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Plásmido

Diagrama de una bacteria que muestra el ADN cromosómico y los plásmidos (sin escala). Un plásmido es una pequeña molécula de ADN extracromosómico dentro de una célula que está f...

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Diagrama de una bacteria que muestra el ADN cromosómico y los plásmidos (sin escala).

Un plásmido es una pequeña molécula de ADN extracromosómico dentro de una célula que está físicamente separada del ADN cromosómico y puede replicarse de forma independiente. Se encuentran más comúnmente como pequeñas moléculas de ADN circular de doble cadena en bacterias [ 1 ] y arqueas ; [ 2 ] sin embargo, los plásmidos a veces también están presentes en organismos eucariotas . [ 3 ] [ 4 ] Los plásmidos a menudo portan genes útiles, como los involucrados en la resistencia a antibióticos , virulencia , [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] metabolismo secundario [ 8 ] y biorremediación . [ 9 ] [ 10 ] Mientras que los cromosomas son grandes y contienen toda la información genética esencial para vivir en condiciones normales, los plásmidos suelen ser muy pequeños y contienen genes adicionales para circunstancias especiales.

Los plásmidos artificiales se utilizan ampliamente como vectores en la clonación molecular , sirviendo para impulsar la replicación de secuencias de ADN recombinante dentro de los organismos huéspedes. En el laboratorio, los plásmidos pueden introducirse en una célula mediante transformación . Los plásmidos sintéticos están disponibles para su compra en internet a través de diversos proveedores que utilizan secuencias enviadas, generalmente diseñadas con software; si un diseño no funciona, el proveedor puede realizar modificaciones adicionales a partir de la secuencia enviada. [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]

Los plásmidos se consideran replicones , unidades de ADN capaces de replicarse de forma autónoma dentro de un huésped adecuado. Sin embargo, los plásmidos, al igual que los virus , generalmente no se clasifican como vida . [ 14 ] Los plásmidos se transmiten de una bacteria a otra (incluso de otra especie) principalmente a través de la conjugación . [ 5 ] Esta transferencia de material genético de huésped a huésped es un mecanismo de transferencia horizontal de genes , y los plásmidos se consideran parte del mobiloma . A diferencia de los virus, que encapsulan su material genético en una cubierta proteica protectora llamada cápside , los plásmidos son ADN "desnudo" y no codifican los genes necesarios para encapsular el material genético para su transferencia a un nuevo huésped; sin embargo, algunas clases de plásmidos codifican el pilus "sexual" conjugativo necesario para su propia transferencia. Los plásmidos varían en tamaño de 1 a más de 400 k pb , [ 15 ] y el número de plásmidos idénticos en una sola célula puede variar de uno a miles.

Historia

El término plásmido fue acuñado en 1952 por el biólogo molecular estadounidense Joshua Lederberg para referirse a "cualquier determinante hereditario extracromosómico". [ 16 ] [ 17 ] El uso inicial del término incluía cualquier material genético bacteriano que existiera extracromosómicamente durante al menos parte de su ciclo de replicación, pero debido a que esa descripción incluye virus bacterianos, la noción de plásmido se refinó con el tiempo para referirse a elementos genéticos que se reproducen de forma autónoma. [ 18 ] Más tarde, en 1968, se decidió que el término plásmido debía adoptarse como término para elemento genético extracromosómico, [ 19 ] y para distinguirlo de los virus, la definición se restringió a elementos genéticos que existen exclusiva o predominantemente fuera del cromosoma, pueden replicarse de forma autónoma y contribuyen a la transferencia de elementos móviles entre bacterias no relacionadas. [ 5 ] [ 6 ] [ 18 ]

Propiedades y características

Hay dos tipos de integración de plásmidos en una bacteria huésped: los plásmidos no integradores se replican como en el ejemplo superior, mientras que los episomas , el ejemplo inferior, pueden integrarse en el cromosoma del huésped .

Para que los plásmidos se repliquen de forma independiente dentro de una célula, deben poseer un segmento de ADN que actúe como origen de replicación . La unidad autorreplicante, en este caso el plásmido, se denomina replicón . Un replicón bacteriano típico puede constar de varios elementos, como el gen de la proteína de iniciación de la replicación específica del plásmido (Rep), unidades repetitivas llamadas iterones , cajas DnaA y una región adyacente rica en AT. [ 18 ] Los plásmidos más pequeños utilizan las enzimas replicativas del huésped para replicarse, mientras que los plásmidos más grandes pueden contener genes específicos para su replicación. Algunos tipos de plásmidos también pueden insertarse en el cromosoma del huésped, y estos plásmidos integrativos se denominan a veces episomas en procariotas . [ 20 ]

