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Plegamiento de proteínas

Proteína antes y después del plegamiento Resultados del plegamiento de proteínas El plegamiento de proteínas es el proceso físico mediante el cual una proteína , tras su síntesi...

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Proteína antes y después del plegamiento
Resultados del plegamiento de proteínas

El plegamiento de proteínas es el proceso físico mediante el cual una proteína , tras su síntesis por un ribosoma como una cadena lineal de aminoácidos , pasa de una conformación aleatoria inestable a una estructura tridimensional más ordenada . Esta estructura permite que la proteína se vuelva biológicamente funcional o activa. [ 1 ]

El plegamiento de muchas proteínas comienza incluso durante la traducción de la cadena polipeptídica. Los aminoácidos interactúan entre sí para producir una estructura tridimensional bien definida, conocida como el estado nativo de la proteína . Esta estructura está determinada por la secuencia de aminoácidos o estructura primaria . [ 2 ]

La estructura tridimensional correcta es esencial para la función, aunque algunas partes de las proteínas funcionales pueden permanecer desplegadas , [ 3 ] lo que indica que la dinámica de las proteínas es importante. La falta de plegamiento en una estructura nativa generalmente produce proteínas inactivas, pero en algunos casos, las proteínas mal plegadas tienen una funcionalidad modificada o tóxica. Se cree que varias enfermedades neurodegenerativas y otras enfermedades resultan de la acumulación de fibrillas amiloides formadas por proteínas mal plegadas, cuyas variedades infecciosas se conocen como priones . [ 4 ] Muchas alergias son causadas por el plegamiento incorrecto de algunas proteínas porque el sistema inmunitario no produce los anticuerpos para ciertas estructuras proteicas. [ 5 ]

La desnaturalización de las proteínas es un proceso de transición de un estado plegado a uno desplegado . Ocurre al cocinar , en quemaduras , en proteinopatías y en otros contextos. La estructura residual presente, si la hay, en el estado supuestamente desplegado puede formar un sitio de inicio del plegamiento y guiar las reacciones de plegamiento subsiguientes. [ 6 ]

La duración del proceso de plegamiento varía drásticamente según la proteína de interés. Cuando se estudian fuera de la célula , las proteínas de plegamiento más lento requieren muchos minutos u horas para plegarse, principalmente debido a la isomerización de la prolina , y deben pasar por varios estados intermedios, como puntos de control, antes de que el proceso se complete. [ 7 ] Por otro lado, las proteínas de dominio único muy pequeñas con longitudes de hasta cien aminoácidos generalmente se pliegan en un solo paso. [ 8 ] Las escalas de tiempo de milisegundos son la norma, y ​​las reacciones de plegamiento de proteínas más rápidas conocidas se completan en unos pocos microsegundos. [ 9 ] La escala de tiempo de plegamiento de una proteína depende de su tamaño, orden de contacto y topología del circuito . [ 10 ]

Comprender y simular el proceso de plegamiento de las proteínas ha sido un reto importante para la biología computacional desde finales de la década de 1960.

Proceso de plegamiento de proteínas

Estructura primaria

La estructura primaria de una proteína, su secuencia lineal de aminoácidos, determina su conformación nativa. [ 11 ] Los residuos de aminoácidos específicos y su posición en la cadena polipeptídica son los factores determinantes para que las porciones de la proteína se plieguen estrechamente y formen su conformación tridimensional. La composición de aminoácidos no es tan importante como la secuencia. [ 12 ] Sin embargo, el hecho esencial del plegamiento sigue siendo que la secuencia de aminoácidos de cada proteína contiene la información que especifica tanto la estructura nativa como la vía para alcanzar ese estado. Esto no significa que las secuencias de aminoácidos casi idénticas siempre se plieguen de manera similar. [ 13 ] Las conformaciones difieren también según factores ambientales; proteínas similares se pliegan de manera diferente según dónde se encuentren.

Estructura secundaria

La formación espiral de la hélice alfa
Una lámina beta plisada antiparalela que muestra enlaces de hidrógeno dentro de la cadena principal.

La formación de una estructura secundaria es el primer paso en el proceso de plegamiento que una proteína realiza para asumir su estructura nativa. Las estructuras características de la estructura secundaria son las conocidas como hélices alfa y láminas beta que se pliegan rápidamente porque están estabilizadas por enlaces de hidrógeno intramoleculares , como fue caracterizado por primera vez por Linus Pauling . La formación de enlaces de hidrógeno intramoleculares proporciona otra contribución importante a la estabilidad de la proteína. [ 14 ] Las hélices α se forman por enlaces de hidrógeno del esqueleto para formar una forma espiral (ver figura de la derecha). [ 12 ] La lámina β plegada es una estructura que se forma cuando el esqueleto se dobla sobre sí mismo para formar los enlaces de hidrógeno (como se muestra en la figura de la izquierda). Los enlaces de hidrógeno se encuentran entre el hidrógeno amida y el oxígeno carbonilo del enlace peptídico . Existen láminas β plegadas antiparalelas y láminas β plegadas paralelas, donde la estabilidad de los enlaces de hidrógeno es mayor en la lámina β antiparalela, ya que forma enlaces de hidrógeno con un ángulo ideal de 180 grados en comparación con los enlaces de hidrógeno inclinados que forman las láminas paralelas. [ 12 ]

