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En bioquímica , una nucleasa (también conocida antiguamente como nucleodepolimerasa o polinucleotidasa ) es una enzima capaz de romper los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos para formar ácidos nucleicos . Las nucleasas afectan de diversas maneras las rupturas de cadena simple y doble en sus moléculas diana. En los organismos vivos, son maquinaria esencial para muchos aspectos de la reparación del ADN . Los defectos en ciertas nucleasas pueden causar inestabilidad genética o inmunodeficiencia . [ 1 ] Las nucleasas también se utilizan ampliamente en la clonación molecular . [ 2 ]
Existen dos clasificaciones principales basadas en el lugar de actividad. Las exonucleasas digieren los ácidos nucleicos desde los extremos. Las endonucleasas actúan sobre regiones centrales de las moléculas diana. Se subdividen en desoxirribonucleasas y ribonucleasas . Las primeras actúan sobre el ADN , las segundas sobre el ARN . [ 2 ]
Historia
A finales de la década de 1960, los científicos Stuart Linn y Werner Arber aislaron ejemplos de los dos tipos de enzimas responsables de la restricción del crecimiento de fagos en la bacteria Escherichia coli ( E. coli ). [ 3 ] [ 4 ] Una de estas enzimas añadía un grupo metilo al ADN, generando ADN metilado , mientras que la otra cortaba el ADN no metilado en una amplia variedad de lugares a lo largo de la molécula. El primer tipo de enzima se denominó " metilasa " y el otro " nucleasa de restricción ". Estas herramientas enzimáticas fueron importantes para los científicos que estaban reuniendo las herramientas necesarias para " cortar y pegar " moléculas de ADN. Lo que se necesitaba entonces era una herramienta que cortara el ADN en sitios específicos, en lugar de sitios aleatorios a lo largo de la molécula, para que los científicos pudieran cortar moléculas de ADN de forma predecible y reproducible.
Un avance importante se produjo en 1968, cuando HO Smith , KW Wilcox y TJ Kelly , investigadores de la Universidad Johns Hopkins , aislaron y caracterizaron la primera nucleasa de restricción cuyo funcionamiento dependía de una secuencia específica de nucleótidos de ADN . Trabajando con la bacteria Haemophilus influenzae , este grupo aisló una enzima, denominada Hind II , que siempre cortaba las moléculas de ADN en un punto concreto dentro de una secuencia específica de seis pares de bases. Descubrieron que la enzima Hind II siempre cortaba justo en el centro de esta secuencia (entre el tercer y el cuarto par de bases).
Sistema de clasificación numérica
La mayoría de las nucleasas se clasifican como hidrolasas (número EC 3) según la Comisión de Enzimas del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular . Al igual que la fosfodiesterasa , la lipasa y la fosfatasa , las nucleasas pertenecen a las esterasas (número EC 3.1), un subgrupo de las hidrolasas. Las esterasas a las que pertenecen las nucleasas se clasifican con los números EC 3.1.11 a 3.1.31.
Estructura
La estructura primaria de las nucleasas está, en general, poco conservada y mínimamente conservada en los sitios activos, cuyas superficies están compuestas principalmente por residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Las nucleasas se pueden clasificar en familias de plegamiento. [ 1 ]
Reconocimiento del sitio
Una nucleasa debe asociarse con un ácido nucleico antes de poder escindir la molécula. Esto implica cierto grado de reconocimiento. Las nucleasas emplean de diversas maneras asociaciones tanto inespecíficas como específicas en sus modos de reconocimiento y unión. Ambos modos desempeñan funciones importantes en los organismos vivos, especialmente en la reparación del ADN. [ 1 ]
Las endonucleasas no específicas implicadas en la reparación del ADN pueden explorar el ADN en busca de secuencias diana o daños . Dicha nucleasa se difunde a lo largo del ADN hasta que encuentra una diana, sobre la cual los residuos de su sitio activo interactúan con los grupos químicos del ADN. En el caso de endonucleasas como EcoRV , BamHI y PvuII, esta unión no específica implica interacciones electrostáticas entre la superficie mínima de la proteína y el ADN. Esta débil asociación deja la forma general del ADN inalterada, manteniéndose en forma B. [ 1 ]
APor el contrario , la nucleasa específica de sitio forma asociaciones mucho más fuertes. Atrae el ADN hacia el surco profundo de su dominio de unión al ADN . Esto produce una deformación significativa de la estructura terciaria del ADN y se logra mediante superficies ricas en residuos básicos (con carga positiva). Participa en una extensa interacción electrostática con el ADN. [ 1 ]
Algunas nucleasas implicadas en la reparación del ADN presentan especificidad de secuencia parcial. Sin embargo, la mayoría son inespecíficas, reconociendo en cambio anomalías estructurales producidas en la cadena principal del ADN por desajustes de pares de bases . [ 1 ]
nucleasa específica de estructura
Para más detalles, consulte la endonucleasa de solapa .
