microscopía electrónica de transmisión

En 1873, Ernst Abbe propuso que la capacidad de resolver detalles en un objeto estaba limitada aproximadamente por la longitud de onda de la luz utilizada en la obtención de imágenes, o por unos pocos cientos de nanómetros para microscopios de luz visible. Los avances en microscopios ultravioleta (UV), liderados por Köhler y Rohr , aumentaron el poder de resolución en un factor de dos. ^{[ 3 ]} Sin embargo, esto requería óptica de cuarzo costosa, debido a la absorción de la luz UV por el vidrio. Se creía que obtener una imagen con información submicrométrica no era posible debido a esta limitación de longitud de onda. ^{[ 4 ]}

En 1858, Plücker observó la desviación de los rayos catódicos ( electrones ) por campos magnéticos. ^{[ 5 ]} Este efecto fue utilizado por Ferdinand Braun en 1897 para construir dispositivos de medición sencillos de osciloscopio de rayos catódicos (CRO). ^{[ 6 ]} En 1891, Eduard Riecke notó que los rayos catódicos podían enfocarse mediante campos magnéticos, lo que permitió diseños sencillos de lentes electromagnéticas. En 1926, Hans Busch publicó un trabajo que extendía esta teoría y demostró que la ecuación del fabricante de lentes podía, con las suposiciones adecuadas, aplicarse a los electrones. ^{[ 2 ]}

En 1928, en la Technische Hochschule de Charlottenburg (actualmente Technische Universität Berlin ), Adolf Matthias, catedrático de Tecnología de Alta Tensión e Instalaciones Eléctricas, designó a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores con el fin de perfeccionar el diseño del CRO. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, entre ellos Ernst Ruska y Bodo von Borries . El equipo de investigación trabajó en el diseño de lentes y la colocación de la columna del CRO, para optimizar los parámetros y construir mejores CRO, y en la fabricación de componentes ópticos electrónicos para generar imágenes de baja magnificación (casi 1:1). En 1931, el grupo logró generar imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre la apertura del ánodo. El dispositivo utilizaba dos lentes magnéticas para alcanzar mayores magnificaciones, lo que podría considerarse la creación del primer microscopio electrónico . Ese mismo año, Reinhold Rudenberg , director científico de la empresa Siemens , patentó un microscopio electrónico con lente electrostática . ^{[ 4 ] [ 7 ]}

En aquel entonces, se entendía que los electrones eran partículas cargadas de materia; la naturaleza ondulatoria de los electrones no se comprendió completamente hasta la tesis doctoral de Louis de Broglie en 1924. ^{[ 8 ]} El grupo de investigación de Knoll desconocía esta publicación hasta 1932, cuando se percataron de que la longitud de onda de De Broglie de los electrones era muchos órdenes de magnitud menor que la de la luz, lo que teóricamente permitía la obtención de imágenes a escalas atómicas. (Incluso para electrones con una energía cinética de tan solo 1 electronvoltio, la longitud de onda ya es tan corta como 1,18 nm ). En abril de 1932, Ruska sugirió la construcción de un nuevo microscopio electrónico para la obtención de imágenes directas de muestras insertadas en el microscopio, en lugar de simples rejillas de malla o imágenes de aperturas. Con este dispositivo se logró con éxito la obtención de imágenes por difracción y normales de una lámina de aluminio. Sin embargo, la magnificación alcanzable era menor que con la microscopía óptica. En septiembre de 1933 se lograron aumentos mayores que los que se pueden obtener con un microscopio óptico, mediante imágenes de fibras de algodón adquiridas rápidamente antes de que fueran dañadas por el haz de electrones. ^{[ 4 ]} 

En ese momento, el interés por el microscopio electrónico había aumentado, y otros grupos, como el de Paul Anderson y Kenneth Fitzsimmons de la Universidad Estatal de Washington ^{[ 9 ]} y el de Albert Prebus y James Hillier de la Universidad de Toronto , quienes construyeron los primeros TEM en América del Norte en 1935 y 1938, respectivamente, ^{[ 10 ]} avanzaron continuamente en el diseño de TEM.

En 1936, Siemens continuó investigando el microscopio electrónico con el objetivo de desarrollar y mejorar sus propiedades de imagen, especialmente en lo que respecta a muestras biológicas. En ese momento, se fabricaban microscopios electrónicos para grupos específicos, como el dispositivo "EM1" utilizado en el Laboratorio Nacional de Física del Reino Unido. ^{[ 11 ]} En 1939, se instaló el primer microscopio electrónico comercial, que se muestra en la imagen, en el departamento de Física de IG Farben -Werke. El trabajo posterior con el microscopio electrónico se vio obstaculizado por la destrucción de un nuevo laboratorio construido en Siemens durante un bombardeo aéreo , así como por la muerte de dos de los investigadores, Heinz Müller y Friedrick Krause, durante la Segunda Guerra Mundial . ^{[ 12 ]}

Después de la Segunda Guerra Mundial, Ruska retomó su trabajo en Siemens, donde continuó desarrollando el microscopio electrónico, produciendo el primer microscopio con 100k de aumento. ^{[ 12 ]} La estructura fundamental de este diseño de microscopio, con óptica de preparación de haz multietapa, todavía se utiliza en microscopios modernos. La comunidad mundial de microscopía electrónica avanzó con microscopios electrónicos fabricados en Manchester, Reino Unido, EE. UU. (RCA), Alemania (Siemens) y Japón (JEOL). La primera conferencia internacional de microscopía electrónica tuvo lugar en Delft en 1949, con más de cien asistentes. ^{[ 11 ]} Posteriormente se celebraron conferencias como la "Primera" conferencia internacional en París, 1950, y luego en Londres en 1954.

Con el desarrollo de la TEM, la técnica asociada de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) fue reinvestigada y permaneció sin desarrollar hasta la década de 1970, cuando Albert Crewe, de la Universidad de Chicago, desarrolló el cañón de emisión de campo ^{[ 13 ]} y añadió una lente objetivo de alta calidad para crear la STEM moderna. Utilizando este diseño, Crewe demostró la capacidad de obtener imágenes de átomos mediante imágenes de campo oscuro anular . Crewe y sus colaboradores en la Universidad de Chicago desarrollaron la fuente de emisión de electrones de campo frío y construyeron una STEM capaz de visualizar átomos pesados ​​individuales en sustratos delgados de carbono. ^{[ 14 ]}

Teóricamente, la resolución máxima, d , que se puede obtener con un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de los fotones ( λ ) y la apertura numérica NA del sistema. ^{[ 15 ]}

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2n\sin \alpha }}\approx {\frac {\lambda }{2\,{\textrm {NA}}}}}$

donde n es el índice de refracción del medio en el que funciona la lente y α es el semiángulo máximo del cono de luz que puede entrar en la lente (véase apertura numérica ). ^{[ 16 ]} A principios del siglo XX, los científicos teorizaron formas de sortear las limitaciones de la longitud de onda relativamente grande de la luz visible (longitudes de onda de 400 a 700 nanómetros ) mediante el uso de electrones. Como toda la materia, los electrones tienen propiedades tanto de onda como de partícula ( onda de materia ), y sus propiedades ondulatorias significan que un haz de electrones puede enfocarse y difractarse de forma muy similar a la luz. La longitud de onda de los electrones está relacionada con su energía cinética a través de la ecuación de De Broglie, que establece que la longitud de onda es inversamente proporcional al momento. Teniendo en cuenta los efectos relativistas (como en un TEM, la velocidad de un electrón es una fracción sustancial de la velocidad de la luz, c ^{[ 17 ]} ), la longitud de onda es 

${\displaystyle \lambda _{e}={\frac {h}{\sqrt {2m_{0}E\left(1+{\frac {E}{2m_{0}c^{2}}}\right)}}}}$

donde h es la constante de Planck , m ₀ es la masa en reposo de un electrón y E es la energía cinética del electrón acelerado.

