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Articulo de referencia

Hibridación in situ por fluorescencia

Visualización multiplex de ARN en células mediante ensayos FISH ViewRNA. Una célula en metafase con resultado positivo para el reordenamiento bcr/abl (asociado a la leucemia mie...

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Visualización multiplex de ARN en células mediante ensayos FISH ViewRNA.
Una célula en metafase con resultado positivo para el reordenamiento bcr/abl (asociado a la leucemia mieloide crónica ) detectado mediante FISH. Los cromosomas se observan en azul. El cromosoma marcado con puntos verdes y rojos (arriba a la izquierda) es aquel donde se presenta el reordenamiento.

La hibridación fluorescente in situ ( FISH ) es una técnica citogenética molecular que utiliza sondas fluorescentes que se unen a partes específicas de una secuencia de ácido nucleico con un alto grado de complementariedad de secuencia . Fue desarrollada por investigadores biomédicos a principios de la década de 1980 [ 1 ] para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias de ADN específicas en los cromosomas . La microscopía de fluorescencia se puede utilizar para determinar dónde se une la sonda fluorescente a los cromosomas. La FISH se utiliza frecuentemente para encontrar características específicas en el ADN para el asesoramiento genético , la medicina y la identificación de especies. [ 2 ]

La técnica FISH también puede utilizarse para detectar y localizar dianas de ARN específicas ( ARNm , ARNnc largo y ARNm pequeño ) [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] en células, células tumorales circulantes y muestras de tejido. En este contexto, ayuda a definir los patrones espaciales y temporales de la expresión génica dentro de las células y los tejidos.

Sondas – ARN y ADN

Visualización de la detección de ARNm de miR-133 (verde) y miogenina (rojo) en células C2C12 en diferenciación.

En biología, una sonda es una cadena simple de ADN o ARN que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de interés.

Las sondas de ARN se pueden diseñar para cualquier gen o cualquier secuencia dentro de un gen para la visualización de ARNm , [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] lncRNA [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] y miRNA en tejidos y células. FISH se utiliza examinando el ciclo de reproducción celular, específicamente la interfase de los núcleos para cualquier anomalía cromosómica. [ 12 ] FISH permite el análisis de una gran serie de casos de archivo mucho más fácilmente para identificar el cromosoma señalado mediante la creación de una sonda con una base cromosómica artificial que atraerá cromosomas similares. [ 12 ] Las señales de hibridación para cada sonda cuando se detecta una anomalía de nucleósido. [ 12 ] Cada sonda para la detección de ARNm y lncRNA está compuesta por ~20-50 pares de oligonucleótidos, cada par cubriendo un espacio de 40-50 pb. Los detalles dependen de la técnica FISH específica utilizada. Para la detección de miRNA, las sondas utilizan una química patentada para la detección específica de miRNA y cubren toda la secuencia de miRNA.

Células uroteliales marcadas con cuatro sondas diferentes.

Las sondas suelen derivarse de fragmentos de ADN que fueron aislados, purificados y amplificados para su uso en el Proyecto Genoma Humano . El tamaño del genoma humano es tan grande, en comparación con la longitud que se podía secuenciar directamente, que fue necesario dividirlo en fragmentos. (En el análisis posterior, estos fragmentos se ordenaron digiriendo una copia de cada fragmento en fragmentos aún más pequeños mediante endonucleasas específicas de secuencia, midiendo el tamaño de cada fragmento pequeño mediante cromatografía de exclusión por tamaño y utilizando esa información para determinar dónde se superponían los fragmentos grandes). Para preservar los fragmentos con sus secuencias de ADN individuales, se añadieron a un sistema de poblaciones bacterianas en continua replicación. Poblaciones clonales de bacterias, cada una con un único cromosoma artificial, se almacenan en diversos laboratorios de todo el mundo. Los cromosomas artificiales ( BAC ) se pueden cultivar, extraer y etiquetar en cualquier laboratorio que contenga una biblioteca. Las bibliotecas genómicas suelen llevar el nombre de la institución en la que se desarrollaron. Un ejemplo es la biblioteca RPCI-11, que recibe su nombre del Roswell Park Comprehensive Cancer Center (anteriormente conocido como Roswell Park Cancer Institute) en Buffalo, Nueva York . Estos fragmentos tienen aproximadamente 100 mil pares de bases y constituyen la base de la mayoría de las sondas FISH.