nucleasa específica de secuencia
Se han aislado más de 900 enzimas de restricción, algunas específicas de secuencia y otras no, de más de 230 cepas de bacterias desde el descubrimiento inicial de Hind II. Estas enzimas de restricción generalmente tienen nombres que reflejan su origen : la primera letra del nombre proviene del género y las dos letras siguientes provienen de la especie de la célula procariota de la que fueron aisladas. Por ejemplo, Eco RI proviene de la bacteria Escherichia coli RY13, mientras que HindII proviene de la cepa Rd de Haemophilus influenzae . Los números que siguen a los nombres de las nucleasas indican el orden en que las enzimas fueron aisladas de cepas individuales de bacterias: Eco RI , Eco RII .
endonucleasas
Una endonucleasa de restricción funciona "escaneando" la longitud de una molécula de ADN. Una vez que encuentra su secuencia de reconocimiento específica, se une a la molécula de ADN y realiza un corte en cada una de las dos cadenas de azúcar-fosfato. La posición de estos dos cortes, tanto en relación entre sí como con la propia secuencia de reconocimiento, está determinada por la identidad de la endonucleasa de restricción. Diferentes endonucleasas producen diferentes conjuntos de cortes, pero una misma endonucleasa siempre cortará una secuencia de bases específica de la misma manera, independientemente de la molécula de ADN sobre la que actúe. Una vez realizados los cortes, la molécula de ADN se fragmenta. [ 6 ]
Corte escalonado
No todas las endonucleasas de restricción cortan simétricamente y dejan extremos romos como la Hind II descrita anteriormente. Muchas endonucleasas cortan los esqueletos del ADN en posiciones que no son directamente opuestas entre sí, creando extremos sobresalientes. Por ejemplo, la nucleasa Eco RI tiene la secuencia de reconocimiento 5'—GAATTC—3'.
Cuando la enzima encuentra esta secuencia, corta cada cadena principal entre la G y el residuo de base A más cercano. Una vez realizados los cortes, los fragmentos resultantes se mantienen unidos únicamente por los enlaces de hidrógeno relativamente débiles que mantienen unidas las bases complementarias. La debilidad de estos enlaces permite que los fragmentos de ADN se separen. Cada fragmento resultante tiene un extremo 5' sobresaliente compuesto por bases no apareadas. Otras enzimas crean cortes en la cadena principal del ADN que dan como resultado extremos 3' sobresalientes. Los extremos sobresalientes , tanto 3' como 5' , a veces se denominan " extremos pegajosos " porque tienden a unirse con secuencias de bases complementarias. En otras palabras, si una longitud de bases no apareadas 5'—AATT—3'encuentra otra longitud no apareada con la secuencia, 3'—TTAA—5'se unirán entre sí ; son "pegajosos" entre sí. La enzima ligasa se utiliza entonces para unir las cadenas de fosfato de las dos moléculas. El origen celular, o incluso el origen de la especie, de los extremos pegajosos no afecta su pegajosidad. Cualquier par de secuencias complementarias tenderá a unirse, incluso si una de ellas proviene de un fragmento de ADN humano y la otra de un fragmento de ADN bacteriano. De hecho, es esta capacidad de unión la que permite la producción de moléculas de ADN recombinante, compuestas por ADN de diferentes fuentes, y que ha dado origen a la ingeniería genética .