Los plásmidos casi siempre portan al menos un gen. Muchos de los genes que porta un plásmido son beneficiosos para las células huésped, por ejemplo: permiten que la célula huésped sobreviva en un entorno que de otro modo sería letal o restrictivo para el crecimiento. Algunos de estos genes codifican rasgos de resistencia a antibióticos o a metales pesados, mientras que otros pueden producir factores de virulencia que permiten a una bacteria colonizar un huésped y superar sus defensas, o tener funciones metabólicas específicas que permiten a la bacteria utilizar un nutriente en particular, incluida la capacidad de degradar compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos. [ 21 ] Los plásmidos también pueden proporcionar a las bacterias la capacidad de fijar nitrógeno . Algunos plásmidos, llamados plásmidos crípticos , no parecen proporcionar ninguna ventaja clara a su huésped, pero aun así persisten en las poblaciones bacterianas. [ 22 ] Sin embargo, estudios recientes muestran que pueden desempeñar un papel en la resistencia a los antibióticos al contribuir a la heterorresistencia dentro de las poblaciones bacterianas. [ 23 ]

Los plásmidos naturales varían enormemente en sus propiedades físicas. Su tamaño puede oscilar entre miniplásmidos muy pequeños de menos de 1 kilobase (kpb) y megaplásmidos muy grandes de varios megabases (Mpb). En el extremo superior, hay poca diferencia entre un megaplásmido y un minicromosoma . Los plásmidos son generalmente circulares, pero también se conocen ejemplos de plásmidos lineales. Estos plásmidos lineales requieren mecanismos especializados para replicar sus extremos. [ 18 ]

Los plásmidos pueden estar presentes en una célula individual en cantidades variables, desde una hasta varios cientos. El número normal de copias de plásmido que se pueden encontrar en una sola célula se denomina número de copias del plásmido y está determinado por cómo se regula el inicio de la replicación y el tamaño de la molécula. Los plásmidos más grandes tienden a tener un menor número de copias. [ 20 ] Los plásmidos de bajo número de copias que existen solo como una o pocas copias en cada bacteria, corren el riesgo de perderse en una de las bacterias segregantes durante la división celular . Estos plásmidos de copia única poseen sistemas que intentan distribuir activamente una copia a ambas células hijas. Estos sistemas, que incluyen el sistema parABS y el sistema parMRC , se conocen a menudo como el sistema de partición o la función de partición de un plásmido. [ 24 ]

Los plásmidos de forma lineal son desconocidos entre los fitopatógenos con una excepción, Rhodococcus fascians . [ 25 ]

Clasificaciones y tipos

Descripción general de la conjugación bacteriana
Micrografía electrónica de un haz de fibras de ADN, presumiblemente de un único bucle cromosómico bacteriano.
Micrografía electrónica de un plásmido de ADN bacteriano (fragmento cromosómico).

Los plásmidos pueden clasificarse de diversas maneras. A grandes rasgos, se dividen en plásmidos conjugativos y no conjugativos. Los plásmidos conjugativos contienen un conjunto de genes de transferencia que promueven la conjugación sexual entre diferentes células. [ 20 ] En el complejo proceso de conjugación , los plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra mediante pili sexuales codificados por algunos de los genes de transferencia (véase la figura). [ 26 ] Los plásmidos no conjugativos son incapaces de iniciar la conjugación, por lo que solo pueden transferirse con la ayuda de plásmidos conjugativos. Una clase intermedia de plásmidos son movilizables y portan solo un subconjunto de los genes necesarios para la transferencia. Pueden parasitar un plásmido conjugativo, transfiriéndose con alta frecuencia únicamente en su presencia. [ 27 ]

Los plásmidos también se pueden clasificar en grupos de incompatibilidad. Un microbio puede albergar diferentes tipos de plásmidos, pero estos solo pueden existir en una misma célula bacteriana si son compatibles. Si dos plásmidos no son compatibles, uno u otro se perderá rápidamente de la célula. Por lo tanto, los diferentes plásmidos pueden asignarse a diferentes grupos de incompatibilidad según si pueden coexistir. Los plásmidos incompatibles (que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad) normalmente comparten los mismos mecanismos de replicación o partición y, por lo tanto, no pueden mantenerse juntos en una misma célula. [ 28 ] [ 29 ] La tipificación de incompatibilidad (o tipificación Inc) se realizaba tradicionalmente mediante métodos de fenotipificación genética, probando si las células transmitían de forma estable pares de plásmidos a su progenie. [ 30 ] Esto ha sido reemplazado en gran medida por métodos genéticos como la PCR y, más recientemente, por métodos de secuenciación del genoma completo con herramientas bioinformáticas como PlasmidFinder. [ 31 ]