De arriba abajo, el TEM consta de una fuente de emisión o cátodo, que puede ser un filamento de tungsteno , un monocristal de hexaboruro de _lantano ( LaB₆ ) o un cañón de emisión de campo . ^{[ 18 ]} El cañón está conectado a una fuente de alto voltaje (típicamente ~100–300 kV) y emite electrones en el vacío mediante emisión termoiónica o emisión de electrones de campo . En el caso de una fuente termoiónica, la fuente de electrones está montada en un cilindro de Wehnelt para proporcionar un enfoque preliminar de los electrones emitidos en un haz, al tiempo que estabiliza la corriente mediante un circuito de retroalimentación pasiva. Una fuente de emisión de campo utiliza electrodos electrostáticos llamados extractor, supresor y lente de cañón, con diferentes voltajes en cada uno, para controlar la forma y la intensidad del campo eléctrico cerca de la punta afilada. La combinación del cátodo y estos primeros elementos de lente electrostática se denomina colectivamente " cañón de electrones ". Tras salir del cañón, el haz se acelera normalmente hasta alcanzar su voltaje final y entra en la siguiente parte del microscopio: el sistema de lentes condensadoras. Estas lentes superiores del TEM enfocan aún más el haz de electrones al tamaño y la ubicación deseados en la muestra. ^{[ 19 ]}

La manipulación del haz de electrones se realiza mediante dos efectos físicos. La interacción de los electrones con un campo magnético provoca que se muevan según la regla de la mano izquierda , lo que permite a los electroimanes manipular el haz. Además, los campos electrostáticos pueden desviar los electrones en un ángulo constante. El acoplamiento de dos desviaciones en direcciones opuestas con una pequeña separación entre ellas permite generar un desplazamiento en la trayectoria del haz, posibilitando así su reorientación.

Las lentes de un microscopio electrónico de transmisión (TEM) son las que le confieren su flexibilidad de modos de operación y su capacidad para enfocar haces de luz a escala atómica y magnificarlos para obtener una imagen. Una lente suele estar formada por una bobina solenoide rodeada casi por completo de materiales ferromagnéticos , diseñados para concentrar el campo magnético de la bobina en una forma precisa y confinada. Cuando un electrón entra y sale de este campo magnético, describe una trayectoria en espiral alrededor de las líneas curvas del campo magnético, actuando de forma muy similar a como lo hace una lente de vidrio convencional para la luz: es una lente convergente. Sin embargo, a diferencia de una lente de vidrio, una lente magnética puede modificar fácilmente su capacidad de enfoque ajustando la corriente que circula por las bobinas.

Tan importantes como las lentes son las aperturas. Se trata de orificios circulares en finas tiras de metal pesado. Algunas tienen un tamaño y una posición fijos y desempeñan un papel fundamental en la limitación de la generación de rayos X y la mejora del rendimiento del vacío. Otras pueden cambiarse libremente entre diferentes tamaños y ajustarse su posición. Las aperturas variables situadas después de la muestra permiten al usuario seleccionar el rango de posiciones espaciales o ángulos de dispersión de electrones que se utilizarán para la formación de una imagen o un patrón de difracción.

El sistema electroóptico también incluye deflectores y estigmatizadores, generalmente fabricados con pequeños electroimanes. Los deflectores permiten controlar de forma independiente la posición y el ángulo del haz en la posición de la muestra, y además aseguran que los haces permanezcan cerca de los centros de baja aberración de cada lente en el conjunto de lentes. Los estigmatizadores compensan las pequeñas imperfecciones y aberraciones que causan astigmatismo, es decir, que una lente tenga una intensidad focal diferente en distintas direcciones.

Normalmente, un TEM consta de tres etapas de lentes. Estas etapas son las lentes condensadoras, las lentes objetivo y las lentes proyectoras. Las lentes condensadoras son responsables de la formación del haz primario, mientras que las lentes objetivo enfocan el haz que atraviesa la muestra (en el modo de escaneo STEM, también hay lentes objetivo sobre la muestra para hacer convergente el haz de electrones incidente). Las lentes proyectoras se utilizan para expandir el haz sobre la pantalla de fósforo u otro dispositivo de imagen, como una película. La magnificación del TEM se debe a la relación de las distancias entre la muestra y el plano de imagen de la lente objetivo. ^{[ 20 ]} Las configuraciones ópticas de los TEM difieren significativamente según su implementación, ya que los fabricantes utilizan configuraciones de lentes personalizadas, como en los instrumentos con corrección de aberración esférica , ^{[ 19 ]} o TEM que utilizan filtrado de energía para corregir la aberración cromática de los electrones .

Los factores clave a considerar en la detección de electrones incluyen la eficiencia cuántica de detección (DQE) , la función de dispersión de punto (PSF) , la función de transferencia de modulación (MTF) , el tamaño del píxel y el tamaño de la matriz, el ruido, la velocidad de lectura de datos y la resistencia a la radiación. ^{[ 23 ]}

Los sistemas de imagen en un TEM constan de una pantalla de fósforo , que puede estar hecha de sulfuro de zinc  particulado fino (10–100 μm) , para la observación directa por el operador, y un sistema de registro de imágenes como película fotográfica , ^{[ 24 ]} CCD acoplados a pantalla de YAG dopado , ^{[ 25 ]} u otro detector digital. ^{[ 23 ]} Normalmente, estos dispositivos se pueden quitar o insertar en la trayectoria del haz según sea necesario. (La película fotográfica ya no se usa). El primer informe del uso de un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) para TEM fue en 1982, ^{[ 26 ]} pero la tecnología no encontró un uso generalizado hasta finales de la década de 1990/principios de la década de 2000. ^{[ 27 ]} También se utilizaron sensores monolíticos de píxeles activos (MAPS) en TEM. ^{[ 28 ]} Los detectores CMOS , que son más rápidos y resistentes al daño por radiación que los CCD, se han utilizado para TEM desde 2005. ^{[ 29 ] [ 30 ]} A principios de la década de 2010, un mayor desarrollo de la tecnología CMOS permitió la detección de recuentos de electrones individuales ("modo de conteo"). ^{[ 31 ] [ 32 ]} Estos detectores de electrones directos están disponibles en Gatan , FEI , Quantum Detectors y Direct Electron . ^{[ 28 ]}

Para aumentar el camino libre medio de la interacción del gas de electrones, un TEM estándar se evacua a bajas presiones, típicamente del orden de10 ⁻⁴ Pa  . ^{[ 33 ]} La necesidad de esto es doble: primero, permitir la diferencia de voltaje entre el cátodo y tierra sin generar un arco, y segundo, reducir la frecuencia de colisión de electrones con átomos de gas a niveles insignificantes; este efecto se caracteriza por el camino libre medio . Los componentes del TEM, como los portamuestras y los cartuchos de película, deben insertarse o reemplazarse rutinariamente, lo que requiere un sistema con la capacidad de volver a evacuar de forma regular. Por lo tanto, los TEM están equipados con múltiples sistemas de bombeo y esclusas de aire y no están sellados al vacío de forma permanente.