Papel en la naturaleza
reparación del ADN
Dado que todas las células dependen del ADN como medio de información genética, el control de calidad genética es una función esencial de todos los organismos. La replicación del ADN es un proceso propenso a errores, y las propias moléculas de ADN son vulnerables a la modificación por numerosos factores de estrés metabólicos y ambientales. Ejemplos comunes incluyen las especies reactivas de oxígeno , la radiación ultravioleta cercana y la radiación ionizante . Muchas nucleasas participan en la reparación del ADN al reconocer los sitios de daño y separarlos del ADN circundante. Estas enzimas funcionan de forma independiente o en complejos . La mayoría de las nucleasas implicadas en la reparación del ADN no son específicas de secuencia. Reconocen los sitios de daño mediante la deformación de la estructura secundaria del ADN de doble cadena (dsDNA). [ 1 ]
Corrección de pruebas de replicación
Durante la replicación del ADN , las ADN polimerasas alargan nuevas hebras de ADN contra hebras molde complementarias. La mayoría de las ADN polimerasas constan de dos dominios enzimáticos diferentes : una polimerasa y una exonucleasa correctora . La polimerasa alarga la nueva hebra en dirección 5' → 3'. La exonucleasa elimina los nucleótidos erróneos de la misma hebra en dirección 3' → 5'. Esta actividad exonucleasa es esencial para la capacidad de corrección de la ADN polimerasa. Las deleciones que inactivan o eliminan estas nucleasas aumentan las tasas de mutación y mortalidad en los microbios afectados y el cáncer en ratones. [ 1 ]
Bifurcación de replicación detenida
Muchas formas de daño en el ADN detienen la progresión de la horquilla de replicación , lo que provoca que las ADN polimerasas y la maquinaria asociada la abandonen. Posteriormente, debe ser procesada por proteínas específicas de la horquilla. La más notable es MUS81 . Las deleciones de este gen causan sensibilidad al daño por radiación UV o metilación en levaduras , además de defectos meióticos. [ 1 ]
Procesamiento de fragmentos de Okazaki
Una tarea común en las células es la eliminación de los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki de la replicación. La mayoría de estos cebadores son escindidos del ADN de la cadena rezagada recién sintetizada por endonucleasas de la familia RNasa H. En eucariotas y arqueas , la endonucleasa de solapa FEN1 también participa en el procesamiento de los fragmentos de Okazaki. [ 1 ]
Reparación de desajustes
La reparación de errores de apareamiento del ADN en cualquier organismo se lleva a cabo mediante un conjunto de endonucleasas específicas para cada error. En procariotas, esta función la desempeñan principalmente MutSLH y las proteínas asociadas a la reparación de parches muy cortos (reparación VSP).
El sistema MutSLH (compuesto por MutS , MutL y MutH) corrige mutaciones puntuales y giros pequeños . MutS reconoce y se une a los desajustes, donde recluta a MutL y MutH. MutL media la interacción entre MutS y MutH, y potencia la actividad endonucleasa de este último. MutH reconoce 5'—GATC—3'los sitios hemimetilados y corta junto al extremo Gde la hebra no metilada (la hebra sintetizada más recientemente).