Estructura terciaria

Las hélices α y las láminas β suelen ser anfipáticas, lo que significa que poseen una porción hidrofílica y otra hidrofóbica. Esta capacidad contribuye a la formación de la estructura terciaria de una proteína, en la que el plegamiento se produce de manera que los lados hidrofílicos se orientan hacia el entorno acuoso que rodea a la proteína y los lados hidrofóbicos hacia el núcleo hidrofóbico de la misma. [ 15 ] La estructura secundaria da paso jerárquicamente a la formación de la estructura terciaria. Una vez formada y estabilizada la estructura terciaria de la proteína mediante interacciones hidrofóbicas, también puede haber enlaces covalentes en forma de puentes disulfuro formados entre dos residuos de cisteína . Estos contactos no covalentes y covalentes adoptan una disposición topológica específica en la estructura nativa de una proteína. La estructura terciaria de una proteína implica una única cadena polipeptídica; sin embargo, las interacciones adicionales de las cadenas polipeptídicas plegadas dan lugar a la formación de la estructura cuaternaria. [ 16 ]

Estructura cuaternaria

La estructura terciaria puede dar paso a la formación de una estructura cuaternaria en algunas proteínas, lo que generalmente implica el "ensamblaje" o "coensamblaje" de subunidades que ya se han plegado; en otras palabras, múltiples cadenas polipeptídicas podrían interactuar para formar una proteína cuaternaria completamente funcional. [ 12 ]

Fuerzas impulsoras del plegamiento de proteínas

Resumen de todas las formas de estructura proteica

El plegamiento es un proceso espontáneo que está guiado principalmente por interacciones hidrofóbicas, la formación de enlaces de hidrógeno intramoleculares , fuerzas de van der Waals , y se opone a la entropía conformacional . [ 17 ] La escala de tiempo de plegamiento de una proteína aislada depende de su tamaño, orden de contacto y topología del circuito . Dentro de las células, el proceso de plegamiento a menudo comienza cotraduccionalmente , de modo que el extremo N de la proteína comienza a plegarse mientras la porción C de la proteína todavía está siendo sintetizada por el ribosoma ; sin embargo, una molécula de proteína puede plegarse espontáneamente durante o después de la biosíntesis . [ 18 ] Si bien estas macromoléculas pueden considerarse como " plegándose a sí mismas ", el proceso también depende del solvente ( agua o bicapa lipídica ), [ 19 ] la concentración de sales , el pH , la temperatura , la posible presencia de cofactores y de chaperonas moleculares .

Las proteínas tendrán limitaciones en su capacidad de plegamiento debido a los ángulos de flexión o conformaciones restringidas que son posibles. Estos ángulos permitidos de plegamiento de proteínas se describen con un diagrama bidimensional conocido como diagrama de Ramachandran , representado con los ángulos psi y phi de rotación permitida. [ 20 ]

Efecto hidrofóbico

Colapso hidrofóbico . En el pliegue compacto (a la derecha), los aminoácidos hidrofóbicos (mostrados como esferas negras) colapsan hacia el centro para quedar protegidos del entorno acuoso.

El plegamiento de proteínas debe ser termodinámicamente favorable dentro de una célula para que sea una reacción espontánea. Dado que se sabe que el plegamiento de proteínas es una reacción espontánea, entonces debe asumir un valor negativo de energía libre de Gibbs . La energía libre de Gibbs en el plegamiento de proteínas está directamente relacionada con la entalpía y la entropía . [ 12 ] Para que surja un delta G negativo y para que el plegamiento de proteínas sea termodinámicamente favorable, entonces la entalpía, la entropía o ambos términos deben ser favorables.

La entropía disminuye a medida que las moléculas de agua se ordenan más cerca del soluto hidrofóbico.

Minimizar el número de cadenas laterales hidrofóbicas expuestas al agua es una fuerza impulsora importante del proceso de plegamiento. [ 21 ] El efecto hidrofóbico es el fenómeno en el que las cadenas hidrofóbicas de una proteína se colapsan hacia el núcleo de la proteína (alejándose del entorno hidrofílico). [ 12 ] En un entorno acuoso, las moléculas de agua tienden a agregarse alrededor de las regiones hidrofóbicas o cadenas laterales de la proteína, creando capas de agua de moléculas de agua ordenadas. [ 22 ] Un ordenamiento de las moléculas de agua alrededor de una región hidrofóbica aumenta el orden en un sistema y, por lo tanto, contribuye a un cambio negativo en la entropía (menor entropía en el sistema). Las moléculas de agua se fijan en estas jaulas de agua, lo que impulsa el colapso hidrofóbico , o el plegamiento hacia adentro de los grupos hidrofóbicos. El colapso hidrofóbico introduce entropía de nuevo en el sistema a través de la ruptura de las jaulas de agua que libera las moléculas de agua ordenadas. [ 12 ] La multitud de grupos hidrofóbicos que interactúan dentro del núcleo de la proteína globular plegada contribuye significativamente a la estabilidad de la proteína después del plegamiento, debido a las fuerzas de van der Waals (específicamente las fuerzas de dispersión de London ) que se acumulan en gran medida. [ 12 ] El efecto hidrofóbico existe como fuerza impulsora en la termodinámica solo si hay presencia de un medio acuoso con una molécula anfifílica que contiene una gran región hidrofóbica. [ 23 ] La fuerza de los enlaces de hidrógeno depende de su entorno; por lo tanto, los enlaces de hidrógeno envueltos en un núcleo hidrofóbico contribuyen más que los enlaces de hidrógeno expuestos al entorno acuoso a la estabilidad del estado nativo. [ 24 ]