El sistema de vacío para evacuar un TEM a un nivel de presión de operación consta de varias etapas. Inicialmente, se logra un vacío bajo o preliminar con una bomba de paletas rotativas o bombas de diafragma que establecen una presión suficientemente baja para permitir el funcionamiento de una bomba turbomolecular o de difusión que establece el alto nivel de vacío necesario para las operaciones. Para que la bomba de bajo vacío no requiera operación continua, mientras que las bombas turbomoleculares operan continuamente, el lado de vacío de una bomba de baja presión puede conectarse a cámaras que alojan los gases de escape de la bomba turbomolecular. ^{[ 34 ]} Se pueden aislar secciones del TEM mediante el uso de aberturas limitadoras de presión para permitir diferentes niveles de vacío en áreas específicas, como un vacío más alto de 10 ⁻⁴ a 10 ⁻⁷ Pa o más en el cañón de electrones en TEM de alta resolución o de emisión de campo.

Los TEM de alto voltaje requieren vacíos ultraaltos en el rango de 10⁻⁷ ^a 10⁻⁹ ^Pa para evitar la generación de un arco eléctrico, particularmente en el cátodo del TEM. ^{[ 35 ]} Por lo tanto, para TEM de voltaje más alto, puede operar un tercer sistema de vacío, con el cañón aislado de la cámara principal ya sea por válvulas de compuerta o por una abertura de bombeo diferencial: un pequeño orificio que impide la difusión de moléculas de gas hacia el área del cañón de mayor vacío más rápido de lo que pueden ser extraídas. Para estas presiones muy bajas, se utiliza una bomba de iones o un material absorbente .

Un vacío deficiente en un TEM puede causar varios problemas, desde la deposición de gas dentro del TEM sobre la muestra durante la observación (un proceso conocido como deposición inducida por haz de electrones) hasta daños más graves en el cátodo causados ​​por descargas eléctricas. ^{[ 35 ]} El uso de una trampa fría para adsorber los gases sublimados en las proximidades de la muestra elimina en gran medida los problemas de vacío causados ​​por la sublimación de la muestra . ^{[ 34 ]}

Los diseños de las platinas para TEM incluyen esclusas de aire que permiten la inserción del portamuestras en el vacío con una mínima pérdida de vacío en otras áreas del microscopio. Los portamuestras sostienen una rejilla de muestra de tamaño estándar o una muestra autoportante. Las rejillas estándar para TEM tienen un  diámetro de 3,05 mm, con un grosor y un tamaño de malla que oscila entre unos pocos y 100  μm. La muestra se coloca sobre el área de la rejilla, que tiene un diámetro aproximado de 2,5  mm. Los materiales habituales para las rejillas son cobre, molibdeno, oro o platino. Esta rejilla se coloca en el portamuestras, que está acoplado a la platina. Existe una amplia variedad de diseños de platinas y portamuestras, según el tipo de experimento que se realice. Además de  las rejillas de 3,05 mm, a veces se utilizan, aunque raramente, rejillas de 2,3  mm. Estas rejillas se utilizaban especialmente en las ciencias mineralógicas, donde puede requerirse un alto grado de inclinación y donde el material de la muestra puede ser extremadamente escaso. Las muestras transparentes a los electrones suelen tener un espesor inferior a 100  nm, pero este valor depende del voltaje de aceleración.

Una vez insertada en un TEM, la muestra debe manipularse para ubicar la región de interés para el haz, como en la difracción de grano único , en una orientación específica. Para ello, la platina del TEM permite el movimiento de la muestra en el plano XY, el ajuste de la altura Z y, comúnmente, una única dirección de inclinación paralela al eje de los portamuestras de entrada lateral. La rotación de la muestra puede estar disponible en portamuestras y platinas de difracción especializados. Algunos TEM modernos ofrecen la posibilidad de dos ángulos de inclinación ortogonales mediante diseños de portamuestras especializados denominados portamuestras de doble inclinación. Algunos diseños de platina, como las de entrada superior o de inserción vertical, antes comunes en estudios de TEM de alta resolución, pueden simplemente permitir únicamente la traslación XY. Los criterios de diseño de las platinas de TEM son complejos, debido a los requisitos simultáneos de las restricciones mecánicas y electroópticas, y existen modelos especializados para diferentes métodos.

Se requiere una platina TEM para poder sujetar una muestra y ser manipulada para colocar la región de interés en la trayectoria del haz de electrones. Dado que el TEM puede operar en un amplio rango de magnificaciones, la platina debe ser simultáneamente altamente resistente a la deriva mecánica, con requisitos de deriva tan bajos como unos pocos nm/minuto, a la vez que puede moverse varios μm/minuto, con una precisión de reposicionamiento del orden de nanómetros. ^{[ 36 ]} Los primeros diseños de TEM lograron esto con un conjunto complejo de dispositivos de engranajes mecánicos descendentes, que permitían al operador controlar finamente el movimiento de la platina mediante varias varillas giratorias. Los dispositivos modernos pueden utilizar diseños de platina eléctrica, utilizando engranajes de tornillo en conjunto con motores paso a paso , proporcionando al operador una entrada de platina basada en computadora, como un joystick o un trackball .

Existen dos diseños principales para las plataformas de un microscopio electrónico de transmisión (TEM): la versión de entrada lateral y la de entrada superior. ^{[ 25 ]} Cada diseño debe ser compatible con el soporte correspondiente para permitir la inserción de la muestra sin dañar la delicada óptica del TEM ni permitir la entrada de gas en los sistemas de TEM bajo vacío.

El sistema más común es el de entrada lateral, donde la muestra se coloca cerca de la punta de una varilla metálica larga (de latón o acero inoxidable), con la muestra plana dentro de un pequeño orificio. A lo largo de la varilla hay varios anillos de vacío de polímero que permiten la formación de un sello de vacío de calidad suficiente al insertarla en la platina. La platina está diseñada para alojar la varilla, colocando la muestra entre o cerca de la lente del objetivo, según el diseño de este. Al insertarse en la platina, la punta del soporte de entrada lateral queda dentro del vacío del TEM, mientras que la base queda expuesta a la atmósfera, gracias a la esclusa de aire formada por los anillos de vacío.

Los procedimientos de inserción en los portamuestras de TEM de entrada lateral suelen implicar la rotación de la muestra para activar microinterruptores que inician la evacuación de la esclusa de aire antes de que la muestra se inserte en la columna del TEM.

El segundo diseño consiste en un soporte de entrada superior con un cartucho de varios centímetros de longitud y un orificio perforado a lo largo de su eje. La muestra se introduce en el orificio, posiblemente mediante un pequeño anillo roscado para sujetarla. Este cartucho se inserta en una esclusa de aire con el orificio perpendicular al eje óptico del TEM. Una vez sellada, la esclusa se manipula para empujar el cartucho hasta que este encaje en su posición, alineando el orificio con el eje del haz, de modo que este recorra el orificio del cartucho e incida sobre la muestra. Estos diseños generalmente no permiten la inclinación sin bloquear el haz o interferir con la lente del objetivo. ^{[ 25 ]}

El cañón de electrones se compone de varios elementos: el filamento, un circuito de polarización, una tapa de Wehnelt y un ánodo de extracción. Al conectar el filamento a la fuente de alimentación del componente negativo, los electrones se pueden "bombear" desde el cañón de electrones hasta la placa del ánodo y la columna del TEM, completando así el circuito. El cañón está diseñado para crear un haz de electrones que sale del conjunto con un ángulo determinado, conocido como semiángulo de divergencia del cañón, α. Al construir el cilindro de Wehnelt de manera que tenga una carga negativa mayor que la del filamento, los electrones que salen del filamento de forma divergente, en condiciones de funcionamiento adecuadas, se ven obligados a converger en un patrón cuyo tamaño mínimo es el diámetro de cruce del cañón.