Proceso de preparación e hibridación – ARN

El propósito de usar RNA FISH es detectar transcritos de ARNm objetivo en células, secciones de tejido o incluso preparaciones completas. [ 13 ] El proceso se realiza en 3 pasos principales: preparación del tejido (pre-hibridación), hibridación y lavado (post-hibridación).

La preparación del tejido comienza con la recolección de las secciones de tejido apropiadas para realizar FISH de ARN. Primero, las células, las células tumorales circulantes (CTC), las secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) o congeladas se "fijan". La fijación implica el tratamiento de células vivas con un fijador químico como formaldehído al 4% o paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). [ 13 ] Este proceso de fijación esencialmente "preserva" la integridad estructural de las células antes de la permeabilización de la membrana celular [ 14 ] que normalmente se lleva a cabo con un detergente como triton-X , que es pertinente para la tinción celular ya que las células muertas ya no tienen una membrana funcional. [ 15 ] La permeabilización celular también se puede hacer utilizando una solución de etanol al 70% y refrigeración durante la noche. [ 15 ] Sin embargo, FISH también se ha realizado con éxito en células no fijadas. [ 16 ] Después de la fijación, las muestras se permeabilizan para permitir la penetración de los reactivos de hibridación. El uso de detergentes a una concentración del 0,1% se utiliza comúnmente para mejorar la permeabilidad de los tejidos, como Tween-20 o Triton X-100. [ 17 ]

Es fundamental que el proceso de hibridación cuente con todas las condiciones óptimas para obtener un resultado in situ exitoso, incluyendo la temperatura, el pH, la concentración de sal y el tiempo de la reacción de hibridación. Tras verificar todas las condiciones necesarias, se pueden iniciar los pasos de hibridación añadiendo primero una sonda específica para el objetivo, compuesta por 20 pares de oligonucleótidos, que se hibrida con el ARN objetivo. Sistemas de amplificación de señal independientes pero compatibles permiten el ensayo multiplex (hasta dos objetivos por ensayo). La amplificación de la señal se logra mediante una serie de pasos de hibridación secuenciales. [ 18 ]

Tras los pasos de hibridación, se realizan lavados. Estos pasos tienen como objetivo eliminar los híbridos no específicos y las moléculas de sonda no unidas a las muestras para reducir la señal de fondo. En esta etapa, se suelen utilizar lavados con etanol para reducir la autofluorescencia en tejidos o células. [ 19 ] Al finalizar el ensayo, las muestras de tejido se visualizan bajo un microscopio de fluorescencia, como el microscopio de fluorescencia confocal y el microscopio Keyence. [ 17 ]

Proceso de preparación e hibridación – ADN

Esquema del principio del experimento FISH para localizar un gen en el núcleo.

En primer lugar, se construye una sonda. Esta debe ser lo suficientemente grande como para hibridar específicamente con su diana, pero no tanto como para impedir el proceso de hibridación. La sonda se marca directamente con fluoróforos , con dianas para anticuerpos o con biotina . El marcaje puede realizarse de diversas maneras, como mediante traducción de muescas o reacción en cadena de la polimerasa utilizando nucleótidos marcados .

A continuación, se prepara un cromosoma en interfase o metafase . Los cromosomas se fijan firmemente a un sustrato , generalmente vidrio. Las secuencias de ADN repetitivas deben bloquearse añadiendo fragmentos cortos de ADN a la muestra. Posteriormente, se aplica la sonda al ADN del cromosoma y se incuba durante aproximadamente 12 horas para que se produzca la hibridación. Varios lavados eliminan las sondas no hibridadas o parcialmente hibridadas. Finalmente, los resultados se visualizan y cuantifican mediante un microscopio capaz de excitar el colorante y registrar imágenes.

Si la señal fluorescente es débil, puede ser necesario amplificarla para superar el umbral de detección del microscopio . La intensidad de la señal fluorescente depende de muchos factores, como la eficiencia del marcaje de la sonda, el tipo de sonda y el tipo de colorante. Los anticuerpos o la estreptavidina marcados con fluorescencia se unen a la molécula del colorante. Estos componentes secundarios se seleccionan para que generen una señal intensa.