En las proteínas con pliegues globulares, los aminoácidos hidrofóbicos tienden a estar intercalados a lo largo de la secuencia primaria, en lugar de estar distribuidos aleatoriamente o agrupados. [ 25 ] [ 26 ] Sin embargo, las proteínas que han nacido recientemente de novo , que tienden a ser intrínsecamente desordenadas , [ 27 ] [ 28 ] muestran el patrón opuesto de agrupamiento de aminoácidos hidrofóbicos a lo largo de la secuencia primaria. [ 29 ]

Acompañantes

Ejemplo de una pequeña proteína de choque térmico eucariota

Las chaperonas moleculares son una clase de proteínas que ayudan en el correcto plegamiento de otras proteínas in vivo . Las chaperonas existen en todos los compartimentos celulares e interactúan con la cadena polipeptídica para permitir que se forme la conformación tridimensional nativa de la proteína; sin embargo, las chaperonas mismas no están incluidas en la estructura final de la proteína en la que están ayudando. [ 30 ] Las chaperonas pueden ayudar en el plegamiento incluso cuando el polipéptido naciente está siendo sintetizado por el ribosoma. [ 31 ] Las chaperonas moleculares operan uniéndose para estabilizar una estructura que de otro modo sería inestable de una proteína en su vía de plegamiento, pero las chaperonas no contienen la información necesaria para conocer la estructura nativa correcta de la proteína a la que están ayudando; más bien, las chaperonas trabajan previniendo conformaciones de plegamiento incorrectas. [ 31 ] De esta manera, las chaperonas en realidad no aumentan la velocidad de los pasos individuales involucrados en la vía de plegamiento hacia la estructura nativa; En cambio, funcionan reduciendo posibles agregaciones no deseadas de la cadena polipeptídica que de otro modo podrían ralentizar la búsqueda del intermedio adecuado y proporcionan una vía más eficiente para que la cadena polipeptídica asuma las conformaciones correctas. [ 30 ] Las chaperonas no deben confundirse con las proteínas catalizadoras de plegamiento , que catalizan reacciones químicas responsables de los pasos lentos en las vías de plegamiento. Ejemplos de catalizadores de plegamiento son las isomerasas de disulfuro de proteínas y las isomerasas de peptidil-prolil que pueden estar involucradas en la formación de enlaces disulfuro o la interconversión entre estereoisómeros cis y trans del grupo peptídico. [ 31 ] Se ha demostrado que las chaperonas son críticas en el proceso de plegamiento de proteínas in vivo porque proporcionan a la proteína la ayuda necesaria para asumir sus alineaciones y conformaciones adecuadas de manera suficientemente eficiente como para volverse "biológicamente relevante". [ 32 ] Esto significa que la cadena polipeptídica podría teóricamente plegarse en su estructura nativa sin la ayuda de chaperonas, como lo demuestran los experimentos de plegamiento de proteínas realizados in vitro ; [ 32 ] Sin embargo, este proceso resulta ser demasiado ineficiente o demasiado lento para existir en sistemas biológicos; por lo tanto, las chaperonas son necesarias para el plegamiento de proteínas in vivo. Además de su función en la ayuda a la formación de la estructura nativa, se ha demostrado que las chaperonas participan en diversas funciones, como el transporte de proteínas, la degradación e incluso permiten la desnaturalización de proteínas.expuestas a ciertos factores desnaturalizantes externos tienen la oportunidad de replegarse en sus estructuras nativas correctas. [ 33 ]

Una proteína completamente desnaturalizada carece de estructura terciaria y secundaria, y existe como una denominada bobina aleatoria . Bajo ciertas condiciones, algunas proteínas pueden replegarse; sin embargo, en muchos casos, la desnaturalización es irreversible. [ 34 ] Las células a veces protegen sus proteínas contra la influencia desnaturalizante del calor con enzimas conocidas como proteínas de choque térmico (un tipo de chaperona), que ayudan a otras proteínas tanto a plegarse como a permanecer plegadas. Se han encontrado proteínas de choque térmico en todas las especies examinadas, desde bacterias hasta humanos, lo que sugiere que evolucionaron muy temprano y tienen una función importante. Algunas proteínas nunca se pliegan en las células excepto con la ayuda de chaperonas que aíslan proteínas individuales para que su plegamiento no se vea interrumpido por interacciones con otras proteínas o ayudan a desplegar proteínas mal plegadas, permitiéndoles replegarse en la estructura nativa correcta. [ 35 ] Esta función es crucial para prevenir el riesgo de precipitación en agregados amorfos insolubles . Los factores externos involucrados en la desnaturalización de proteínas o la alteración del estado nativo incluyen la temperatura, los campos externos (eléctricos, magnéticos), [ 36 ] el hacinamiento molecular, [ 37 ] e incluso la limitación de espacio (es decir, el confinamiento), que puede tener una gran influencia en el plegamiento de las proteínas. [ 38 ] Las altas concentraciones de solutos , los valores extremos de pH , las fuerzas mecánicas y la presencia de desnaturalizantes químicos también pueden contribuir a la desnaturalización de proteínas. Estos factores individuales se clasifican juntos como estrés. Se ha demostrado que las chaperonas existen en concentraciones crecientes durante los períodos de estrés celular y ayudan al plegamiento adecuado de las proteínas emergentes, así como de las desnaturalizadas o mal plegadas. [ 30 ]

En ciertas condiciones, las proteínas no se pliegan en sus formas bioquímicamente funcionales. Las temperaturas superiores o inferiores al rango en el que suelen vivir las células provocan que las proteínas térmicamente inestables se desdoblen o desnaturalicen (por eso la ebullición hace que la clara de huevo se vuelva opaca). Sin embargo, la estabilidad térmica de las proteínas dista mucho de ser constante; por ejemplo, se han encontrado arqueas hipertermófilas que crecen a temperaturas de hasta 122  °C, [ 39 ] lo que, por supuesto, requiere que su conjunto completo de proteínas vitales y ensamblajes de proteínas sea estable a esa temperatura o superior.