La densidad de corriente de emisión termoiónica, J , puede relacionarse con la función de trabajo del material emisor mediante la ley de Richardson.

${\displaystyle J=AT^{2}\exp \left({\frac {-\Phi }{kT}}\right),}$

donde A es la constante de Richardson , Φ es la función de trabajo y T es la temperatura del material. ^{[ 25 ]}

Esta ecuación muestra que para lograr una densidad de corriente suficiente es necesario calentar el emisor, teniendo cuidado de no causar daños por la aplicación de calor excesivo. Por esta razón, se requieren materiales con un punto de fusión alto, como el tungsteno, o aquellos con una función de trabajo baja (LaB6) para el filamento del cañón. _[ ^{37 ] Además} , tanto las fuentes termoiónicas de hexaboruro de lantano como las de tungsteno deben calentarse para lograr la emisión termoiónica, lo cual puede lograrse mediante el uso de una pequeña tira resistiva. Para evitar el choque térmico, a menudo se impone un retardo en la aplicación de corriente a la punta, para evitar que los gradientes térmicos dañen el filamento, el retardo suele ser de unos pocos segundos para LaB6 _, y significativamente menor para el tungsteno .

Las lentes electrónicas están diseñadas para funcionar de manera similar a una lente óptica, enfocando electrones paralelos a una distancia focal constante. Pueden operar electrostáticamente o magnéticamente. La mayoría de las lentes electrónicas para TEM utilizan bobinas electromagnéticas para generar una lente convexa . El campo producido para la lente debe ser radialmente simétrico, ya que la desviación de la simetría radial de la lente magnética causa aberraciones como el astigmatismo y empeora la aberración esférica y cromática . Las lentes electrónicas se fabrican con hierro, hierro-cobalto o aleaciones de níquel-cobalto, ^{[ 38 ]} como la permalloy . Estas se seleccionan por sus propiedades magnéticas, como la saturación magnética , la histéresis y la permeabilidad .

Los componentes incluyen el yugo, la bobina magnética, los polos, la pieza polar y el circuito de control externo. La pieza polar debe fabricarse de forma muy simétrica, ya que esto proporciona las condiciones límite para el campo magnético que forma la lente. Las imperfecciones en la fabricación de la pieza polar pueden inducir graves distorsiones en la simetría del campo magnético, lo que, en última instancia, limitará la capacidad de las lentes para reproducir el plano del objeto. Las dimensiones exactas del espacio, el diámetro interno y la conicidad de la pieza polar, así como el diseño general de la lente, se suelen determinar mediante análisis de elementos finitos del campo magnético, teniendo en cuenta las restricciones térmicas y eléctricas del diseño. ^{[ 38 ]}

Las bobinas que generan el campo magnético se encuentran dentro del núcleo de la lente. Estas bobinas pueden contener una corriente variable, pero generalmente utilizan altos voltajes, por lo que requieren un aislamiento considerable para evitar cortocircuitos en los componentes de la lente. Se colocan distribuidores térmicos para asegurar la disipación del calor generado por la energía disipada en la resistencia de los devanados de las bobinas. Los devanados pueden refrigerarse por agua, utilizando un suministro de agua fría para facilitar la eliminación del calor generado.

Las aperturas son placas metálicas anulares que permiten excluir los electrones que se encuentran a una distancia mayor que el eje óptico . Consisten en un pequeño disco metálico lo suficientemente grueso como para impedir el paso de los electrones, permitiendo el paso de los electrones axiales. Esta omisión de electrones centrales en un TEM produce dos efectos simultáneos: en primer lugar, las aperturas disminuyen la intensidad del haz al filtrar los electrones, lo cual puede ser deseable en el caso de muestras sensibles al haz. En segundo lugar, este filtrado elimina los electrones dispersados ​​a ángulos elevados, que pueden deberse a procesos no deseados como la aberración esférica o cromática, o a la difracción por interacción dentro de la muestra. ^{[ 39 ]}

Las aperturas pueden ser fijas, ubicadas dentro de la columna, como en la lente condensadora, o móviles, pudiendo insertarse o extraerse del haz, o desplazarse en el plano perpendicular a este. Los conjuntos de apertura son dispositivos mecánicos que permiten seleccionar diferentes tamaños de apertura, lo que permite al operador ajustar la intensidad y el efecto de filtrado. Estos conjuntos suelen estar equipados con micrómetros para ajustar la apertura, lo cual es necesario durante la calibración óptica.

El contraste entre dos áreas adyacentes en una imagen de TEM se define como la diferencia en las densidades electrónicas en el plano de la imagen. Debido a la dispersión del haz incidente por la muestra, la amplitud y la fase de la onda electrónica cambian, lo que da lugar a un contraste de amplitud y un contraste de fase , respectivamente. La mayoría de las imágenes presentan ambos componentes de contraste.

El contraste de amplitud se obtiene mediante la eliminación de algunos electrones antes del plano de imagen. Durante su interacción con la muestra, algunos electrones se pierden por absorción o por dispersión en ángulos muy elevados, más allá de la limitación física del microscopio, o bien son bloqueados por la apertura del objetivo. Si bien las dos primeras pérdidas se deben a la muestra y a la construcción del microscopio, el operador puede utilizar la apertura del objetivo para mejorar el contraste.

La figura de la derecha muestra una imagen TEM (a) y el patrón de difracción correspondiente (b) de una película policristalina de Pt tomada sin apertura del objetivo. Para mejorar el contraste en la imagen TEM, se debe reducir el número de haces dispersos visibles en el patrón de difracción. Esto se puede lograr seleccionando un área determinada en el plano focal posterior, como solo el haz central o un haz difractado específico (ángulo), o combinaciones de dichos haces. Al seleccionar intencionalmente una apertura del objetivo que solo permita que el haz no difractado pase más allá del plano focal posterior (y hacia el plano de imagen), se crea una imagen de campo claro (BF) (c), mientras que si se bloquea el haz central no difractado, se pueden obtener imágenes de campo oscuro (DF) como las que se muestran en (d-e). Las imágenes DF (d-e) se obtuvieron seleccionando los haces difractados indicados en el patrón de difracción con círculos (b) usando una apertura en el plano focal posterior. Los granos de los que se dispersan electrones hacia estos puntos de difracción aparecen más brillantes. Más adelante se ofrecen más detalles sobre la formación del contraste de difracción.

Existen dos tipos de contraste de amplitud: el de masa-espesor y el de difracción. Primero, consideremos el contraste de masa-espesor . Cuando el haz ilumina dos áreas vecinas con baja masa (o espesor) y alta masa (o espesor), la región más densa dispersa los electrones en ángulos mayores. Estos electrones fuertemente dispersados ​​son bloqueados en el modo TEM de campo brillante (BF) por la apertura del objetivo. Como resultado, las regiones más densas aparecen más oscuras en las imágenes de campo brillante (tienen baja intensidad). El contraste de masa-espesor es de suma importancia para materiales amorfos no cristalinos.

