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Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Ejemplo de prueba de sensibilidad a los antibióticos. Se han colocado discos de papel delgados que contienen un antibiótico sobre una placa de agar con bacterias en crecimiento ...

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Ejemplo de prueba de sensibilidad a los antibióticos. Se han colocado discos de papel delgados que contienen un antibiótico sobre una placa de agar con bacterias en crecimiento . Las bacterias no pueden crecer alrededor de los antibióticos a los que son sensibles. Esto se denomina "zona de inhibición".

Las pruebas de sensibilidad o susceptibilidad a los antibióticos miden la susceptibilidad de las bacterias a estos fármacos . Se utilizan porque las bacterias pueden presentar resistencia a algunos antibióticos. Los resultados de estas pruebas permiten al médico cambiar la elección del antibiótico, pasando de una terapia empírica (en la que se selecciona un antibiótico basándose en la sospecha clínica sobre el sitio de la infección y las bacterias causantes más comunes) a una terapia dirigida (en la que la elección del antibiótico se basa en el conocimiento del microorganismo y su sensibilidad). [ 1 ]

Las pruebas de sensibilidad suelen realizarse en un laboratorio clínico y utilizan métodos de cultivo que exponen las bacterias a los antibióticos, o métodos genéticos que analizan si las bacterias poseen genes que confieren resistencia. Los métodos de cultivo a menudo implican la medición del diámetro de las áreas sin crecimiento bacteriano, denominadas zonas de inhibición, alrededor de discos de papel que contienen antibióticos en placas de cultivo de agar inoculadas uniformemente con bacterias. La concentración mínima inhibitoria (CMI), que es la concentración más baja del antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano, puede estimarse a partir del tamaño de la zona de inhibición utilizando directrices estandarizadas. [ 2 ]

Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos son necesarias desde el descubrimiento de la penicilina, un antibiótico betalactámico . Los métodos iniciales eran fenotípicos e implicaban cultivo o dilución. La prueba Etest , una tira impregnada con antibiótico, está disponible desde la década de 1980, y los métodos genéticos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), están disponibles desde principios de la década de 2000. Se están realizando investigaciones para mejorar los métodos actuales, haciéndolos más rápidos o precisos, así como para desarrollar nuevos métodos de análisis, como la microfluídica .

Usos

En medicina clínica, los antibióticos se prescriben con mayor frecuencia en función de los síntomas del paciente y las guías médicas . Este método de selección de antibióticos se denomina terapia empírica [ 1 ] y se basa en el conocimiento de qué bacterias causan una infección y a qué antibióticos pueden ser sensibles o resistentes. [ 1 ] El antibiograma combinado sindrómico de incidencia ponderada (WISCA) amplía este enfoque ponderando la incidencia local de patógenos frente a los datos de susceptibilidad para estimar la cobertura a nivel de síndrome para regímenes únicos o combinados. [ 3 ]

Por ejemplo, una simple infección del tracto urinario podría tratarse con trimetoprima/sulfametoxazol . [ 4 ] Esto se debe a que Escherichia coli es la bacteria causante más probable y puede ser sensible a esa combinación de antibióticos . [ 4 ] Sin embargo, las bacterias pueden ser resistentes a varias clases de antibióticos . [ 4 ] Esta resistencia podría deberse a que un tipo de bacteria tiene resistencia intrínseca a algunos antibióticos, [ 4 ] debido a la resistencia después de una exposición previa a antibióticos, [ 4 ] o porque la resistencia puede transmitirse desde otras fuentes, como plásmidos . [ 5 ] Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos proporcionan información sobre qué antibióticos tienen más probabilidades de ser exitosos y, por lo tanto, deberían usarse para tratar la infección. [ 1 ]

En algunos países, también se realizan pruebas de sensibilidad a los antibióticos a nivel poblacional como forma de cribado . [ 6 ] Esto permite evaluar las tasas basales de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, con Staphylococcus aureus resistente a la meticilina ) y puede influir en las directrices y las medidas de salud pública . [ 6 ] Se pueden utilizar herramientas de código abierto, como el paquete AMR para R , para estandarizar y analizar estos datos de susceptibilidad fenotípica a nivel poblacional en comparación con los puntos de corte internacionales. [ 7 ]