La bacteria E. coli es el huésped del bacteriófago T4 , y la proteína gp31 codificada por el fago ( P17313 ) parece ser estructural y funcionalmente homóloga a la proteína chaperona GroES de E. coli y capaz de sustituirla en el ensamblaje de partículas virales del bacteriófago T4 durante la infección. [ 40 ] Al igual que GroES, gp31 forma un complejo estable con la chaperonina GroEL que es absolutamente necesario para el plegamiento y ensamblaje in vivo de la proteína principal de la cápside del bacteriófago T4, gp23. [ 40 ]

Conmutación de pliegue

Algunas proteínas tienen múltiples estructuras nativas y cambian su plegamiento en función de factores externos. Por ejemplo, la proteína KaiB cambia de plegamiento a lo largo del día , actuando como un reloj biológico para las cianobacterias. Se estima que entre el 0,5 % y el 4 % de las proteínas del PDB ( Protein Data Bank ) cambian de plegamiento. [ 41 ]

Proteínas mal plegadas

Se considera que una proteína está mal plegada si no puede alcanzar su estado nativo normal. Esto puede deberse a mutaciones en la secuencia de aminoácidos o a una alteración del proceso normal de plegamiento por factores externos. [ 42 ] La proteína mal plegada suele contener láminas beta (láminas β) que se organizan en una disposición supramolecular conocida como estructura β cruzada. Estos ensamblajes ricos en láminas β son muy estables, muy insolubles y generalmente resistentes a la proteólisis. [ 43 ] La estabilidad estructural de estos ensamblajes fibrilares se debe a las extensas interacciones entre los monómeros de la proteína, formadas por enlaces de hidrógeno del esqueleto entre sus hebras β. [ 43 ] El mal plegamiento de las proteínas puede desencadenar un mayor mal plegamiento y acumulación de otras proteínas en agregados u oligómeros. El aumento de los niveles de proteínas agregadas en la célula conduce a la formación de estructuras similares al amiloide , que pueden causar trastornos neurodegenerativos y muerte celular. [ 42 ] Los amiloides son estructuras fibrilares que contienen enlaces de hidrógeno intermoleculares, son altamente insolubles y se forman a partir de agregados de proteínas convertidas. [ 42 ] Por lo tanto, la vía del proteasoma puede no ser lo suficientemente eficiente para degradar las proteínas mal plegadas antes de la agregación. Las proteínas mal plegadas pueden interactuar entre sí y formar agregados estructurados, adquiriendo toxicidad a través de interacciones intermoleculares. [ 42 ]

Las proteínas agregadas están asociadas con enfermedades relacionadas con priones como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob , la encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad de las vacas locas), enfermedades relacionadas con amiloide como la enfermedad de Alzheimer y la cardiomiopatía o polineuropatía amiloide familiar , [ 44 ] así como enfermedades de agregación intracelular como la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson . [ 4 ] [ 45 ] Estas enfermedades degenerativas de inicio de edad están asociadas con la agregación de proteínas mal plegadas en agregados extracelulares insolubles y/o inclusiones intracelulares que incluyen fibrillas amiloides β cruzadas . No está completamente claro si los agregados son la causa o simplemente un reflejo de la pérdida de la homeostasis proteica, el equilibrio entre síntesis, plegamiento, agregación y recambio proteico. Recientemente, la Agencia Europea de Medicamentos aprobó el uso de Tafamidis o Vyndaqel (un estabilizador cinético de la transtiretina tetramérica) para el tratamiento de las enfermedades amiloides por transtiretina. Esto sugiere que el proceso de formación de fibrillas amiloides (y no las fibrillas en sí) causa la degeneración del tejido postmitótico en las enfermedades amiloides humanas. [ 46 ] El plegamiento incorrecto y la degradación excesiva en lugar del plegamiento y la función conducen a una serie de proteinopatías , enfermedades como el enfisema asociado a la antitripsina , la fibrosis quística y las enfermedades de almacenamiento lisosomal , donde la pérdida de función es el origen del trastorno. Si bien la terapia de reemplazo de proteínas se ha utilizado históricamente para corregir estos últimos trastornos, un enfoque emergente es utilizar chaperonas farmacéuticas para plegar las proteínas mutadas y hacerlas funcionales.

Técnicas experimentales para el estudio del plegamiento de proteínas

Si bien se pueden extraer conclusiones sobre el plegamiento de las proteínas mediante estudios de mutación , por lo general, las técnicas experimentales para estudiar el plegamiento de las proteínas se basan en el despliegue o plegamiento gradual de las proteínas y en la observación de cambios conformacionales utilizando técnicas no cristalográficas estándar.