Variaciones en las sondas y el análisis

La técnica FISH es muy general. Las diferencias entre las distintas técnicas FISH suelen deberse a variaciones en la secuencia y el marcaje de las sondas, así como a su combinación. Las sondas se dividen en dos categorías genéricas: celulares y acelulares. En la hibridación fluorescente in situ, se hace referencia a la colocación de la sonda dentro de la célula.

El tamaño de la sonda es importante porque las sondas más cortas se hibridan con menor especificidad que las más largas, por lo que a menudo se utilizan hebras de ADN o ARN suficientemente largas (generalmente de 10 a 25 nucleótidos) que sean complementarias a una secuencia diana determinada para localizarla. El solapamiento define la resolución de las características detectables. Por ejemplo, si el objetivo de un experimento es detectar el punto de ruptura de una translocación , el solapamiento de las sondas —el grado en que una secuencia de ADN está contenida en las sondas adyacentes— define la ventana mínima en la que se puede detectar el punto de ruptura.

La mezcla de secuencias de sonda determina el tipo de característica que la sonda puede detectar. Las sondas que se hibridan a lo largo de un cromosoma completo se utilizan para contar el número de un cromosoma determinado, mostrar translocaciones o identificar fragmentos extracromosómicos de cromatina . Esto se conoce como "pintura de cromosoma completo". Si se utilizara cada sonda posible, cada cromosoma (el genoma completo) se marcaría fluorescentemente, lo que no sería particularmente útil para determinar las características de secuencias individuales. Sin embargo, es posible crear una mezcla de sondas más pequeñas que sean específicas para una región particular (locus) del ADN; estas mezclas se utilizan para detectar mutaciones por deleción . Cuando se combina con un color específico, una mezcla de sondas específicas de locus se utiliza para detectar translocaciones muy específicas. Las mezclas especiales de sondas específicas de locus se utilizan a menudo para contar cromosomas, uniéndose a las regiones centroméricas de los cromosomas, que son lo suficientemente distintivas como para identificar cada cromosoma (con la excepción de los cromosomas 13 , 14 , 21 y 22 ).

Otras técnicas emplean mezclas de sondas de diferentes colores. Se puede detectar una gama de colores en mezclas de colorantes fluorescentes, lo que permite identificar cada cromosoma humano mediante un color característico utilizando mezclas de sondas para cromosomas completos y diversas proporciones de colores. Aunque existen más cromosomas que colores de colorantes fluorescentes fácilmente distinguibles, se pueden utilizar proporciones de mezclas de sondas para crear colores secundarios . De forma similar a la hibridación genómica comparativa , la mezcla de sondas para los colores secundarios se crea mezclando la proporción correcta de dos conjuntos de sondas de diferentes colores para el mismo cromosoma. Esta técnica se conoce a veces como M-FISH.

La misma física que permite la variedad de colores en M-FISH se puede utilizar para la detección de translocaciones. Es decir, los colores adyacentes parecen superponerse, observándose un color secundario. Algunos ensayos están diseñados para que el color secundario esté presente o ausente en los casos de interés. Un ejemplo es la detección de translocaciones BCR/ABL , donde el color secundario indica enfermedad. Esta variante se conoce como FISH de doble fusión o D-FISH. En el caso opuesto, donde la ausencia del color secundario es patológica, se ilustra con un ensayo utilizado para investigar translocaciones en las que solo se conoce o permanece constante uno de los puntos de ruptura. Se crean sondas específicas para un lado del punto de ruptura y el otro para el cromosoma intacto. En células normales, se observa el color secundario, pero solo se observan los colores primarios cuando se produce la translocación. Esta técnica se conoce a veces como "FISH de separación".

FISH de ARN de molécula única

La técnica FISH de ARN de molécula única, también conocida como Stellaris® RNA FISH [ 20 ] o smFISH [ 21 ], es un método para detectar y cuantificar ARNm y otras moléculas de ARN largas en una fina capa de muestra de tejido. Los objetivos se pueden visualizar de forma fiable mediante la aplicación de múltiples sondas de oligonucleótidos cortas marcadas individualmente [ 22 ] . La unión de hasta 48 oligonucleótidos marcados con fluorescencia a una sola molécula de ARNm proporciona suficiente fluorescencia para detectar y localizar con precisión cada ARNm objetivo en una imagen de microscopía de fluorescencia de campo amplio . Las sondas que no se unen a la secuencia prevista no alcanzan la fluorescencia localizada suficiente para distinguirse del fondo [ 23 ] .