Métodos

Una vez identificada una bacteria mediante cultivo microbiológico , se seleccionan antibióticos para realizar pruebas de sensibilidad. [ 8 ] Los métodos de prueba de sensibilidad se basan en exponer las bacterias a antibióticos y observar su efecto en el crecimiento bacteriano (pruebas fenotípicas) o en identificar marcadores genéticos específicos ( pruebas genéticas ). [ 9 ] Los métodos utilizados pueden ser cualitativos, indicando si existe o no resistencia; o cuantitativos, utilizando una concentración mínima inhibitoria (CMI) para describir la concentración de antibiótico a la que una bacteria es sensible. [ 9 ]

Existen muchos factores que pueden afectar los resultados de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos, como fallas en el instrumento, temperatura, humedad y potencia del agente antimicrobiano. Las pruebas de control de calidad (CC) ayudan a garantizar la precisión de los resultados. [ 10 ] Organizaciones como la Colección Americana de Cultivos Tipo y la Colección Nacional de Cultivos Tipo proporcionan cepas de bacterias con fenotipos de resistencia conocidos que pueden utilizarse para el control de calidad. [ 11 ]

Métodos fenotípicos

Tres tubos de ensayo transparentes que contienen soluciones de turbidez progresivamente creciente.
De izquierda a derecha: estándares McFarland de 0,5, 1 y 2.

Las pruebas basadas en la exposición de bacterias a antibióticos utilizan placas de agar o diluciones en agar o caldo. [ 12 ] La selección de antibióticos dependerá del organismo cultivado y de los antibióticos disponibles localmente. [ 8 ] Para garantizar la precisión de los resultados, la concentración de bacterias que se añade al agar o caldo (el inóculo ) debe estandarizarse. Esto se logra comparando la turbidez de las bacterias suspendidas en solución salina o caldo con los estándares de McFarland , soluciones cuya turbidez es equivalente a la de una suspensión que contiene una concentración determinada de bacterias. Una vez alcanzada una concentración adecuada (generalmente un estándar de 0,5 McFarland) [ 13 ] , que puede determinarse mediante inspección visual o fotometría , el inóculo se añade al medio de cultivo . [ 14 ] [ 13 ]

Manual

El método de difusión en disco consiste en seleccionar una cepa bacteriana, colocarla en una placa de agar y observar el crecimiento bacteriano cerca de discos impregnados con antibiótico. [ 15 ] También se le conoce como el método de Kirby-Bauer , [ 16 ] aunque también se utilizan métodos modificados. [ 17 ] En algunos casos, las muestras de orina o las muestras de hemocultivo positivas se aplican directamente al medio de prueba, omitiendo el paso preliminar de aislar el organismo. [ 18 ] Si el antibiótico inhibe el crecimiento microbiano, se observa un anillo claro, o zona de inhibición, alrededor del disco. Las bacterias se clasifican como sensibles, intermedias o resistentes a un antibiótico comparando el diámetro de la zona de inhibición con umbrales definidos que se correlacionan con las CMI. [ 17 ] [ 19 ]

En una placa de agar sobre la que se ha colocado una tira con diferentes concentraciones de antibióticos, se observa un crecimiento bacteriano. Alrededor de las zonas con mayor concentración de antibiótico, se aprecia una zona elíptica sin crecimiento.
Ejemplo de una prueba Etest , que utiliza una tira de plástico impregnada con un antibiótico en diferentes concentraciones.