Otra forma de clasificar los plásmidos es por su función. Existen cinco clases principales:

  • Los plásmidos F de fertilidad , que contienen genes tra , son capaces de conjugarse y dan lugar a la expresión de pili sexuales . [ 17 ] [ 32 ] Los plásmidos F se clasifican como (+) o (-) y contribuyen a la diferencia de ser donante o receptor durante la conjugación. [ 17 ] [ 32 ] [ 33 ]
  • Los plásmidos de resistencia (R), que contienen genes que proporcionan resistencia contra antibióticos o agentes antibacterianos, fueron descubiertos por primera vez en 1959. [ 34 ] Los factores R se consideraron un factor contribuyente para la propagación de la resistencia a múltiples fármacos en bacterias; algunos plásmidos R ayudan en la transmisibilidad de otros factores R específicamente no autotransmisibles. [ 35 ] [ 36 ] Históricamente conocidos como factores R, antes de que se comprendiera la naturaleza de los plásmidos.
  • Los plásmidos Col contienen genes que codifican bacteriocinas , proteínas que pueden matar a otras bacterias.
  • Plásmidos degradativos, que permiten la digestión de sustancias inusuales, como el tolueno y el ácido salicílico .
  • Plásmidos de virulencia, que convierten a la bacteria en un patógeno . Por ejemplo, el plásmido Ti en Agrobacterium tumefaciens . Las bacterias bajo presión selectiva conservarán los plásmidos que contienen factores de virulencia, ya que esto representa un beneficio para su supervivencia. La eliminación de la presión selectiva puede provocar la pérdida de un plásmido debido a que el gasto energético necesario para mantenerlo ya no se justifica. [ 7 ] [ 37 ]

Los plásmidos pueden pertenecer a más de uno de estos grupos funcionales.

Tipificación de plásmidos basada en secuencias

Con la mayor disponibilidad de la secuenciación del genoma completo, capaz de capturar la secuencia genética de los plásmidos, se han desarrollado métodos para agrupar o tipificar plásmidos en función de su contenido de secuencia. La tipificación de secuencias multilocus de plásmidos (pMLST) se basa en la tipificación de secuencias multilocus cromosómicas mediante la comparación de la secuencia de genes de la maquinaria de replicación con bases de datos de secuencias previamente clasificadas. Si el alelo de la secuencia coincide con la base de datos, se utiliza para la clasificación del plásmido y, por lo tanto, tiene mayor sensibilidad que una simple prueba de presencia o ausencia de estos genes. [ 31 ]

Un método relacionado consiste en utilizar la identidad nucleotídica promedio entre plásmidos para encontrar vecinos genéticos cercanos. Entre las herramientas que utilizan este enfoque se incluyen COPLA [ 38 ] y MOB-cluster [ 39 ] .

Se ha demostrado que la creación de clasificaciones de tipificación mediante aprendizaje no supervisado , es decir, sin una base de datos preexistente o "sin referencia", es útil para agrupar plásmidos en nuevos conjuntos de datos sin sesgos ni limitaciones a las representaciones en una base de datos preconstruida; entre las herramientas para ello se incluye mge-cluster. [ 40 ] Dado que los plásmidos cambian con frecuencia su contenido y orden genético, modelar las distancias genéticas entre ellos mediante métodos diseñados para mutaciones puntuales puede dar lugar a estimaciones deficientes de la verdadera distancia evolutiva entre plásmidos. Herramientas como pling encuentran regiones de secuencia homólogas entre plásmidos y reconstruyen con mayor precisión el número de eventos evolutivos ( variantes estructurales ) entre cada par, para luego utilizar enfoques de agrupamiento no supervisado para agrupar plásmidos. [ 41 ]

plásmidos de ARN

Aunque la mayoría de los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena, algunos consisten en ADN de cadena simple o, predominantemente, en ARN de doble cadena . Los plásmidos de ARN son replicones de ARN lineal extracromosómicos no infecciosos, tanto encapsidados como no encapsidados, que se han encontrado en hongos y diversas plantas, desde algas hasta plantas terrestres. Sin embargo, en muchos casos, puede ser difícil o imposible distinguir claramente los plásmidos de ARN de los virus de ARN y otros ARN infecciosos. [ 42 ]

Cromidos

Los cromidos son elementos que existen en el límite entre un cromosoma y un plásmido, presentes en aproximadamente el 10 % de las especies bacterianas secuenciadas hasta 2009. Estos elementos portan genes centrales y tienen un uso de codones similar al del cromosoma, pero utilizan un mecanismo de replicación de tipo plásmido, como el RepABC de bajo número de copias. Por ello, en el pasado se han clasificado de diversas maneras como minicromosomas o megaplásmidos. [ 43 ] En Vibrio , la bacteria sincroniza la replicación del cromosoma y el cromido mediante una relación de tamaño del genoma conservada. [ 44 ]