El contraste de difracción se produce debido a una orientación cristalográfica específica de un grano. En tal caso, el cristal se orienta de forma que existe una alta probabilidad de difracción. El contraste de difracción proporciona información sobre la orientación de los cristales en una muestra policristalina, así como otra información, como la presencia de defectos. Cabe destacar que, si existe contraste de difracción, este no puede interpretarse como consecuencia de variaciones de masa o espesor.

Contraste de difracción

Las muestras pueden presentar contraste de difracción, donde el haz de electrones sufre difracción , lo que, en el caso de una muestra cristalina, dispersa los electrones en ubicaciones discretas en el plano focal posterior . Mediante la colocación de aperturas en el plano focal posterior, es decir, la apertura del objetivo, se pueden seleccionar (o excluir) los vectores de la red recíproca deseados , de modo que solo las partes de la muestra que provocan que los electrones se dispersen hacia las reflexiones seleccionadas se proyectarán en el aparato de imagen.

Si las reflexiones seleccionadas no incluyen el haz no dispersado (que aparecerá en el punto focal de la lente), la imagen aparecerá oscura donde no haya dispersión de la muestra hacia el pico seleccionado, ya que dicha región sin muestra aparecerá oscura. Esto se conoce como imagen de campo oscuro.

Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) modernos suelen estar equipados con soportes para muestras que permiten al usuario inclinar la muestra en diferentes ángulos para obtener condiciones de difracción específicas, y unas aberturas situadas encima de la muestra permiten al usuario seleccionar los electrones que, de otro modo, se difractarían en una dirección determinada, impidiendo que entren en la muestra.

Las aplicaciones de este método incluyen la identificación de defectos reticulares en cristales. Al seleccionar cuidadosamente la orientación de la muestra, es posible no solo determinar la posición de los defectos, sino también el tipo de defecto presente. Si la muestra se orienta de manera que un plano particular se incline ligeramente con respecto al ángulo de difracción más intenso (conocido como ángulo de Bragg ), cualquier distorsión del plano cristalino que lo incline localmente hacia el ángulo de Bragg producirá variaciones de contraste particularmente fuertes. Sin embargo, los defectos que solo producen desplazamientos de átomos que no inclinan el cristal hacia el ángulo de Bragg (es decir, desplazamientos paralelos al plano cristalino) producirán un contraste más débil. ^{[ 42 ]}

Como se indicó anteriormente, al ajustar las lentes magnéticas de manera que el plano focal posterior de la lente, en lugar del plano de imagen, se coloque sobre el aparato de imagen, se puede generar un patrón de difracción . Para muestras cristalinas delgadas, esto produce una imagen que consiste en un patrón de puntos en el caso de un monocristal, o una serie de anillos en el caso de un material sólido policristalino o amorfo . En el caso del monocristal, el patrón de difracción depende de la orientación de la muestra y de la estructura de la muestra iluminada por el haz de electrones. Esta imagen proporciona al investigador información sobre las simetrías del grupo espacial en el cristal y la orientación del cristal con respecto a la trayectoria del haz. Esto generalmente se realiza utilizando solo la posición en la que aparecen los puntos de difracción y las simetrías de la imagen observada.

Los patrones de difracción pueden tener un amplio rango dinámico y, en el caso de muestras cristalinas, intensidades superiores a las que puede registrar un detector CCD. Por ello, los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) pueden seguir utilizando cartuchos de película para obtener estas imágenes, dado que la película es un detector de un solo uso.

El análisis de patrones de difracción más allá de la posición puntual puede ser complejo, ya que la imagen es sensible a diversos factores como el grosor y la orientación de la muestra, el desenfoque de la lente del objetivo y la aberración esférica y cromática. Si bien es posible la interpretación cuantitativa del contraste que se muestra en las imágenes de la red cristalina, esta es intrínsecamente compleja y puede requerir una extensa simulación y análisis computacional, como el análisis de múltiples capas electrónicas . ^{[ 43 ]}

También es posible un comportamiento más complejo en el plano de difracción, con fenómenos como las líneas de Kikuchi que surgen de la difracción múltiple dentro de la red cristalina. En la difracción de electrones de haz convergente (CBED), donde se produce un frente de onda electrónico no paralelo, es decir convergente, al concentrar el haz de electrones en una sonda fina en la superficie de la muestra, la interacción del haz convergente puede proporcionar información que va más allá de los datos estructurales, como el espesor de la muestra.

Como los portamuestras de TEM suelen permitir la rotación de la muestra en el ángulo deseado, se pueden obtener múltiples vistas de la misma muestra girando su ángulo a lo largo de un eje perpendicular al haz. Al tomar varias imágenes de una misma muestra de TEM en diferentes ángulos, generalmente en incrementos de 1°, se puede obtener un conjunto de imágenes conocido como "serie de inclinación". Esta metodología fue propuesta en la década de 1970 por Walter Hoppe . En condiciones de contraste de absorción puro, este conjunto de imágenes se puede utilizar para construir una representación tridimensional de la muestra. ^{[ 46 ]}

La reconstrucción se realiza mediante un proceso de dos pasos: primero, las imágenes se alinean para corregir errores en el posicionamiento de la muestra; estos errores pueden deberse a vibraciones o deriva mecánica. ^{[ 47 ]} Los métodos de alineación utilizan algoritmos de registro de imágenes , como los métodos de autocorrelación , para corregir estos errores. En segundo lugar, mediante un algoritmo de reconstrucción, como la retroproyección filtrada , las secciones de imagen alineadas se transforman de un conjunto de imágenes bidimensionales, I _j ( x , y ), a una única imagen tridimensional, I ′ _j ( x , y , z ). Esta imagen tridimensional es de particular interés cuando se requiere información morfológica; se puede realizar un estudio adicional utilizando algoritmos informáticos, como isosuperficies y segmentación de datos, para analizar los datos.   

Como las muestras de TEM no suelen poder verse en una rotación completa de 180°, las imágenes observadas suelen sufrir una "cuña faltante" de datos, que al utilizar métodos de retroproyección basados ​​en Fourier disminuye el rango de frecuencias resolubles en la reconstrucción tridimensional. ^{[ 46 ]} Los refinamientos mecánicos, como la inclinación multieje (dos series de inclinación de la misma muestra realizadas en direcciones ortogonales) y la tomografía cónica (donde la muestra se inclina primero a un ángulo fijo dado y luego se obtiene una imagen en incrementos de rotación angular iguales a través de una rotación completa en el plano de la rejilla de la muestra) pueden utilizarse para limitar el impacto de los datos faltantes en la morfología de la muestra observada. Utilizando el fresado con haz de iones focalizado , se ha propuesto una nueva técnica ^{[ 48 ]} que utiliza una muestra en forma de pilar y un soporte de tomografía en el eje dedicado para realizar una rotación de 180° de la muestra dentro de la pieza polar de la lente del objetivo en TEM. Utilizando tales configuraciones, es posible la tomografía electrónica cuantitativa sin la cuña faltante. ^{[ 49 ]} Además, existen técnicas numéricas que pueden mejorar los datos recopilados.