El agar Mueller-Hinton se usa frecuentemente en la prueba de difusión en disco. [ 17 ] El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) y el Comité Europeo de Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana (EUCAST) proporcionan estándares para el tipo y profundidad del agar, la temperatura de incubación y el método de análisis de los resultados. [ 14 ] La difusión en disco se considera el método más económico y sencillo para probar la sensibilidad, y se adapta fácilmente para probar antibióticos o formulaciones recientemente disponibles. [ 8 ] Algunas bacterias de crecimiento lento y exigentes no se pueden probar con precisión mediante este método, [ 8 ] mientras que otras, como las especies de Streptococcus y Haemophilus influenzae , se pueden probar, pero requieren medios de cultivo y condiciones de incubación especializados. [ 20 ]

Los métodos de gradiente, como el Etest , utilizan una tira de plástico colocada sobre agar. [ 8 ] Una tira de plástico impregnada con diferentes concentraciones de antibióticos se coloca sobre un medio de cultivo, y este se observa después de un período de incubación. [ 8 ] La concentración mínima inhibitoria se puede identificar según la intersección de la zona de inhibición en forma de lágrima con la marca en la tira. [ 8 ] Se pueden utilizar varias tiras para diferentes antibióticos. [ 8 ] Este tipo de prueba se considera una prueba de difusión. [ 21 ]

En los métodos de dilución en agar y caldo, las bacterias se colocan en varios tubos pequeños con diferentes concentraciones de antibióticos. [ 17 ] La sensibilidad de una bacteria se determina mediante inspección visual o métodos ópticos automáticos, tras un período de incubación. [ 8 ] La dilución en caldo se considera el método de referencia para las pruebas fenotípicas. [ 17 ] La concentración más baja de antibióticos que inhibe el crecimiento se considera la CMI. [ 8 ]

Automatizado

Existen sistemas automatizados que replican procesos manuales, por ejemplo, mediante el uso de imágenes y análisis de software para informar la zona de inhibición en pruebas de difusión, o dispensando muestras y determinando resultados en pruebas de dilución. [ 17 ] Los instrumentos automatizados, como los sistemas VITEK 2, BD Phoenix y Microscan, son la metodología más común para AST. Las especificaciones de cada instrumento varían, pero el principio básico implica la introducción de una suspensión bacteriana en paneles de antibióticos preformulados. Los paneles se incuban y la inhibición del crecimiento bacteriano por el antibiótico se mide automáticamente utilizando metodologías como turbidimetría , espectrofotometría o detección de fluorescencia . [ 22 ] Un sistema experto correlaciona las CMI con los resultados de susceptibilidad, [ 23 ] y los resultados se transmiten automáticamente al sistema de información del laboratorio para su validación e informe. Si bien estas pruebas automatizadas requieren menos mano de obra y están más estandarizadas que las pruebas manuales, su precisión puede ser relativamente baja para ciertos organismos y antibióticos, [ 24 ] por lo que la prueba de difusión en disco sigue siendo útil como método de respaldo. [ 25 ]

Métodos genéticos

Las pruebas genéticas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el microarreglo de ADN y la amplificación isotérmica mediada por bucles , pueden utilizarse para detectar si las bacterias poseen genes que confieren resistencia a los antibióticos. [ 12 ] [ 26 ] Un ejemplo es el uso de PCR para detectar el gen mecA para Staphylococcus aureus resistente a betalactámicos . [ 12 ] Otros ejemplos incluyen ensayos para probar los genes de resistencia a la vancomicina vanA y vanB en especies de Enterococcus , y la resistencia a los antibióticos en Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli . [ 12 ] Estas pruebas tienen la ventaja de ser directas y rápidas, en comparación con los métodos observables, [ 12 ] y tienen una alta probabilidad de detectar un hallazgo cuando hay uno que detectar. [ 27 ] Sin embargo, la detección de genes de resistencia no siempre coincide con el perfil de resistencia observado con el método fenotípico. [ 12 ] Las pruebas también son costosas y requieren personal específicamente capacitado. [ 28 ]

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método para identificar genes relacionados con la susceptibilidad a los antibióticos. [ 29 ] En el proceso de PCR, el ADN de una bacteria se desnaturaliza y las dos hebras de la doble hélice se separan. Se añaden cebadores específicos para el gen buscado a una solución que contiene el ADN, y se agrega una ADN polimerasa junto con una mezcla que contiene las moléculas necesarias (por ejemplo, nucleótidos e iones ). [ 28 ] Si el gen relevante está presente, cada vez que se ejecuta este proceso, la cantidad del gen objetivo se duplica. [ 28 ] Después de este proceso, la presencia de los genes se demuestra mediante diversos métodos, como electroforesis , Southern blotting y otros métodos de análisis de secuenciación de ADN . [ 28 ]