Vectores

Los plásmidos construidos artificialmente pueden usarse como vectores en ingeniería genética . Estos plásmidos sirven como herramientas importantes en laboratorios de genética y biotecnología, donde se usan comúnmente para clonar y amplificar (hacer muchas copias de) o expresar genes particulares. [ 45 ] Una amplia variedad de plásmidos está disponible comercialmente para tales usos. El gen que se va a replicar normalmente se inserta en un plásmido que generalmente contiene una serie de características para su uso. Estas incluyen un gen que confiere resistencia a antibióticos particulares ( la ampicilina es la más utilizada para cepas bacterianas), un origen de replicación que permite a las células bacterianas replicar el ADN del plásmido y un sitio adecuado para la clonación (denominado sitio de clonación múltiple ).

La inestabilidad estructural del ADN puede definirse como una serie de eventos espontáneos que culminan en una reorganización, pérdida o ganancia imprevista de material genético. Estos eventos suelen desencadenarse por la transposición de elementos móviles o por la presencia de elementos inestables, como estructuras no canónicas (no-B). Las regiones accesorias pertenecientes al esqueleto bacteriano pueden participar en una amplia gama de fenómenos de inestabilidad estructural. Entre los catalizadores bien conocidos de la inestabilidad genética se incluyen las repeticiones directas, invertidas y en tándem, que se sabe que son conspicuas en un gran número de vectores de clonación y expresión disponibles comercialmente. [ 46 ] Las secuencias de inserción también pueden afectar gravemente la función y el rendimiento del plásmido, al provocar deleciones y reorganizaciones, activación, regulación negativa o inactivación de la expresión de genes vecinos . [ 47 ] Por lo tanto, la reducción o eliminación completa de secuencias no codificantes extrañas del esqueleto reduciría notablemente la propensión a que ocurran estos eventos y, en consecuencia, el potencial recombinogénico general del plásmido. [ 48 ] [ 49 ]

Representación esquemática del plásmido pBR322 , uno de los primeros plásmidos ampliamente utilizados como vector de clonación . En el diagrama del plásmido se muestran los genes que codifica ( amp y tet para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina , respectivamente), su origen de replicación ( ori ) y varios sitios de restricción (indicados en azul).

Clonación

Los plásmidos son los vectores de clonación bacteriana más utilizados. [ 50 ] Estos vectores de clonación contienen un sitio que permite la inserción de fragmentos de ADN, por ejemplo, un sitio de clonación múltiple o un polienlazador que tiene varios sitios de restricción de uso común a los que se pueden ligar los fragmentos de ADN . Después de insertar el gen de interés, los plásmidos se introducen en las bacterias mediante un proceso llamado transformación . Estos plásmidos contienen un marcador seleccionable , generalmente un gen de resistencia a antibióticos, que confiere a las bacterias la capacidad de sobrevivir y proliferar en un medio de cultivo selectivo que contiene los antibióticos específicos. Las células después de la transformación se exponen al medio selectivo, y solo las células que contienen el plásmido pueden sobrevivir. De esta manera, los antibióticos actúan como un filtro para seleccionar solo las bacterias que contienen el ADN del plásmido. El vector también puede contener otros genes marcadores o genes reporteros para facilitar la selección de plásmidos con inserciones clonadas. Las bacterias que contienen el plásmido se pueden cultivar en grandes cantidades, cosechar y luego aislar el plásmido de interés utilizando varios métodos de preparación de plásmidos .

Un vector de clonación de plásmido se usa típicamente para clonar fragmentos de ADN de hasta 15 kbp . [ 51 ] Para clonar longitudes más largas de ADN, se usan fagos lambda con genes de lisogenia eliminados, cósmidos , cromosomas artificiales bacterianos o cromosomas artificiales de levadura .

Vectores suicidas (plásmidos)

Los vectores suicidas son plásmidos que no pueden replicarse en la célula huésped y, por lo tanto, deben integrarse en el cromosoma o desaparecer. [ 52 ] Un ejemplo de estos vectores es el plásmido pMQ30. Este plásmido contiene el gen SacB de Bacillus subtilis , que puede ser inducido por sacarosa y será letal cuando se exprese en bacterias Gram negativas. [ 53 ] La ventaja de este sistema (monitoreo de éxito en dos pasos) se muestra cuando el diseño del experimento requiere que un gen objetivo se integre en el cromosoma del huésped bacteriano. En el primer paso, después de transformar las células huésped con el plásmido, se puede usar un medio con un antibiótico específico para seleccionar las bacterias que contienen el plásmido. El segundo paso asegura que solo las bacterias con el plásmido integrado sobrevivirán. Dado que el plásmido contiene el gen SacB que induce toxicidad en presencia de sacarosa, solo las bacterias que tienen el plásmido integrado en su cromosoma sobrevivirán y crecerán.