Los ensayos FISH de ARN de molécula única se pueden realizar de forma simple o múltiple , y se pueden utilizar como experimento de seguimiento de la PCR cuantitativa , o visualizar simultáneamente con un ensayo de anticuerpos fluorescentes . Esta tecnología tiene aplicaciones potenciales en el diagnóstico del cáncer , [ 24 ] la neurociencia , el análisis de la expresión génica , [ 25 ] y los diagnósticos complementarios .

PESCADO DE FIBRA

En una técnica alternativa a las preparaciones de interfase o metafase, la técnica FISH de fibra, los cromosomas en interfase se adhieren a un portaobjetos de forma que se extienden en línea recta, en lugar de estar enrollados, como en la FISH convencional, o adoptar una conformación de territorio cromosómico , como en la FISH de interfase. Esto se logra aplicando una tensión mecánica a lo largo del portaobjetos, ya sea a células fijadas y posteriormente lisadas , o a una solución de ADN purificado. Para este fin se utiliza cada vez más una técnica conocida como peinado cromosómico . La conformación extendida de los cromosomas permite una resolución mucho mayor, incluso de unos pocos kilobases . La preparación de muestras para FISH de fibra, aunque conceptualmente sencilla, requiere mucha habilidad, y solo los laboratorios especializados utilizan esta técnica de forma rutinaria. [ 26 ]

Q-FISH

La técnica Q-FISH combina FISH con PNA y software informático para cuantificar la intensidad de la fluorescencia. Esta técnica se utiliza habitualmente en la investigación de la longitud de los telómeros .

Flow-FISH

La técnica Flow-FISH utiliza citometría de flujo para realizar FISH automáticamente mediante mediciones de fluorescencia por célula.

MA-PEZ

La técnica FISH asistida por microfluídica ( MA-FISH ) utiliza un flujo microfluídico para aumentar la eficiencia de la hibridación del ADN, disminuyendo el consumo de sondas FISH costosas y reduciendo el tiempo de hibridación. MA-FISH se aplica para detectar el gen HER2 en tejidos de cáncer de mama. [ 27 ]

MAR-FISH

La microautorradiografía FISH es una técnica que combina sustratos radiomarcados con FISH convencional para detectar simultáneamente grupos filogenéticos y actividades metabólicas. [ 28 ]

Fusión híbrida-FISH

La técnica Hybrid Fusion FISH ( HF-FISH ) utiliza una combinación de excitación/emisión aditiva primaria de fluoróforos para generar espectros adicionales mediante un proceso de marcaje conocido como transmisión óptica dinámica (DOT). Tres fluoróforos primarios pueden generar un total de 7 espectros de emisión fácilmente detectables como resultado del marcaje combinatorio mediante DOT. Hybrid Fusion FISH permite aplicaciones FISH de alta multiplexación dirigidas a paneles de oncología clínica. Esta tecnología ofrece una puntuación más rápida con conjuntos de sondas eficientes que se pueden detectar fácilmente con microscopios de fluorescencia tradicionales.

MIREFA

La hibridación in situ por fluorescencia multiplexada y robusta frente a errores [ 29 ] es una versión altamente multiplexada de smFISH. Utiliza marcaje combinatorio, seguido de obtención de imágenes y, posteriormente, codificación resistente a errores [ 29 ] para capturar un elevado número de moléculas de ARN y su localización espacial dentro de la célula. La captura de un gran número de moléculas de ARN permite dilucidar las redes de regulación génica, predecir la función de genes no anotados e identificar patrones de distribución de moléculas de ARN que se correlacionan con sus proteínas asociadas.

ESTRELLA DE MAR

Starfish es un conjunto de herramientas de software desarrolladas en 2019 por un consorcio de científicos para analizar datos de nueve variantes diferentes de FISH, ya que todas producen el mismo conjunto de datos: valores de expresión génica mapeados a coordenadas x e y en una célula. El software, creado para todos los científicos, no solo para bioinformáticos, lee un conjunto de imágenes, elimina el ruido e identifica moléculas de ARN. Este enfoque se ha propuesto definir un esquema de análisis estándar para conjuntos de datos FISH de forma similar al análisis transcriptómico de células individuales . [ 30 ]