cristalografía de rayos X

Pasos de la cristalografía de rayos X

La cristalografía de rayos X es uno de los métodos más eficientes e importantes para intentar descifrar la configuración tridimensional de una proteína plegada. [ 47 ] Para poder realizar la cristalografía de rayos X, la proteína en estudio debe estar ubicada dentro de una red cristalina. Para colocar una proteína dentro de una red cristalina, se necesita un disolvente adecuado para la cristalización, obtener una proteína pura en niveles sobresaturados en solución y precipitar los cristales en solución. [ 48 ] Una vez que una proteína está cristalizada, los haces de rayos X pueden concentrarse a través de la red cristalina, lo que difractaría los haces o los proyectaría hacia afuera en varias direcciones. Estos haces salientes se correlacionan con la configuración tridimensional específica de la proteína encerrada en su interior. Los rayos X interactúan específicamente con las nubes de electrones que rodean a los átomos individuales dentro de la red cristalina de la proteína y producen un patrón de difracción discernible. [ 15 ] Solo relacionando las nubes de densidad electrónica con la amplitud de los rayos X se puede leer este patrón y se pueden hacer suposiciones sobre las fases o los ángulos de fase involucrados que complican este método. [ 49 ] Sin la relación establecida a través de una base matemática conocida como transformada de Fourier , el " problema de fase " haría que predecir los patrones de difracción fuera muy difícil. [ 15 ] Métodos emergentes como el reemplazo isomorfo múltiple utilizan la presencia de un ion de metal pesado para difractar los rayos X de una manera más predecible, reduciendo el número de variables involucradas y resolviendo el problema de fase. [ 47 ]

Espectroscopia de fluorescencia

La espectroscopia de fluorescencia es un método altamente sensible para estudiar el estado de plegamiento de las proteínas. Tres aminoácidos, fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp), poseen propiedades de fluorescencia intrínsecas, pero solo Tyr y Trp se utilizan experimentalmente debido a que sus rendimientos cuánticos son lo suficientemente altos como para generar buenas señales de fluorescencia. Tanto Trp como Tyr se excitan con una longitud de onda de 280  nm, mientras que solo Trp se excita con una longitud de onda de 295  nm. Debido a su carácter aromático, los residuos de Trp y Tyr se encuentran a menudo total o parcialmente enterrados en el núcleo hidrofóbico de las proteínas, en la interfaz entre dos dominios proteicos o en la interfaz entre subunidades de proteínas oligoméricas. En este entorno apolar, presentan altos rendimientos cuánticos y, por lo tanto, altas intensidades de fluorescencia. Al alterarse la estructura terciaria o cuaternaria de la proteína, estas cadenas laterales quedan más expuestas al entorno hidrofílico del disolvente, y sus rendimientos cuánticos disminuyen, lo que resulta en bajas intensidades de fluorescencia. En el caso de los residuos de triptófano, la longitud de onda de su máxima emisión de fluorescencia también depende de su entorno.

La espectroscopia de fluorescencia puede utilizarse para caracterizar el desplegamiento en equilibrio de las proteínas midiendo la variación en la intensidad de la emisión de fluorescencia o en la longitud de onda de emisión máxima en función de un valor de desnaturalizante. [ 50 ] [ 51 ] El desnaturalizante puede ser una molécula química (urea, hidrocloruro de guanidinio), la temperatura, el pH, la presión, etc. El equilibrio entre los diferentes pero discretos estados de la proteína, es decir, el estado nativo, los estados intermedios y el estado desplegado, depende del valor del desnaturalizante; por lo tanto, la señal de fluorescencia global de su mezcla en equilibrio también depende de este valor. De este modo, se obtiene un perfil que relaciona la señal global de la proteína con el valor del desnaturalizante. El perfil de desplegamiento en equilibrio puede permitir detectar e identificar intermedios del desplegamiento. [ 52 ] [ 53 ] Hugues Bedouelle ha desarrollado ecuaciones generales para obtener los parámetros termodinámicos que caracterizan los equilibrios de desplegamiento para proteínas homoméricas o heteroméricas, hasta trímeros y potencialmente tetrámeros, a partir de dichos perfiles. [ 50 ] La espectroscopia de fluorescencia se puede combinar con dispositivos de mezcla rápida como el flujo detenido , para medir la cinética de plegamiento de proteínas, [ 54 ] generar un gráfico de chevron y derivar un análisis del valor Phi .

dicroísmo circular

El dicroísmo circular es una de las herramientas más generales y básicas para estudiar el plegamiento de proteínas. La espectroscopia de dicroísmo circular mide la absorción de luz polarizada circularmente . En las proteínas, estructuras como las hélices alfa y las láminas beta son quirales y, por lo tanto, absorben dicha luz. La absorción de esta luz actúa como un marcador del grado de plegamiento del conjunto de proteínas. Esta técnica se ha utilizado para medir el desplegamiento en equilibrio de la proteína midiendo el cambio en esta absorción en función de la concentración de desnaturalizante o la temperatura . Una fusión de desnaturalizante mide la energía libre de desplegamiento, así como el valor m de la proteína, o dependencia de desnaturalizante. Una fusión de temperatura mide la temperatura de desnaturalización (Tm) de la proteína. [ 50 ] Al igual que la espectroscopia de fluorescencia, la espectroscopia de dicroísmo circular se puede combinar con dispositivos de mezcla rápida como el flujo detenido para medir la cinética de plegamiento de proteínas y generar gráficos de chevron .

Dicroísmo circular vibracional de proteínas

Los avances más recientes en técnicas de dicroísmo circular vibracional (VCD) para proteínas, que actualmente utilizan instrumentos de transformada de Fourier (FT), proporcionan herramientas poderosas para determinar conformaciones proteicas en solución, incluso para moléculas proteicas muy grandes. Estos estudios de VCD de proteínas pueden combinarse con datos de difracción de rayos X para cristales de proteínas, datos de FT-IR para soluciones proteicas en agua pesada (D₂O ) o cálculos cuánticos .