Los microarrays y chips de ADN utilizan la unión de ADN complementario a un gen o secuencia de ácido nucleico diana. [ 12 ] La ventaja de esto es que se pueden evaluar múltiples genes simultáneamente. [ 12 ]

En un estudio publicado en septiembre de 2024, se logró aislar selectivamente patógenos microbianos de muestras de hemocultivo en cuestión de horas mediante nanopartículas magnéticas recubiertas con un péptido de beta-2-glicoproteína I que imita una proteína plasmática. Se utilizaron imanes para extraer el complejo péptido-bacteria, seguido de pruebas genéticas. [ 30 ]

MALDI-TOF

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) es otro método de prueba de susceptibilidad. [ 9 ] Esta es una forma de espectrometría de masas de tiempo de vuelo , en la que las moléculas de una bacteria se someten a desorción láser asistida por matriz . [ 29 ] Las partículas ionizadas se aceleran y se registran los picos espectrales, produciendo un perfil de expresión, que es capaz de diferenciar cepas bacterianas específicas después de ser comparado con perfiles conocidos. [ 29 ] Esto incluye, en el contexto de las pruebas de susceptibilidad a antibióticos, cepas como E. coli productora de betalactamasa . [ 12 ] MALDI-TOF es rápido y automatizado. [ 12 ] Sin embargo, existen limitaciones para las pruebas en este formato; los resultados pueden no coincidir con los resultados de las pruebas fenotípicas, [ 12 ] y la adquisición y el mantenimiento son costosos. [ 28 ]

Informes

Las bacterias se clasifican como sensibles, resistentes o con resistencia intermedia a un antibiótico según la concentración mínima inhibitoria (CMI), que es la concentración más baja del antibiótico que detiene el crecimiento bacteriano. La CMI se compara con los valores umbral estándar (llamados "puntos de corte") para una bacteria y un antibiótico determinados. [ 31 ] Los puntos de corte para el mismo organismo y antibiótico pueden variar según el sitio de infección: [ 32 ] por ejemplo, el CLSI generalmente define a Streptococcus pneumoniae como sensible a la penicilina intravenosa si las CMI son ≤0,06 μg/ml, intermedio si las CMI son de 0,12 a 1 μg/ml y resistente si las CMI son ≥2 μg/ml, pero para los casos de meningitis , los puntos de corte son considerablemente más bajos. [ 33 ] A veces, la clasificación de un antibiótico como resistente también se basa en características bacterianas asociadas con métodos de resistencia conocidos, como el potencial de producción de betalactamasa . [ 31 ] [ 23 ] Se pueden observar patrones específicos de resistencia a los fármacos o resistencia a múltiples fármacos , como la presencia de una betalactamasa de espectro extendido . [ 31 ] Esta información puede ser útil para el médico, quien puede cambiar el tratamiento empírico a un tratamiento personalizado dirigido únicamente a la bacteria causante. [ 1 ] [ 12 ] Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana realizadas durante un período de tiempo determinado se pueden recopilar, generalmente en forma de tabla, para formar un antibiograma. [ 34 ] [ 35 ] Los antibiogramas ayudan al médico a seleccionar la mejor terapia antimicrobiana empírica basada en los patrones de resistencia locales hasta que estén disponibles los resultados de las pruebas de laboratorio. [ 35 ]

Práctica clínica

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Pruebas de resistencia a antibióticos : Las bacterias se siembran en placas con discos blancos, cada uno impregnado con un antibiótico diferente. Los anillos transparentes, como los de la izquierda, muestran que las bacterias no han crecido, lo que indica que estas bacterias no son resistentes. Las bacterias de la derecha son totalmente resistentes a todos los antibióticos analizados, excepto a dos de los siete. [ 36 ]