Aplicaciones médicas

A menudo, los padres de niños con discapacidad del desarrollo desean saber más sobre la condición de su hijo antes de decidir tener otro hijo. Estas inquietudes pueden abordarse mediante el análisis del ADN de los padres y del niño. En los casos en que no se comprende la discapacidad del desarrollo del niño, su causa puede determinarse potencialmente mediante técnicas FISH y citogenéticas . Ejemplos de enfermedades que se diagnostican mediante FISH incluyen el síndrome de Prader-Willi , el síndrome de Angelman , el síndrome de deleción 22q13 , la leucemia mieloide crónica , la leucemia linfoblástica aguda , el síndrome de Cri-du-chat , el síndrome velocardiofacial y el síndrome de Down . El FISH en espermatozoides está indicado para hombres con un cariotipo somático o meiótico anormal , así como para aquellos con oligozoospermia , ya que aproximadamente el 50 % de los hombres oligozoospérmicos tienen una mayor tasa de anomalías cromosómicas en los espermatozoides. [ 31 ] El análisis de los cromosomas 21, X e Y es suficiente para identificar a los individuos oligozoospérmicos en riesgo. [ 31 ]

En medicina, la técnica FISH se puede utilizar para realizar un diagnóstico , evaluar el pronóstico o la remisión de una enfermedad, como el cáncer . De esta manera, se puede personalizar el tratamiento. Un examen tradicional que implica el análisis de cromosomas en metafase a menudo no logra identificar características que distingan una enfermedad de otra, debido a sutiles variaciones cromosómicas; la técnica FISH puede dilucidar estas diferencias. Además, FISH permite detectar células enfermas con mayor facilidad que los métodos citogenéticos estándar , que requieren células en división y una preparación y análisis manual de las muestras por parte de un técnico, lo que consume mucho tiempo y esfuerzo. FISH, en cambio, no requiere células vivas y se puede cuantificar automáticamente; un ordenador cuenta los puntos fluorescentes presentes. Sin embargo, se requiere un técnico capacitado para distinguir las sutiles diferencias en los patrones de bandas de los cromosomas en metafase doblados o retorcidos. FISH se puede integrar en dispositivos microfluídicos de laboratorio en un chip . Esta tecnología aún se encuentra en fase de desarrollo, pero, al igual que otros métodos de laboratorio en un chip, podría dar lugar a técnicas de diagnóstico más portátiles. [ 32 ] [ 33 ]

Esta figura describe el proceso de hibridación fluorescente in situ (FISH) utilizado para la identificación de patógenos. Primero, se toma una muestra del tejido infectado del paciente. Luego, se sintetiza un oligonucleótido complementario al código genético del patógeno sospechoso y se marca químicamente con una sonda fluorescente. La muestra de tejido recolectada debe ser tratada químicamente para que las membranas celulares sean permeables al oligonucleótido marcado con fluorescencia. Después del tratamiento, se añade el oligonucleótido complementario marcado. Este oligonucleótido marcado con fluorescencia se unirá únicamente al ADN complementario del patógeno sospechoso. Si el patógeno está presente en la muestra de tejido, sus células emitirán fluorescencia tras el tratamiento con el oligonucleótido marcado. Las demás células no emitirán fluorescencia.
Proceso general de hibridación fluorescente in situ (FISH) utilizado para la identificación de patógenos bacterianos. Primero, se toma una muestra de tejido infectado del paciente. Luego, se marca químicamente un oligonucleótido complementario al código genético del patógeno sospechoso con una sonda fluorescente. La muestra de tejido se trata químicamente para que las membranas celulares sean permeables al oligonucleótido marcado con fluorescencia. Posteriormente, se añade la sonda fluorescente, que se une únicamente al ADN complementario del patógeno sospechoso. Si el patógeno está presente en la muestra de tejido, las células del patógeno emitirán fluorescencia tras el tratamiento con el oligonucleótido marcado. Ninguna otra célula emitirá fluorescencia.

identificación de especies

La técnica FISH se ha estudiado ampliamente como método de diagnóstico para la identificación de patógenos en el campo de la microbiología médica. [ 34 ] Si bien se ha demostrado su utilidad y aplicabilidad, su uso aún no está generalizado en los laboratorios de diagnóstico. El corto tiempo de diagnóstico (menos de 2 horas) representa una gran ventaja en comparación con la diferenciación bioquímica, pero esta ventaja se ve superada por la espectrometría de masas MALDI-TOF, que permite la identificación de una gama más amplia de patógenos. El uso de FISH con fines diagnósticos ha demostrado su utilidad cuando se requiere una identificación inmediata de especies, especialmente en el análisis de hemocultivos, donde FISH es una técnica económica y sencilla para un diagnóstico preliminar rápido. [ 34 ]

La técnica FISH también se puede utilizar para comparar los genomas de dos especies biológicas y deducir relaciones evolutivas . Una técnica de hibridación similar se denomina zooblot . Las sondas FISH bacterianas suelen ser cebadores para la región del ARNr 16S .