Producción de proteínas

Insulina

Otro uso importante de los plásmidos es la producción de grandes cantidades de proteínas. En este caso, los investigadores cultivan bacterias que contienen un plásmido con el gen de interés. Así como la bacteria produce proteínas para conferirle resistencia a los antibióticos, también se la puede inducir a producir grandes cantidades de proteínas a partir del gen insertado. Este es un método económico y sencillo para la producción masiva de proteínas; por ejemplo, la rápida reproducción de E. coli con un plásmido que contiene el gen de la insulina permite una gran producción de insulina. [ 54 ] [ 55 ] [ 56 ]

terapia génica

Los plásmidos también pueden utilizarse para la transferencia génica como un posible tratamiento en terapia génica , permitiendo la expresión de la proteína que falta en las células. Algunas formas de terapia génica requieren la inserción de genes terapéuticos en sitios cromosómicos específicos del genoma humano . Los vectores plasmídicos son una de las muchas estrategias que podrían emplearse para este fin. Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) permiten inducir una ruptura de doble cadena específica en el genoma del ADN y provocar la recombinación homóloga . Los plásmidos que codifican ZFN podrían ayudar a administrar un gen terapéutico en un sitio específico, evitando así el daño celular , las mutaciones cancerígenas o la respuesta inmunitaria . [ 57 ]

modelos de enfermedades

Históricamente, los plásmidos se utilizaban para modificar genéticamente las células madre embrionarias de ratas y crear modelos genéticos de enfermedades en estos animales. La limitada eficiencia de las técnicas basadas en plásmidos impedía su uso en la creación de modelos celulares humanos más precisos. Sin embargo, los avances en las técnicas de recombinación de virus adenoasociados y en las nucleasas de dedos de zinc han permitido la creación de una nueva generación de modelos isogénicos de enfermedades humanas .

Grupo de genes biosintéticos (BGC)

Los plásmidos ayudan a transportar grupos de genes biosintéticos (BGC), un conjunto de genes que contienen todas las enzimas necesarias para la producción de metabolitos especiales (conocidos formalmente como metabolitos secundarios ). [ 58 ] Una ventaja del uso de plásmidos para transferir BGC se demuestra al utilizar un huésped adecuado que puede producir en masa metabolitos especializados; algunas de estas moléculas pueden controlar la población microbiana. [ 59 ] [ 60 ] Los plásmidos pueden contener y expresar varios BGC, y se sabe que algunos plásmidos son exclusivos para la transferencia de BGC. [ 60 ] Los BGC también se pueden transferir al cromosoma del organismo huésped, utilizando un vector plasmídico, lo que permite realizar estudios en experimentos de inactivación génica. [ 61 ] Al utilizar plásmidos para la captación de BGC, los microorganismos pueden obtener una ventaja, ya que la producción no se limita a genes de biosíntesis de resistencia a antibióticos, sino que también incluye la producción de toxinas /antitoxinas. [ 62 ]

Episomas

El término episoma fue introducido por François Jacob y Élie Wollman en 1958 para referirse al material genético extracromosómico que puede replicarse de forma autónoma o integrarse en el cromosoma. [ 63 ] [ 64 ] Sin embargo, desde su introducción, su uso ha cambiado, ya que plásmido se ha convertido en el término preferido para el ADN extracromosómico que se replica de forma autónoma. En un simposio celebrado en Londres en 1968, algunos participantes sugirieron que se abandonara el término episoma , aunque otros continuaron utilizándolo con un cambio de significado. [ 65 ] [ 66 ]

Actualmente, algunos autores utilizan el término episoma en el contexto de los procariotas para referirse a un plásmido capaz de integrarse en el cromosoma. Los plásmidos integrativos pueden replicarse y mantenerse estables en una célula a lo largo de varias generaciones, pero en algún momento existirán como una molécula de plásmido independiente. [ 67 ]