La terapia antibiótica ideal se basa en determinar el agente causal y su sensibilidad a los antibióticos. El tratamiento empírico suele iniciarse antes de que se disponga de los informes microbiológicos de laboratorio. Esto puede ocurrir en infecciones comunes o relativamente leves según las guías clínicas (como la neumonía adquirida en la comunidad ), o en infecciones graves, como la sepsis o la meningitis bacteriana , en las que el retraso en el tratamiento conlleva riesgos sustanciales. [ 1 ] La eficacia de los antibióticos individuales varía según la localización anatómica de la infección, la capacidad del antibiótico para llegar al sitio de la infección y la capacidad de la bacteria para resistir o inactivar el antibiótico. [ 37 ]

Las muestras para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos se recogen idealmente antes de iniciar el tratamiento. [ 1 ] Se puede tomar una muestra del sitio de una infección sospechada; como una muestra de hemocultivo cuando se sospecha la presencia de bacterias en el torrente sanguíneo ( bacteriemia ), una muestra de esputo en el caso de una neumonía o una muestra de orina en el caso de una infección del tracto urinario . A veces se pueden tomar varias muestras si no está clara la fuente de la infección. [ 1 ] Estas muestras se transfieren al laboratorio de microbiología donde se añaden a medios de cultivo , en los que las bacterias crecen hasta que están presentes en cantidades suficientes para realizar la identificación y las pruebas de sensibilidad. [ 38 ] [ 31 ]

Cuando se completa la prueba de sensibilidad a los antibióticos, se informará sobre los organismos presentes en la muestra y a qué antibióticos son sensibles. [ 31 ] Aunque la prueba de sensibilidad a los antibióticos se realiza en un laboratorio ( in vitro ), la información proporcionada suele ser clínicamente relevante para los antibióticos en una persona ( in vivo ). [ 39 ] A veces, se debe decidir para algunas bacterias si son la causa de una infección o simplemente bacterias comensales o contaminantes, [ 31 ] como Staphylococcus epidermidis [ 40 ] y otras infecciones oportunistas . Otras consideraciones pueden influir en la elección de antibióticos, incluida la necesidad de penetrar hasta un sitio infectado (como un absceso ) o la sospecha de que una o más causas de una infección no se detectaron en una muestra. [ 1 ]

Historia

Desde el descubrimiento del antibiótico betalactámico penicilina , las tasas de resistencia antimicrobiana han aumentado. [ 41 ] Con el tiempo, los métodos para evaluar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se han desarrollado y modificado. [ 28 ]

En la década de 1920, Alexander Fleming desarrolló el primer método de prueba de susceptibilidad. El "método del canal" que desarrolló era un método de difusión que implicaba la difusión de un antibiótico a través de un canal hecho de agar. [ 28 ] En la década de 1940, varios investigadores, incluidos Pope, Foster y Woodruff, Vincent y Vincent, utilizaron discos de papel en su lugar. [ 28 ] Todos estos métodos implican únicamente la prueba de susceptibilidad a la penicilina. [ 28 ] Los resultados eran difíciles de interpretar y poco fiables, debido a la inexactitud de los resultados y a la falta de estandarización entre laboratorios. [ 28 ]

La dilución se ha utilizado como método para cultivar e identificar bacterias desde la década de 1870, y como método para probar la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos desde 1929, también por Alexander Fleming. [ 28 ] La forma de determinar la susceptibilidad cambió de la turbidez de la solución al pH (en 1942), y luego a los instrumentos ópticos. [ 28 ] El uso de pruebas de "macrodilución" en tubos más grandes ha sido reemplazado por kits de "microdilución" más pequeños. [ 8 ]

En 1966, la Organización Mundial de la Salud confirmó el método de Kirby-Bauer como el método estándar para las pruebas de susceptibilidad; es simple, rentable y puede analizar múltiples antibióticos. [ 28 ]