La técnica FISH se utiliza ampliamente en el campo de la ecología microbiana para identificar microorganismos . Los biofilms , por ejemplo, están compuestos por organizaciones bacterianas complejas (a menudo) multiespecíficas. La preparación de sondas de ADN para una especie y la realización de FISH con dicha sonda permite visualizar la distribución de esta especie específica dentro del biofilm. La preparación de sondas (de dos colores diferentes) para dos especies permite a los investigadores visualizar y estudiar la colocalización de estas dos especies en el biofilm, lo que puede ser útil para determinar la microarquitectura del mismo.

Hibridación genómica comparativa

La hibridación genómica comparativa puede describirse como un método que utiliza FISH de forma paralela con la comparación de la fuerza de hibridación para detectar cualquier alteración importante en el proceso de duplicación de las secuencias de ADN en el genoma del núcleo. [ 35 ]

Cariotipo espectral

El cariotipado espectral es una técnica que consiste en la obtención de imágenes de cromosomas coloreados. Esta técnica utiliza la técnica FISH (Fishing in situ) con múltiples sondas, lo que permite visualizar cada cromosoma etiquetado a lo largo de su metafase. Se emplea específicamente para el estudio de la disposición cromosómica.

Alternativas

cariotipo virtual

El cariotipado virtual es otra alternativa rentable y clínicamente disponible a los paneles FISH, que utiliza miles o millones de sondas en una sola matriz para detectar cambios en el número de copias en todo el genoma con una resolución sin precedentes. Actualmente, este tipo de análisis solo detecta ganancias y pérdidas de material cromosómico y no detecta reordenamientos equilibrados, como translocaciones e inversiones, que son aberraciones características de muchos tipos de leucemia y linfoma.

Evolución cromosómica

Cromosomas humanos marcados con ADN del cromosoma 11 del ratón que muestran señales de hibridación en los cromosomas humanos 17, 5, 2, 7 y 22, así como en otros cromosomas. Es decir, un cromosoma ancestral se fragmentó en múltiples partes que aún se pueden encontrar en muchos cromosomas humanos. [ 36 ]

La técnica FISH se puede utilizar para estudiar la evolución de los cromosomas . Las especies emparentadas tienen cromosomas similares. Esta homología se puede detectar mediante la secuenciación de genes o genomas , pero también mediante FISH. Por ejemplo, los cromosomas humanos y de chimpancés son muy similares, y FISH puede demostrar que el ancestro común de chimpancés y humanos tenía dos cromosomas más pequeños, que en el linaje humano se fusionaron para dar lugar a un cromosoma humano. De manera similar, las especies más distantemente emparentadas tienen cromosomas similares, pero a medida que aumenta la distancia genética, los cromosomas tienden a romperse y fusionarse, dando lugar a cromosomas mosaico. Esto se puede demostrar de forma impresionante mediante FISH (véase la figura). [ 36 ]

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • Hibridación fluorescente in situ en los encabezamientos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
  • Información sobre la fibra FISH de la Corporación Olympus
  • Una guía sobre fibra FISH de Octavian Henegariu
  • Protocolo Fibre FISH archivado el 23/10/2006 en la Wayback Machine del Proyecto Genoma Humano en el Centro Sanger.
  • CARD-FISH, BioMineWiki Archivado el 28/07/2020 en Wayback Machine
  • Preparación de conjuntos complejos de sondas de ADN para FISH 3D con hasta seis fluorocromos diferentes.
  • Notas técnicas y protocolos FISH de GeneDetect.com
  • Hibridación fluorescente in situ. Fotos de bacterias. Archivadas el 5 de febrero de 2015 en Wayback Machine.
  • Diseño racional de mezclas de sondas de polinucleótidos para identificar genes específicos en taxones definidos: www.dnaBaser.com/PolyPro