Todos los métodos mencionados anteriormente implican el registro de series de inclinación de un campo de muestra determinado. Esto inevitablemente resulta en la suma de una alta dosis de electrones reactivos a través de la muestra y la consiguiente destrucción de detalles finos durante el registro. Por lo tanto, la técnica de imagen de baja dosis (dosis mínima) se aplica regularmente para mitigar este efecto. La imagen de baja dosis se realiza desviando simultáneamente las regiones de iluminación e imagen fuera del eje óptico para obtener la imagen de una región adyacente al área que se va a registrar (la región de alta dosis). Esta área se mantiene centrada durante la inclinación y se vuelve a enfocar antes del registro. Durante el registro, se eliminan las desviaciones para que el área de interés se exponga al haz de electrones solo durante el tiempo necesario para la obtención de la imagen. Una mejora de esta técnica (para objetos que descansan sobre una película de sustrato inclinada) consiste en tener dos regiones simétricas fuera del eje para enfocar, y luego ajustar el enfoque al promedio de los dos valores de enfoque de alta dosis antes de registrar el área de interés de baja dosis.

Las variantes no tomográficas de este método, denominadas análisis de partículas individuales , utilizan imágenes de múltiples objetos (idealmente) idénticos en diferentes orientaciones para generar los datos de imagen necesarios para la reconstrucción tridimensional. Si los objetos no presentan orientaciones preferenciales significativas, este método no sufre del problema de la cuña (o cono) de datos faltantes que acompaña a los métodos tomográficos ni conlleva una dosis de radiación excesiva; sin embargo, presupone que los diferentes objetos analizados pueden tratarse como si los datos 3D generados a partir de ellos provinieran de un único objeto estable.

Antes de la sección, el tejido biológico a menudo se incrusta en un bloque de resina epoxi y primero se recorta con una cuchilla de afeitar en una cara de bloque trapezoidal. Luego se cortan secciones gruesas de la cara del bloque. Las secciones gruesas se tiñen toscamente con azul de toluidina y se examinan para la orientación de la muestra y del bloque antes de la sección delgada. ^{[ 52 ]} Luego el tejido biológico se adelgaza a menos de 100  nm en un ultramicrótomo . El bloque de resina se fractura al pasar sobre el filo de una cuchilla de vidrio o diamante. ^{[ 53 ]} Este método se utiliza para obtener muestras delgadas y mínimamente deformadas que permiten la observación de la ultraestructura del tejido. Las muestras inorgánicas, como el aluminio, también pueden incrustarse en resinas y seccionarse ultrafinamente de esta manera, utilizando cuchillas de vidrio recubiertas, zafiro o diamante de mayor ángulo. ^{[ 54 ]} Para evitar la acumulación de carga en la superficie de la muestra al observarla en el TEM, las muestras de tejido deben recubrirse con una capa delgada de material conductor, como el carbono.

Las muestras de tejidos biológicos para TEM requieren tinciones de alto número atómico para mejorar el contraste. La tinción absorbe los electrones del haz o dispersa parte de ellos, que de otro modo se proyectarían sobre el sistema de imagen. Se pueden utilizar compuestos de metales pesados ​​como osmio , plomo , uranio u oro (en el marcaje con inmunogold ) antes de la observación por TEM para depositar selectivamente átomos densos en electrones dentro o sobre la muestra en la región celular o proteica deseada. Este proceso requiere comprender cómo se unen los metales pesados ​​a tejidos biológicos y estructuras celulares específicas. ^{[ 55 ]}

Otra forma de tinción de muestras es la tinción negativa , donde se aplica una mayor cantidad de tinción de metales pesados ​​a la muestra. ^{[ 56 ]} El resultado es una muestra con un fondo oscuro y la superficie topológica de la muestra aparece más clara. La microscopía electrónica de tinción negativa puede ser ideal para visualizar o formar reconstrucciones topológicas 3D de proteínas grandes o complejos macromoleculares (>  150  kDa). Para proteínas más pequeñas, la tinción negativa puede utilizarse como paso de cribado para encontrar la concentración de muestra ideal para la microscopía electrónica criogénica . ^{[ 56 ]}

El pulido mecánico también se utiliza para preparar muestras para su observación mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Es fundamental realizar un pulido de alta calidad para garantizar un espesor uniforme de la muestra en toda la región de interés. En las etapas finales del pulido, se puede utilizar un compuesto de pulido de diamante o nitruro de boro cúbico para eliminar cualquier rayadura que pueda causar fluctuaciones de contraste debido a la variación del espesor de la muestra. Incluso después de un fresado mecánico minucioso, pueden ser necesarios métodos adicionales de precisión, como el grabado iónico, para lograr el adelgazamiento final.

Ciertas muestras, especialmente las metálicas, pueden prepararse mediante grabado químico. Estas muestras se adelgazan utilizando un agente de grabado químico, como un ácido, para prepararlas para la observación mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Los dispositivos para controlar el proceso de adelgazamiento permiten al operador controlar el voltaje o la corriente que atraviesa la muestra, e incluyen sistemas para detectar cuándo la muestra se ha adelgazado hasta alcanzar un nivel suficiente de transparencia óptica.

El grabado iónico es un proceso de pulverización catódica que permite eliminar cantidades muy pequeñas de material. Se utiliza para el pulido final de muestras pulidas previamente mediante otros métodos. Este proceso emplea un gas inerte que pasa a través de un campo eléctrico para generar un plasma dirigido a la superficie de la muestra. Las energías de aceleración para gases como el argón suelen ser de unos pocos kilovoltios. La muestra puede girarse para favorecer un pulido uniforme de su superficie. La velocidad de pulverización de estos métodos es del orden de decenas de micrómetros por hora, lo que limita su aplicación a pulidos extremadamente finos.

Recientemente se ha demostrado que el grabado iónico con gas argón permite limar las estructuras de apilamiento MTJ hasta una capa específica, la cual ha sido analizada a nivel atómico. Las imágenes TEM tomadas en vista plana, en lugar de en sección transversal, revelan que la capa de MgO dentro de las MTJ contiene una gran cantidad de límites de grano que podrían estar disminuyendo las propiedades de los dispositivos. ^{[ 57 ]}

Más recientemente, se han utilizado métodos de haz de iones focalizado (FIB) para preparar muestras. FIB es una técnica relativamente nueva para preparar muestras delgadas para examen TEM a partir de especímenes más grandes. Debido a que FIB puede utilizarse para micromecanizar muestras con gran precisión, es posible fresar membranas muy delgadas de un área específica de interés en una muestra, como un semiconductor o un metal. A diferencia de la pulverización iónica con gas inerte, FIB utiliza iones de galio significativamente más energéticos y puede alterar la composición o estructura del material mediante la implantación de galio. ^{[ 58 ]}

Para minimizar la introducción de tensión y flexión en las muestras de microscopía electrónica de transmisión (TEM) ( láminas , películas delgadas y otras muestras sensibles a la mecánica y al haz), al transferirlas dentro de un haz de iones focalizado (FIB), se pueden unir nanocables metálicos flexibles a un micromanipulador típicamente rígido .

Las principales ventajas de este método incluyen una reducción significativa del tiempo de preparación de la muestra (soldadura y corte rápidos de nanocables con baja corriente de haz) y la minimización de la flexión inducida por tensión, la contaminación por Pt y el daño por haz de iones. ^{[ 59 ]} Esta técnica es particularmente adecuada para la preparación de muestras para microscopía electrónica in situ .

Las muestras también pueden replicarse utilizando una película de acetato de celulosa , la cual se recubre posteriormente con un metal pesado como el platino. La película original se disuelve y la réplica se observa en el microscopio electrónico de transmisión (TEM). Se utilizan variantes de esta técnica de replicación tanto para materiales como para muestras biológicas. En ciencia de materiales, un uso común es el examen de la superficie de fractura reciente de aleaciones metálicas.