En el contexto de los eucariotas, el término episoma se utiliza para referirse a una molécula de ADN circular cerrada extracromosómica no integrada que puede replicarse en el núcleo. [ 68 ] [ 69 ] Los virus son los ejemplos más comunes, como los herpesvirus , los adenovirus y los poliomavirus , pero algunos son plásmidos. Otros ejemplos incluyen fragmentos cromosómicos aberrantes, como los cromosomas doble minuto , que pueden surgir durante amplificaciones génicas artificiales o en procesos patológicos (p. ej., transformación de células cancerosas). Los episomas en eucariotas se comportan de manera similar a los plásmidos en procariotas, ya que el ADN se mantiene estable y se replica con la célula huésped. También pueden ocurrir episomas virales citoplasmáticos (como en las infecciones por poxvirus ). Algunos episomas, como los herpesvirus, se replican mediante un mecanismo de círculo rodante , similar a los bacteriófagos (virus fago bacterianos). Otros se replican mediante un mecanismo de replicación bidireccional ( plásmidos de tipo Theta ). En ambos casos, los episomas permanecen físicamente separados de los cromosomas de la célula huésped. Varios virus cancerígenos, incluidos el virus de Epstein-Barr y el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi , se mantienen como episomas latentes y cromosómicamente distintos en las células cancerosas, donde expresan oncogenes que promueven la proliferación celular. En los cánceres, estos episomas se replican pasivamente junto con los cromosomas del huésped durante la división celular. Cuando estos episomas virales inician la replicación lítica para generar múltiples partículas virales, generalmente activan los mecanismos de defensa de la inmunidad innata celular , que provocan la muerte de la célula huésped.

Mantenimiento de plásmidos

Algunos plásmidos o huéspedes microbianos incluyen un sistema de adicción o sistema de muerte postsegregacional (PSK), como el sistema hok/sok (muerte del huésped/supresor de la muerte) del plásmido R1 en Escherichia coli . [ 70 ] Esta variante produce tanto un veneno de larga duración como un antídoto de corta duración . Se han descrito varios tipos de sistemas de adicción de plásmidos (toxina/antitoxina, basados ​​en el metabolismo, sistemas ORT) en la literatura [ 71 ] y se utilizan en aplicaciones biotecnológicas (fermentación) o biomédicas (terapia con vacunas). Las células hijas que conservan una copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que no hereda el plásmido muere o sufre una tasa de crecimiento reducida debido al veneno persistente de la célula madre. Finalmente, la productividad general podría mejorarse.

En cambio, los plásmidos utilizados en biotecnología, como pUC18, pBR322 y los vectores derivados, casi nunca contienen sistemas de adicción toxina-antitoxina y, por lo tanto, deben mantenerse bajo presión antibiótica para evitar la pérdida del plásmido.

Plásmidos en eucariotas

Los plásmidos replicados y expresados ​​por la maquinaria celular eucariota pueden residir en el citoplasma o en el núcleo celular , y cada plásmido presenta preferencias distintas. Además, los eucariotas poseen dos orgánulos endosimbióticos con su propio genoma y maquinaria genética : la mitocondria y el cloroplasto . Cada uno de ellos puede albergar plásmidos, además de la molécula genómica principal del orgánulo.

plásmidos citoplasmáticos eucariotas

plásmidos citoplasmáticos de levadura

Los plásmidos pGKL lineales naturales de Kluyveromyces lactis son responsables de los fenotipos letales . Se pueden insertar en la levadura común de panadería S. cerevisiae . [ 72 ]

plásmidos nucleares eucariotas

Los plásmidos entran en el núcleo durante la división celular, donde se enrollan en la envoltura nuclear a medida que esta se reforma. Por consiguiente, los plásmidos nucleares no funcionan en células que no se dividen. [ 73 ]

plásmidos nucleares de levadura

El plásmido natural de 2 micras (llamado así porque mide aproximadamente 2  μm) se encuentra en la levadura común de panadería S. cerevisiae . Reside en el núcleo en 30 a 40 copias por célula. A menudo se modifica para la ingeniería genética de la levadura. [ 74 ]

Otros tipos de plásmidos suelen estar relacionados con vectores de clonación de levadura, entre los que se incluyen:

  • Plásmido integrativo de levadura (YIp) , vectores de levadura que dependen de la integración en el cromosoma del huésped para su supervivencia y replicación. Generalmente se modifican para convertirlos en vectores de clonación cuando se estudia la funcionalidad de un gen individual o cuando el gen es tóxico. También está relacionado con el gen URA3, que codifica una enzima relacionada con la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina (T, C).
  • El plásmido replicativo de levadura (YRp) transporta una secuencia de ADN cromosómico que incluye un origen de replicación. Estos plásmidos son menos estables, ya que pueden perderse durante la gemación.

plásmidos nucleares de mamíferos

Los plásmidos artificiales se introducen en células de mamíferos para que produzcan un determinado producto génico. También se utilizan para identificar y estudiar cuantitativamente elementos reguladores , partiendo de la premisa de que estos elementos en un plásmido actuarían de forma similar a una copia en el cromosoma. [ 75 ]

Interacción con la cromatina

Al ser secuencias de ADN en el núcleo, la molécula de plásmido también interactúa con las proteínas histonas .

