detalles en los artículos principales mencionados anteriormente.

Desventajas

Microscopio electrónico de transmisión y barrido JEOL fabricado a mediados de la década de 1970.

Los microscopios electrónicos son costosos de construir y mantener. Los microscopios diseñados para lograr altas resoluciones deben estar ubicados en edificios estables (a veces subterráneos) con servicios especiales como sistemas de cancelación de campos magnéticos y soportes antivibración. [ 59 ]

Las muestras deben observarse principalmente en vacío , ya que las moléculas que componen el aire dispersarían los electrones. Una excepción es la microscopía electrónica en fase líquida [ 60 ], que utiliza una celda líquida cerrada o una cámara ambiental, por ejemplo, en el microscopio electrónico de barrido ambiental , que permite observar muestras hidratadas en un entorno húmedo de baja presión (hasta 20 Torr o 2,7 kPa ). También se han desarrollado diversas técnicas para la microscopía electrónica in situ de muestras gaseosas. [ 61 ]  

Virión pleolipoviral (HRPV-6) [ 62 ]

Las muestras de materiales hidratados, incluyendo casi todos los especímenes biológicos, deben prepararse de diversas maneras para estabilizarlas, reducir su grosor (corte ultrafino) y aumentar su contraste óptico electrónico (tinción). Estos procesos pueden generar artefactos , pero estos generalmente se pueden identificar comparando los resultados obtenidos con métodos de preparación de muestras radicalmente diferentes. Desde la década de 1980, el análisis de especímenes criofijados y vitrificados también se ha vuelto cada vez más común. [ 63 ] [ 64 ] [ 65 ]

Muchas muestras sufren daños por radiación que pueden alterar sus estructuras internas. Esto puede deberse a procesos radiolíticos o balísticos, o a ambos, por ejemplo, mediante cascadas de colisión . [ 66 ] Esto puede ser un problema grave para las muestras biológicas. [ 67 ] [ 68 ]

Véase también

Referencias

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  • Introducción a la microscopía ( Archivado el 19/07/2013 en Wayback Machine : recursos para profesores y estudiantes)
  • Base de datos centrada en células: datos de microscopía electrónica
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