Un microscopio electrónico de transmisión ( TEM) puede transformarse en un microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM) mediante la adición de un sistema que barre la muestra con un haz convergente para formar la imagen, en combinación con detectores adecuados. Se utilizan bobinas de barrido para desviar el haz, por ejemplo, mediante un desplazamiento electrostático. El haz se recoge posteriormente con un detector de corriente, como una copa de Faraday , que actúa como contador directo de electrones. Al correlacionar el número de electrones con la posición del haz de barrido (conocido como "sonda"), se puede medir la componente transmitida del haz. Las componentes no transmitidas se pueden obtener inclinando el haz o utilizando detectores de campo oscuro anulares .

Fundamentalmente, los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) y de barrido de transmisión (STEM) están vinculados mediante la reciprocidad de Helmholtz . Un STEM es un TEM en el que la fuente de electrones y el punto de observación se han invertido con respecto a la dirección de propagación del haz de electrones. Véanse los diagramas de rayos en la figura de la derecha. El instrumento STEM se basa en la misma configuración óptica que un TEM, pero funciona invirtiendo la dirección de propagación de los electrones (o invirtiendo el tiempo) durante el funcionamiento de un TEM. En lugar de utilizar una apertura para controlar los electrones detectados, como en el TEM, un STEM utiliza varios detectores con ángulos de recolección que se pueden ajustar según los electrones que el usuario desee capturar.

Un microscopio electrónico de bajo voltaje (LVEM) funciona con un voltaje de aceleración de electrones relativamente bajo, entre 5 y 25 kV. Algunos de estos microscopios pueden combinar SEM, TEM y STEM en un único instrumento compacto. El bajo voltaje aumenta el contraste de la imagen, lo cual es especialmente importante para muestras biológicas. Este aumento del contraste reduce significativamente, o incluso elimina, la necesidad de tinción. Es posible obtener resoluciones de unos pocos nm en los modos TEM, SEM y STEM. La baja energía del haz de electrones permite el uso de imanes permanentes como lentes y, por lo tanto, se puede emplear una columna en miniatura que no requiere refrigeración. ^{[ 60 ] [ 61 ]}

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (Cryo-TEM o Cryo-EM) utiliza un TEM con un portamuestras capaz de mantener la muestra a temperaturas de nitrógeno líquido o helio líquido . ^{[ 62 ] [ 63 ] [ 64 ]} Esto permite obtener imágenes de muestras preparadas en hielo vítreo , la técnica de preparación preferida para obtener imágenes de moléculas individuales o ensamblajes macromoleculares , ^{[ 65 ]} imágenes de interfaces sólido-electrocolor vitrificadas, ^{[ 66 ]} y imágenes de materiales que son volátiles en alto vacío a temperatura ambiente, como el azufre. ^{[ 67 ]} Para muchos materiales o dispositivos cuánticos, se requiere una temperatura baja o ultrabaja ^{[ 68 ]} para acceder a fases donde ocurre el comportamiento cuántico emergente. ^{[ 69 ]}

También se pueden realizar experimentos in situ en TEM utilizando cámaras de muestras con bombeo diferencial o soportes especializados. ^{[ 70 ]} Los tipos de experimentos in situ incluyen el estudio de nanomateriales, ^{[ 71 ]} muestras biológicas, reacciones químicas de moléculas, ^{[ 72 ]} microscopía electrónica de fase líquida , ^{[ 73 ] [ 74 ]} y pruebas de deformación de materiales. ^{[ 75 ]}

Durante el calentamiento se producen numerosas transformaciones de fase. Además, el engrosamiento y el crecimiento de grano, junto con otros procesos relacionados con la difusión, se producen con mayor rapidez a temperaturas elevadas, donde la cinética mejora, lo que permite observar fenómenos relacionados mediante microscopía electrónica de transmisión en plazos razonables. Esto también permite observar fenómenos que ocurren a temperaturas elevadas y que desaparecen o no se conservan uniformemente en muestras ex situ.

La microscopía electrónica de transmisión de alta temperatura (TEM) introduce varios desafíos adicionales que deben abordarse en la mecánica de los portamuestras de alta temperatura, incluyendo, entre otros, la corrección de la deriva, la medición de la temperatura y la disminución de la resolución espacial a expensas de portamuestras más complejos. ^{[ 76 ] [ 77 ]}

La deriva de la muestra en el TEM es directamente proporcional a la diferencia de temperatura entre la sala y el portamuestras. Con temperaturas de hasta 1500 °C en los portamuestras modernos, las muestras pueden experimentar una deriva significativa y un desplazamiento vertical (abombamiento), lo que requiere ajustes continuos del enfoque o de la platina, provocando pérdida de resolución y deriva mecánica. ^{[ 78 ] [ 79 ]} Algunos laboratorios y fabricantes han desarrollado software junto con sistemas de refrigeración avanzados para corregir la deriva térmica en función de la temperatura prevista en la cámara de muestras. ^{[ 76 ] [ 79 ] [ 80 ]} Estos sistemas suelen tardar entre 30 minutos y varias horas en estabilizar los desplazamientos de la muestra. Aunque se han logrado avances significativos, no se ha desarrollado ningún accesorio universal para TEM que tenga en cuenta la deriva a temperaturas elevadas. ^{[ 77 ] [ 78 ] [ 80 ]}

Un desafío adicional de muchos de estos portamuestras especializados es conocer la temperatura local de la muestra. Muchos portamuestras de alta temperatura utilizan un filamento de tungsteno para calentar localmente la muestra. ^{[ 76 ] [ 79 ]} La ambigüedad en la temperatura en los calentadores de horno (hilo de W) con termopares surge del contacto térmico entre el horno y la rejilla TEM; complicado por los gradientes de temperatura a lo largo de la muestra causados ​​por la conductividad térmica variable con diferentes muestras y materiales de rejilla. ^{[ 77 ]} Con diferentes portamuestras, tanto comerciales como de laboratorio, hay diferentes métodos disponibles para crear la calibración de temperatura. Fabricantes como Gatan utilizan pirometría IR para medir gradientes de temperatura en toda su muestra. Un método aún mejor para calibrar es la espectroscopia Raman, que mide la temperatura local del polvo de Si en ventanas transparentes a los electrones y calibra cuantitativamente la pirometría IR. Estas mediciones tienen una precisión garantizada dentro del 5 %. Los laboratorios de investigación también han realizado sus propias calibraciones en portamuestras comerciales. Investigadores del NIST utilizaron espectroscopia Raman para mapear el perfil de temperatura de una muestra en una rejilla TEM y lograr mediciones muy precisas para mejorar su investigación. ^{[ 81 ]} De manera similar, un grupo de investigación en Alemania utilizó difracción de rayos X para medir ligeros desplazamientos en el espaciado de la red causados ​​por cambios de temperatura para calcular retrospectivamente la temperatura exacta en el portamuestras. Este proceso requirió una calibración cuidadosa y una óptica TEM precisa. ^{[ 82 ]} Otros ejemplos incluyen el uso de EELS para medir la temperatura local utilizando el cambio de densidad del gas, ^{[ 83 ]} y cambios de resistividad. ^{[ 77 ]}