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas

La resonancia magnética nuclear (RMN) de proteínas permite obtener datos estructurales de proteínas mediante la inducción de un campo magnético a través de muestras de proteína concentrada. En la RMN, dependiendo del entorno químico, ciertos núcleos absorben radiofrecuencias específicas. [ 55 ] [ 56 ] Debido a que los cambios estructurales de las proteínas operan en una escala de tiempo de ns a ms, la RMN está especialmente equipada para estudiar estructuras intermedias en escalas de tiempo de ps a s. [ 57 ] Algunas de las principales técnicas para estudiar la estructura de las proteínas y los cambios estructurales de proteínas sin plegamiento incluyen COSY , TOCSY ,  HSQC , relajación temporal (T1 y T2) y NOE . [ 55 ] NOE es especialmente útil porque se pueden observar transferencias de magnetización entre hidrógenos espacialmente próximos. [ 55 ] Los diferentes experimentos de RMN tienen distintos grados de sensibilidad de escala de tiempo que son apropiados para diferentes cambios estructurales de proteínas. NOE puede detectar vibraciones de enlaces o rotaciones de cadenas laterales; sin embargo, NOE es demasiado sensible para detectar el plegamiento de proteínas porque ocurre en una escala de tiempo mayor. [ 57 ]

La escala temporal de los cambios estructurales de las proteínas coincide con los experimentos de RMN. Para el plegamiento de proteínas, la dispersión de relajación CPMG (CPMG RD) y la transferencia de saturación por intercambio químico (CEST) recopilan datos en la escala temporal adecuada.

Debido a que el plegamiento de proteínas ocurre en aproximadamente 50 a 3000 s −1 CPMG La dispersión de relajación y la transferencia de saturación de intercambio químico se han convertido en algunas de las técnicas primarias para el análisis de RMN del plegamiento. [ 56 ] Además, ambas técnicas se utilizan para descubrir estados intermedios excitados en el paisaje de plegamiento de proteínas. [ 58 ] Para hacer esto, CPMG La dispersión de relajación aprovecha el fenómeno de eco de espín . Esta técnica expone los núcleos objetivo a un pulso de 90 seguido de uno o más pulsos de 180. [ 59 ] A medida que los núcleos se reenfocan, una distribución amplia indica que el núcleo objetivo está involucrado en un estado excitado intermedio. Al observar los gráficos de dispersión de relajación, los datos recopilan información sobre la termodinámica y la cinética entre el estado excitado y el estado fundamental. [ 59 ] [ 58 ] La transferencia de saturación mide los cambios en la señal del estado fundamental a medida que los estados excitados se ven perturbados. Utiliza una débil irradiación de radiofrecuencia para saturar el estado excitado de un núcleo particular, transfiriendo dicha saturación al estado fundamental. [ 56 ] Esta señal se amplifica al disminuir la magnetización (y la señal) del estado fundamental. [ 56 ] [ 58 ]

Las principales limitaciones de la RMN son que su resolución disminuye con proteínas de más de 25 kDa y no es tan detallada como la cristalografía de rayos X. [ 56 ] Además, el análisis de proteínas mediante RMN es bastante difícil y puede ofrecer múltiples soluciones a partir del mismo espectro de RMN. [ 55 ]

En un estudio centrado en el plegamiento de la proteína SOD1 , implicada en la esclerosis lateral amiotrófica , se estudiaron los intermedios excitados mediante dispersión de relajación y transferencia de saturación. [ 60 ] Anteriormente, se había relacionado la SOD1 con numerosas mutaciones causantes de enfermedades, que se suponía que participaban en la agregación de proteínas; sin embargo, el mecanismo seguía siendo desconocido. Mediante experimentos de dispersión de relajación y transferencia de saturación, se descubrieron muchos estados intermedios excitados que provocaban un plegamiento incorrecto en las mutaciones de la SOD1. [ 60 ]

Interferometría de doble polarización

La interferometría de polarización dual es una técnica basada en la superficie para medir las propiedades ópticas de capas moleculares. Cuando se utiliza para caracterizar el plegamiento de proteínas, mide la conformación determinando el tamaño general de una monocapa de la proteína y su densidad en tiempo real con una resolución sub-Angstrom, [ 61 ] aunque la medición en tiempo real de la cinética del plegamiento de proteínas está limitada a procesos que ocurren más lentos que ~10  Hz. De manera similar al dicroísmo circular , el estímulo para el plegamiento puede ser un desnaturalizante o la temperatura .

Estudios de plegado con alta resolución temporal

El estudio del plegamiento de proteínas ha experimentado grandes avances en los últimos años gracias al desarrollo de técnicas rápidas y con resolución temporal. Los investigadores inducen rápidamente el plegamiento de una muestra de proteína desplegada y observan la dinámica resultante . Entre las técnicas rápidas empleadas se incluyen la mezcla ultrarrápida de soluciones, los métodos fotoquímicos y la espectroscopia de salto de temperatura láser . Entre los numerosos científicos que han contribuido al desarrollo de estas técnicas se encuentran Heinrich Roder, Terry Oas, Harry Gray , Martin Gruebele , Brian Dyer, William Eaton, Sheena Radford , Chris Dobson , Alan Fersht , Bengt Nölting y Lars Konermann.