La prueba Etest fue desarrollada en 1980 por Bolmstrӧm y Eriksson, y la MALDI-TOF se desarrolló en la década de 2000. [ 28 ] Se ha desarrollado una variedad de sistemas automatizados desde y después de la década de 1980. [ 28 ] La PCR fue la primera prueba genética disponible y se publicó por primera vez como método para detectar la susceptibilidad a los antibióticos en 2001. [ 28 ]

Investigación adicional

Se están desarrollando pruebas en el punto de atención para acelerar el tiempo de las pruebas y ayudar a los profesionales a evitar la prescripción de antibióticos innecesarios, al estilo de la medicina de precisión . [ 42 ] Las técnicas tradicionales suelen tardar entre 12 y 48 horas, [ 9 ] aunque pueden tardar hasta cinco días. [ 31 ] En cambio, las pruebas rápidas que utilizan diagnósticos moleculares se definen como "factibles dentro de un turno de trabajo de 8 horas". [ 9 ] El progreso ha sido lento debido a una serie de razones, incluidos el costo y la regulación. [ 43 ]

La investigación adicional se centra en las deficiencias de los métodos de prueba actuales. Además del tiempo que se tarda en informar los resultados de los métodos fenotípicos, estos son laboriosos, difíciles de transportar y de usar en entornos con recursos limitados, y existe la posibilidad de contaminación cruzada. [ 28 ]

A partir de 2017, los diagnósticos de resistencia en el punto de atención estaban disponibles para Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Mycobacterium tuberculosis resistente a la rifampicina (TB) y enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) a través de GeneXpert de la empresa de diagnóstico molecular Cepheid . [ 44 ]

En 2014, el Premio Longitude otorgó un premio de 8 millones de libras esterlinas al equipo de investigadores que desarrolló una prueba rápida, precisa y asequible para la detección de infecciones bacterianas en cualquier parte del mundo. En 2024, el premio fue concedido a Sysmex Astrego AB por una prueba rápida de 45 minutos para la susceptibilidad a los antibióticos en infecciones del tracto urinario , basada en imágenes de células individuales. [ 45 ]

Se está explorando la PCR cuantitativa con el fin de determinar el porcentaje de bacterias detectadas que poseen un gen de resistencia. [ 12 ] También se está explorando la secuenciación del genoma completo de bacterias aisladas, y es probable que se vuelva más accesible a medida que disminuyan los costos y aumente la velocidad con el tiempo. [ 12 ]

La prueba rápida de sensibilidad a los antibióticos (AST) fenotípica es un área de investigación activa que busca reducir el tiempo necesario para determinar la sensibilidad a los antibióticos. Los nuevos métodos pretenden detectar las respuestas bacterianas tempranas a los antibióticos mediante técnicas como la imagenología, los biosensores o los sistemas microfluídicos. Estos métodos monitorizan los cambios en el crecimiento, la morfología o la actividad metabólica bacteriana poco después de la exposición a los antibióticos, lo que permite determinar la sensibilidad más rápidamente que con los ensayos convencionales basados ​​en cultivos. [ 46 ]

Entre los métodos adicionales explorados se incluye la microfluídica , que utiliza una pequeña cantidad de fluido y diversos métodos de prueba, como ópticos, electroquímicos y magnéticos. [ 12 ] Estos ensayos no requieren mucho fluido para ser analizados, son rápidos y portátiles. [ 12 ]

Se ha explorado el uso de colorantes fluorescentes. [ 12 ] Estos implican proteínas marcadas dirigidas a biomarcadores , secuencias de ácidos nucleicos presentes en las células que se encuentran cuando la bacteria es resistente a un antibiótico. [ 12 ] Un aislado de bacterias se fija en una posición y luego se disuelve. El aislado se expone a un colorante fluorescente, que será luminiscente al ser observado. [ 12 ]

También se están explorando mejoras en las plataformas existentes, incluyendo mejoras en los sistemas de imágenes que permiten identificar más rápidamente la CMI en muestras fenotípicas; o el uso de enzimas bioluminiscentes que revelan el crecimiento bacteriano para hacer que los cambios sean más fácilmente visibles. [ 28 ]

Bibliografía

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