La resolución óptima en un TEM se logra cuando las aberraciones esféricas se corrigen con la lente objetivo. Sin embargo, debido a la geometría de la mayoría de los TEM, la inserción de grandes portamuestras in situ obliga al usuario a comprometer la lente objetivo y tolerar las aberraciones esféricas. Por lo tanto, existe un compromiso entre el ancho del espacio entre las piezas polares y la resolución espacial inferior a 0,1  nm. Diversos grupos de investigación en distintas instituciones han intentado superar las aberraciones esféricas mediante el uso de monocromadores para lograr  una resolución de 0,05 nm con un  espacio entre piezas polares de 5 mm. ^{[ 84 ]}

La alta resolución de la TEM permite monitorizar la muestra en cuestión en una escala de longitud que abarca desde cientos de nanómetros hasta varios angstroms. Esto permite visualizar tanto la deformación elástica como la plástica mediante campos de deformación, así como el movimiento de defectos cristalográficos como distorsiones de la red y movimiento de dislocaciones . Al observar simultáneamente los fenómenos de deformación y medir la respuesta mecánica in situ, es posible conectar la información de los ensayos nanomecánicos con modelos que describen tanto la sutileza como la complejidad de cómo los materiales responden a la tensión y la deformación. ^{[ 85 ]} Las propiedades del material y la precisión de los datos obtenidos de dichos ensayos nanomecánicos dependen en gran medida del soporte de deformación mecánica utilizado. Los soportes de deformación actuales permiten realizar ensayos de tracción , nanoindentación , ensayos de compresión, ensayos de cizallamiento y ensayos de flexión en los materiales. ^{[ 86 ]}

Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) modernos para investigación pueden incluir correctores de aberraciones ^{[ 19 ]} para reducir la distorsión de la imagen. También se pueden utilizar monocromadores del haz incidente , que reducen la dispersión de energía del haz de electrones incidente a menos de 0,15 eV ^{[ 19 ]} . Entre los principales fabricantes de TEM con corrección de aberraciones se encuentran JEOL , Hitachi High-technologies, FEI Company y NION. 

Es posible alcanzar una resolución temporal muy superior a la de la velocidad de lectura de los detectores de electrones mediante el uso de electrones pulsados . Los pulsos pueden generarse modificando la fuente de electrones para permitir la fotoemisión activada por láser ^{[ 100 ]} o mediante la instalación de un obturador de haz ultrarrápido ^{[ 101 ]} . Este enfoque se denomina microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida cuando se utiliza iluminación estroboscópica de bombeo-sonda : la imagen se forma mediante la acumulación de muchos pulsos de electrones ultracortos (típicamente de cientos de femtosegundos) con un retardo de tiempo fijo entre la llegada del pulso de electrones y la excitación de la muestra. Por otro lado, el uso de pulsos de electrones individuales o de una secuencia corta con un número suficiente de electrones para formar una imagen a partir de cada pulso se denomina microscopía electrónica de transmisión dinámica. En la TEM ultrarrápida es posible alcanzar una resolución temporal de hasta cientos de femtosegundos y una resolución espacial comparable a la disponible con una fuente de emisión de campo Schottky . ^{[ 102 ]} Utilizando el enfoque de compuerta de fotones, ^{[ 103 ]} la resolución temporal en el microscopio electrónico ultrarrápido alcanza los 30 fs, lo que permite la obtención de imágenes de la dinámica atómica y electrónica ultrarrápida de la materia. ^{[ 104 ]} Sin embargo, la técnica solo puede obtener imágenes de procesos reversibles que pueden activarse de forma reproducible millones de veces. El TEM dinámico puede resolver procesos irreversibles de hasta decenas de nanosegundos y decenas de nanómetros. ^{[ 105 ]}

Esta técnica fue desarrollada a principios de la década de 2000 en laboratorios de Alemania ( Universidad Técnica de Berlín ^{[ 100 ]} ) y de Estados Unidos ( Caltech ^{[ 106 ] [ 107 ]} y Laboratorio Nacional Lawrence Livermore ^{[ 108 ] [ 109 ]} ). La microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida y la microscopía electrónica de transmisión dinámica han posibilitado la investigación en tiempo real de numerosos fenómenos físicos y químicos a nanoescala.

Una variante interesante de la técnica de microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida es la microscopía electrónica de campo cercano inducida por fotones (PINEM). Esta última se basa en el acoplamiento inelástico entre electrones y fotones en presencia de una superficie o una nanoestructura. ^{[ 110 ]} Este método permite investigar campos electromagnéticos a nanoescala variables en el tiempo en un microscopio electrónico, así como moldear dinámicamente las propiedades de onda del haz de electrones.

El límite de resolución obtenible en un TEM puede describirse de varias maneras y se suele denominar límite de información del microscopio. Un valor comúnmente utilizado es un valor de corte de la función de transferencia de contraste , una función que generalmente se expresa en el dominio de la frecuencia para definir la reproducción de las frecuencias espaciales de los objetos en el plano del objeto por la óptica del microscopio. Una frecuencia de corte, q _max , para la función de transferencia puede aproximarse con la siguiente ecuación, donde C _s es el coeficiente de aberración esférica y λ es la longitud de onda del electrón: ^{[ 39 ]}

${\displaystyle q_{\max }={\frac {1}{0.67(C_{\text{s}}\lambda ^{3})^{1/4}}}.}$

Para un  microscopio de 200 kV, con aberraciones esféricas parcialmente corregidas ("hasta el tercer orden") y un valor C _s  de 1 μm, ^{[ 112 ]} un valor de corte teórico podría ser 1/ q _max = 42 pm . ^{[ 39 ]} El mismo microscopio sin corrector tendría C _s = 0,5 mm y, por lo tanto, un corte de 200 pm. ^{[ 112 ]} Las aberraciones esféricas se suprimen hasta el tercer o quinto orden en los microscopios " con corrección de aberraciones ". Sin embargo, su resolución está limitada por la geometría de la fuente de electrones y las aberraciones cromáticas y de brillo en el sistema de lentes del objetivo. ^{[ 19 ] [ 113 ]}   

La representación en el dominio de la frecuencia de la función de transferencia de contraste a menudo puede tener una naturaleza oscilatoria, ^{[ 114 ]} que puede ajustarse modificando el valor focal de la lente del objetivo. Esta naturaleza oscilatoria implica que algunas frecuencias espaciales son captadas fielmente por el microscopio, mientras que otras se suprimen. Al combinar múltiples imágenes con diferentes frecuencias espaciales, el uso de técnicas como la reconstrucción de series focales puede utilizarse para mejorar la resolución del TEM de manera limitada. ^{[ 39 ]} La función de transferencia de contraste puede, hasta cierto punto, aproximarse experimentalmente mediante técnicas como la transformada de Fourier de imágenes de material amorfo, como el carbono amorfo .

Más recientemente, los avances en el diseño de correctores de aberraciones han permitido reducir las aberraciones esféricas ^{[ 115 ]} y alcanzar una resolución inferior a 0,5 ångströms (50  pm) ^{[ 113 ]} con aumentos superiores a 50  millones de veces. ^{[ 116 ]} La resolución mejorada permite la obtención de imágenes de átomos más ligeros que dispersan los electrones con menor eficiencia, como los átomos de litio en los materiales de las baterías de litio. ^{[ 117 ]} La ​​capacidad de determinar la posición de los átomos dentro de los materiales ha convertido al HRTEM en una herramienta indispensable para la investigación y el desarrollo de la nanotecnología en muchos campos, incluyendo la catálisis heterogénea y el desarrollo de dispositivos semiconductores para electrónica y fotónica. ^{[ 118 ]}