  • En la levadura, pBR327 produce cromatina bien formada gracias a la alineación de los nucleosomas por la histona H5. Se ha descubierto que una región específica de 800 pb induce esta alineación, sin la cual no se produce. [ 76 ]
  • Mamíferos: la célula HEK 293 forma nucleosomas alrededor de pEGFP-N1 tanto intacto como dañado, pero la estructura es anómala en comparación con la cromatina propiamente dicha de los cromosomas. [ 77 ] En 2025, se descubrió que la formación de la cromatina está guiada por las secuencias del plásmido (como en el cromosoma), pero solo algunas secuencias producen la estructura "nativa" que se encuentra en el cromosoma. [ 75 ]

Plásmidos organelares eucariotas

Plásmidos mitocondriales de plantas naturales

Las mitocondrias de muchas plantas superiores contienen moléculas de ADN lineales o circulares extracromosómicas autorreplicantes que se han considerado plásmidos. Estos pueden variar de 0,7 kb a 20 kb de tamaño. Los plásmidos se han clasificado generalmente en dos categorías: circulares y lineales. [ 78 ] Se han aislado y encontrado plásmidos circulares en muchas plantas diferentes, siendo los de Vicia faba y Chenopodium album los más estudiados y cuyo mecanismo de replicación es conocido. Los plásmidos circulares pueden replicarse utilizando el modelo de replicación θ (como en Vicia faba ) y a través de la replicación en círculo rodante (como en C. album ). [ 79 ] Se han identificado plásmidos lineales en algunas especies de plantas como Beta vulgaris , Brassica napus , Zea mays , etc., pero son más raros que sus contrapartes circulares.

La función y el origen de estos plásmidos siguen siendo en gran medida desconocidos. Se ha sugerido que los plásmidos circulares comparten un ancestro común; algunos genes del plásmido mitocondrial tienen homólogos en el ADN nuclear, lo que sugiere un intercambio entre compartimentos. Por otro lado, los plásmidos lineales comparten similitudes estructurales, como invertrones, con el ADN viral y los plásmidos fúngicos; al igual que estos últimos, también presentan un bajo contenido de GC. Estas observaciones han llevado a plantear la hipótesis de que estos plásmidos lineales tienen un origen viral o que han llegado a las mitocondrias de las plantas mediante transferencia horizontal de genes desde hongos patógenos. [ 78 ] [ 80 ]

Estudio de plásmidos

Extracción de ADN plasmídico

Los plásmidos se utilizan a menudo para purificar una secuencia específica, ya que se pueden separar fácilmente del resto del genoma. Para su uso como vectores y para la clonación molecular , los plásmidos suelen necesitar ser aislados.

Existen varios métodos para aislar ADN plasmídico de bacterias, desde kits de extracción de plásmidos ( miniprep, maxiprep o bulkprep ), lisis alcalina , lisis enzimática y lisis mecánica. [ 45 ] El primero se puede usar para determinar rápidamente si el plásmido es correcto en cualquiera de varios clones bacterianos. El resultado es una pequeña cantidad de ADN plasmídico impuro, suficiente para el análisis mediante digestión con enzimas de restricción y para algunas técnicas de clonación.

En este último caso, se cultivan volúmenes mucho mayores de suspensión bacteriana a partir de los cuales se puede realizar una maxipreparación. En esencia, se trata de una minipreparación a mayor escala seguida de una purificación adicional. Esto da como resultado cantidades relativamente grandes (varios cientos de microgramos) de ADN plasmídico de alta pureza.

Se han creado numerosos kits comerciales para realizar la extracción de plásmidos a diferentes escalas, con distintos grados de pureza y niveles de automatización.

Conformaciones

El ADN plasmídico puede presentarse en una de cinco conformaciones, las cuales (para un tamaño dado) se desplazan a diferentes velocidades en un gel durante la electroforesis . Las conformaciones se enumeran a continuación en orden de movilidad electroforética (velocidad para un voltaje aplicado dado), de la más lenta a la más rápida:

  • El ADN circular abierto con una muesca tiene una hebra cortada.
  • El ADN circular relajado está completamente intacto, con ambas hebras sin cortar, pero ha sido relajado enzimáticamente (se han eliminado las superhélices). Esto se puede simular dejando que un cable de extensión retorcido se desenrolle y se relaje, y luego conectándolo a sí mismo.
  • El ADN lineal tiene extremos libres, ya sea porque ambas hebras se han cortado o porque el ADN era lineal in vivo . Esto se puede modelar con un cable de extensión eléctrica que no está enchufado a sí mismo.
  • El ADN superenrollado (o circular cerrado covalentemente ) se encuentra completamente intacto, con ambas hebras sin cortar y con una torsión integral, lo que da como resultado una forma compacta. Esto se puede visualizar retorciendo un cable de extensión y luego conectándolo a sí mismo.
  • El ADN desnaturalizado superenrollado es similar al ADN superenrollado , pero tiene regiones no apareadas que lo hacen ligeramente menos compacto; esto puede ser consecuencia de una alcalinidad excesiva durante la preparación del plásmido.

La velocidad de migración de pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado a bajos voltajes. A voltajes más altos, los fragmentos más grandes migran a velocidades que aumentan continuamente, pero que varían entre sí. Por lo tanto, la resolución de un gel disminuye al aumentar el voltaje.

A un voltaje bajo y específico, la velocidad de migración de pequeños fragmentos de ADN lineales depende de su longitud. Los fragmentos lineales grandes (de más de 20 kb aproximadamente) migran a una velocidad fija, independientemente de su longitud. Esto se debe a que las moléculas "respiran", y la mayor parte de la molécula sigue el extremo líder a través de la matriz del gel. Las digestiones con enzimas de restricción se utilizan frecuentemente para analizar plásmidos purificados. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas. Los fragmentos lineales resultantes forman "bandas" después de la electroforesis en gel . Es posible purificar ciertos fragmentos cortando las bandas del gel y disolviendo el gel para liberar los fragmentos de ADN.

Debido a su conformación compacta, el ADN superenrollado migra más rápido a través de un gel que el ADN lineal o circular abierto.

Software para bioinformática y diseño

El uso de plásmidos como técnica en biología molecular se apoya en software bioinformático . Estos programas registran la secuencia de ADN de los vectores plasmídicos, ayudan a predecir los sitios de corte de las enzimas de restricción y a planificar manipulaciones. Algunos ejemplos de paquetes de software que manejan mapas de plásmidos son ApE, Clone Manager , GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler , LabGenius, Lasergene, MacVector , pDraw32, Serial Cloner, UGENE , VectorFriends, Vector NTI y WebDSV. Estos programas ayudan a realizar experimentos completos in silico antes de llevar a cabo experimentos de laboratorio. [ 81 ]

Colecciones de plásmidos

Se han creado muchos plásmidos a lo largo de los años y los investigadores los han donado a bases de datos de plásmidos como las organizaciones sin ánimo de lucro Addgene y BCCM/GeneCorner . Es posible encontrar y solicitar plásmidos de estas bases de datos para la investigación. Los investigadores también suelen subir secuencias de plásmidos a la base de datos del NCBI , desde donde se pueden recuperar secuencias de plásmidos específicos. Se han realizado múltiples esfuerzos para crear bases de datos curadas y con control de calidad a partir de estas secuencias cargadas; un ejemplo temprano es el de Orlek et al . [ 82 ] , que se limitó a plásmidos de Enterobacteriaceae , mientras que COMPASS también abarcó plásmidos de otras bacterias. Más recientemente, se creó PLSDB [ 83 ] como una base de datos curada más actualizada de plásmidos del NCBI, y a fecha de 2024 contiene más de 72 000 entradas. [ 84 ] Una base de datos similar es pATLAS, que además incluye herramientas de análisis visual para mostrar las relaciones entre plásmidos. [ 85 ] La base de datos de plásmidos más grande creada a partir de datos disponibles públicamente es IMG/PR, que no solo contiene secuencias completas de plásmidos recuperadas de NCBI, sino también genomas de plásmidos nuevos encontrados a partir de metagenomas y metatranscriptomas. [ 86 ]

Se han creado otros conjuntos de datos mediante la secuenciación y el cálculo de genomas de plásmidos a partir de colecciones bacterianas preexistentes, por ejemplo, la colección NORM [ 87 ] [ 88 ] y la colección Murray. [ 89 ] [ 90 ]

Además de los repositorios académicos y sin fines de lucro, el ADN plasmídico también se produce a escala industrial por empresas de biotecnología especializadas que apoyan la terapia génica y el desarrollo biofarmacéutico, incluidas Aldevron , Cobra Biologics y 3PBIOVIAN . [ 91 ]

Véase también

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Lecturas adicionales

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  • Sociedad Internacional de Biología de Plásmidos y otros Elementos Genéticos Móviles
  • ¿Qué es la biotecnología?
  • Historia de los plásmidos con cronología