Proteólisis

La proteólisis se utiliza habitualmente para analizar la fracción desplegada en una amplia gama de condiciones de solución (por ejemplo, proteólisis paralela rápida (FASTpp) ) . [ 62 ] [ 63 ]

Espectroscopia de fuerza de molécula única

Se han utilizado técnicas de molécula única, como pinzas ópticas y AFM, para comprender los mecanismos de plegamiento de proteínas aisladas, así como de proteínas con chaperonas. [ 64 ] Las pinzas ópticas se han utilizado para estirar moléculas de proteínas individuales desde sus extremos C y N y desplegarlas para permitir el estudio del replegamiento posterior. [ 65 ] La técnica permite medir las tasas de plegamiento a nivel de molécula única; por ejemplo, las pinzas ópticas se han aplicado recientemente para estudiar el plegamiento y desplegamiento de proteínas involucradas en la coagulación sanguínea. El factor de von Willebrand (vWF) es una proteína con un papel esencial en el proceso de formación de coágulos sanguíneos. Se descubrió, utilizando mediciones con pinzas ópticas de molécula única, que el vWF unido al calcio actúa como un sensor de fuerza de cizallamiento en la sangre. La fuerza de cizallamiento conduce al despliegue del dominio A2 del vWF, cuya tasa de replegamiento se ve drásticamente mejorada en presencia de calcio. [ 66 ] También se ha demostrado que el dominio SH3 simple de src accede a múltiples vías de despliegue bajo fuerza. [ 67 ]

Pintura de biotina

La tinción con biotina permite obtener instantáneas celulares específicas de las proteínas (des)plegadas. La tinción con biotina muestra un sesgo hacia las proteínas intrínsecamente desordenadas predichas . [ 68 ]

Estudios computacionales del plegamiento de proteínas

Los estudios computacionales del plegamiento de proteínas incluyen tres aspectos principales relacionados con la predicción de la estabilidad, la cinética y la estructura de las proteínas. Una revisión de 2013 resume los métodos computacionales disponibles para el plegamiento de proteínas. [ 69 ]

La paradoja de Levinthal

En 1969, Cyrus Levinthal señaló que, debido al gran número de grados de libertad en una cadena polipeptídica desplegada, la molécula tiene un número astronómico de posibles conformaciones. En uno de sus artículos se estimó en 3300 o 10¹⁴³ . [ 70 ] La paradoja de Levinthal es un experimento mental basado en la observación de que si una proteína se plegara mediante el muestreo secuencial de todas las posibles conformaciones, tardaría una cantidad astronómica de tiempo en hacerlo, incluso si las conformaciones se muestrearan a una velocidad rápida (en la escala de nanosegundos o picosegundos ). [ 71 ] Basándose en la observación de que las proteínas se pliegan mucho más rápido que esto, Levinthal propuso entonces que no se produce una búsqueda conformacional aleatoria y que, por lo tanto, la proteína debe plegarse a través de una serie de estados intermedios metaestables .

Paisaje energético del plegamiento de proteínas

El embudo de energía mediante el cual una cadena polipeptídica desplegada adquiere su estructura nativa.

El espacio de configuración de una proteína durante su plegamiento puede visualizarse como un paisaje energético . Según Joseph Bryngelson y Peter Wolynes , las proteínas siguen el principio de mínima frustración , lo que significa que las proteínas que han evolucionado naturalmente han optimizado sus paisajes energéticos de plegamiento [ 72 ] y que la naturaleza ha elegido secuencias de aminoácidos de manera que el estado plegado de la proteína sea suficientemente estable. Además, la adquisición del estado plegado tuvo que convertirse en un proceso suficientemente rápido. Si bien la naturaleza ha reducido el nivel de frustración en las proteínas, aún persiste cierto grado, como se puede observar en la presencia de mínimos locales en el paisaje energético de las proteínas.

Una consecuencia de estas secuencias seleccionadas evolutivamente es que se cree que las proteínas tienen paisajes energéticos globalmente "en embudo" (término acuñado por José Onuchic ) ​​[ 73 ] que se dirigen principalmente hacia el estado nativo. Este paisaje de " embudo de plegamiento " permite que la proteína se pliegue al estado nativo a través de una gran cantidad de vías e intermedios, en lugar de estar restringida a un solo mecanismo. La teoría está respaldada tanto por simulaciones computacionales de proteínas modelo como por estudios experimentales, [ 72 ] y se ha utilizado para mejorar los métodos de predicción y diseño de la estructura de proteínas . [ 72 ] La descripción del plegamiento de proteínas mediante el paisaje de energía libre de nivelación también es consistente con la segunda ley de la termodinámica. [ 74 ] Físicamente, pensar en paisajes en términos de superficies de energía potencial o total visualizables simplemente con máximos, puntos de silla, mínimos y embudos, de forma similar a los paisajes geográficos, es quizás un poco engañoso. La descripción relevante es en realidad un espacio de fase de alta dimensión en el que las variedades pueden adoptar una variedad de formas topológicas más complejas. [ 75 ]

La cadena polipeptídica desplegada comienza en la parte superior del embudo donde puede asumir el mayor número de variaciones desplegadas y se encuentra en su estado de energía más alto. Paisajes energéticos como estos indican que hay un gran número de posibilidades iniciales, pero solo es posible un único estado nativo; sin embargo, no revelan las numerosas vías de plegamiento posibles. Una molécula diferente de la misma proteína exacta puede seguir vías de plegamiento marginalmente diferentes, buscando diferentes intermedios de menor energía, siempre que se alcance la misma estructura nativa. [ 76 ] Las diferentes vías pueden tener diferentes frecuencias de utilización dependiendo de la favorabilidad termodinámica de cada vía. Esto significa que si se encuentra que una vía es termodinámicamente más favorable que otra, es probable que se utilice con mayor frecuencia en la búsqueda de la estructura nativa. [ 76 ] A medida que la proteína comienza a plegarse y asumir sus diversas conformaciones, siempre busca una estructura termodinámicamente más favorable que antes y, por lo tanto, continúa a través del embudo de energía. La formación de estructuras secundarias es un fuerte indicador de mayor estabilidad dentro de la proteína, y solo una combinación de estructuras secundarias adoptadas por el esqueleto polipeptídico tendrá la energía más baja y, por lo tanto, estará presente en el estado nativo de la proteína. [ 76 ] Entre las primeras estructuras que se forman una vez que el polipéptido comienza a plegarse se encuentran las hélices alfa y los giros beta, donde las hélices alfa pueden formarse en tan solo 100 nanosegundos y los giros beta en 1 microsegundo. [ 30 ]

Existe un punto de silla en el paisaje del embudo de energía donde se encuentra el estado de transición para una proteína en particular. [ 30 ] El estado de transición en el diagrama del embudo de energía es la conformación que debe adoptar cada molécula de esa proteína si desea finalmente adoptar la estructura nativa. Ninguna proteína puede adoptar la estructura nativa sin antes pasar por el estado de transición. [ 30 ] El estado de transición puede considerarse una variante o forma prematura del estado nativo, en lugar de simplemente otro paso intermedio. [ 77 ] Se ha demostrado que el plegamiento del estado de transición determina la velocidad, y aunque existe en un estado de energía más alto que el plegamiento nativo, se asemeja mucho a la estructura nativa. Dentro del estado de transición, existe un núcleo alrededor del cual la proteína puede plegarse, formado por un proceso denominado "condensación de nucleación", donde la estructura comienza a colapsar sobre el núcleo. [ 77 ]

Modelado del plegamiento de proteínas

Folding@home utiliza modelos de estados de Markov , como el que se muestra en el diagrama, para modelar las posibles formas y vías de plegamiento que puede adoptar una proteína a medida que se condensa desde su estado inicial de enrollamiento aleatorio (izquierda) hasta su estructura 3D nativa (derecha).

Las técnicas de novo o ab initio para la predicción computacional de la estructura de proteínas pueden utilizarse para simular diversos aspectos del plegamiento de proteínas. La primera simulación computacional del plegamiento de proteínas fue realizada en 1975 por Levitt y Warshel (Nature 1975) y produjo rutas de plegamiento [ 78 ] que colapsaron a una estructura cercana a la estructura plegada y básicamente proporcionaron una "resolución" de la paradoja de Leventhal. La simulación también incluyó un tratamiento de modo normal que exploró algunos de los aspectos dinámicos del proceso de plegamiento. La dinámica molecular (DM) se utilizó en simulaciones de plegamiento de proteínas y dinámica in silico . [ 79 ] Las primeras simulaciones de plegamiento en equilibrio se realizaron utilizando un modelo de solvente implícito y muestreo de paraguas . [ 80 ] Debido al costo computacional, las simulaciones de plegamiento de DM ab initio con agua explícita están limitadas a péptidos y proteínas pequeñas. [ 81 ] [ 82 ] Las simulaciones de DM de proteínas más grandes siguen restringidas a la dinámica de la estructura experimental o su desplegamiento a alta temperatura. Los procesos de plegamiento de larga duración (más allá de aproximadamente 1 milisegundo), como el plegamiento de proteínas más grandes (>150 residuos), pueden estudiarse utilizando modelos de grano grueso . [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]

Varios proyectos computacionales a gran escala, como Rosetta@home , [ 86 ] Folding@home [ 87 ] y Foldit , [ 88 ] tienen como objetivo el plegamiento de proteínas.

Se han realizado simulaciones de trayectoria continua de larga duración en Anton , una supercomputadora masivamente paralela diseñada y construida en torno a ASICs e interconexiones personalizadas por DE Shaw Research . El resultado publicado más largo de una simulación realizada con Anton hasta 2011 fue una simulación de 2,936 milisegundos de NTL9 a 355 K. [ 89 ] Estas simulaciones son capaces actualmente de desplegar y replegar proteínas pequeñas (<150 residuos de aminoácidos) en equilibrio y predecir cómo las mutaciones afectan la cinética y la estabilidad del plegamiento. [ 90 ]

En 2020, un equipo de investigadores que utilizó AlphaFold , un programa de predicción de estructura de proteínas basado en inteligencia artificial (IA) desarrollado por DeepMind, obtuvo el primer lugar en CASP , un concurso de predicción de estructuras de larga trayectoria. [ 91 ] El equipo logró un nivel de precisión mucho mayor que cualquier otro grupo. [ 92 ] Obtuvo una puntuación superior al 90 % para aproximadamente dos tercios de las proteínas en la prueba de distancia global (GDT) de CASP , una prueba que mide el grado de similitud entre la estructura predicha por un programa computacional y la estructura empírica determinada experimentalmente en un laboratorio. Una puntuación de 100 se considera una coincidencia completa, dentro del umbral de distancia utilizado para calcular la GDT. [ 93 ]

Los resultados de predicción de la estructura de proteínas de AlphaFold en CASP fueron descritos como "transformadores" y "asombrosos". [ 94 ] [ 95 ] Algunos investigadores señalaron que la precisión no es lo suficientemente alta para un tercio de sus predicciones, y que no revela el mecanismo físico del plegamiento de proteínas para que el problema del plegamiento de proteínas se considere resuelto. [ 96 ] Sin embargo, se considera un logro significativo en biología computacional [ 93 ] y un gran avance hacia un gran desafío de la biología que lleva décadas sin resolverse: la predicción de la estructura de las proteínas. [ 94 ]

Véase también

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