La reparación VSP se inicia mediante la endonucleasa Vsr. Esta corrige un desajuste específico T/Gcausado por la desaminación espontánea de citosinas metiladas a timinas. Vsr reconoce la secuencia , donde corta la cadena de ADN en el extremo 5' de la timina desajuste (subrayada en la secuencia anterior). Posteriormente, una de las exonucleasas RecJ, ExoVII o ExoI degrada el sitio antes de que la ADN polimerasa resintetice el hueco en la cadena. [ 1 ]5'—CTWGG—3'
Reparación de escisión de la base
La formación de sitios AP es frecuente en el ADN bicatenario. Es el resultado de la hidrólisis espontánea y la actividad de las ADN glicosilasas como paso intermedio en la reparación por escisión de bases . Estos sitios AP son eliminados por las endonucleasas AP , que provocan rupturas de cadena simple alrededor del sitio. [ 1 ]
Reparación por escisión de nucleótidos
La reparación por escisión de nucleótidos , que no debe confundirse con la reparación por escisión de bases, implica la eliminación y el reemplazo de nucleótidos dañados. La formación de enlaces cruzados , aductos y lesiones (generadas por la luz ultravioleta o especies reactivas de oxígeno ) puede activar esta vía de reparación. Endonucleasas independientes eliminan segmentos cortos de ADN monocatenario que contienen dichos nucleótidos dañados, produciendo muescas tanto aguas arriba como aguas abajo del daño. Las deleciones o mutaciones que afectan a estas nucleasas aumentan la sensibilidad al daño ultravioleta y la carcinogénesis. Estas anomalías pueden incluso afectar el desarrollo neuronal.
En bacterias, ambos cortes son ejecutados por el complejo UvrB-UvrC . En la levadura en gemación, Rad2 y el complejo Rad1-Rad10 realizan los cortes 5' y 3', respectivamente. En mamíferos, los homólogos XPG y XPF - ERCC1 afectan las mismas muescas respectivas. [ 1 ]
Reparación de roturas de doble hebra
Las roturas de doble cadena , tanto intencionadas como no intencionadas, ocurren regularmente en las células. Las roturas no intencionadas suelen ser generadas por radiación ionizante , diversos agentes químicos exógenos y endógenos, y horquillas de replicación detenidas. Las roturas intencionadas se generan como intermediarios en la meiosis y la recombinación V(D)J , y se reparan principalmente mediante recombinación homóloga y unión de extremos no homólogos . En ambos casos, los extremos de las roturas de doble cadena deben ser procesados por nucleasas antes de que pueda tener lugar la reparación. Una de estas nucleasas es Mre11, que forma un complejo con Rad50 . Las mutaciones de Mre11 pueden precipitar un trastorno similar a la ataxia-telangiectasia . [ 1 ]
La recombinación V(D)J implica la apertura de estructuras de tallo-bucle asociadas a roturas de doble cadena y la posterior unión de ambos extremos. El complejo Artemis-DNAPK cs participa en esta reacción. Aunque Artemis presenta actividad exonucleasa de ADN monocatenario 5' → 3' cuando está solo, su complejación con DNA-PK cs permite el procesamiento endonucleásico de los tallo-bucle. Los defectos en cualquiera de estas proteínas confieren inmunodeficiencia grave. [ 1 ]
Por otro lado, la recombinación homóloga implica dos dúplex de ADN homólogos conectados por bucles D o uniones de Holliday . En bacterias, endonucleasas como RuvC resuelven las uniones de Holliday en dos dsADN separados mediante la escisión de las uniones en dos sitios simétricos cerca del centro de la unión. En eucariotas, FEN1 , XPF - ERCC1 y MUS81 escinden los bucles D, y Cce1 / Ydc2 procesa las uniones de Holliday en las mitocondrias. [ 1 ]
Meganucleasas
La frecuencia con la que una nucleasa particular cortará una molécula de ADN determinada depende de la complejidad del ADN y de la longitud de la secuencia de reconocimiento de la nucleasa; debido a la probabilidad estadística de encontrar las bases en un orden particular por casualidad, una secuencia de reconocimiento más larga dará como resultado una digestión menos frecuente. Por ejemplo, se predice que una secuencia dada de cuatro bases (correspondiente al sitio de reconocimiento de una nucleasa hipotética) ocurrirá cada 256 pares de bases en promedio (donde 4 × 4 = 256), pero se espera que cualquier secuencia dada de seis bases ocurra una vez cada 4096 pares de bases en promedio (4 × 6 = 4096). [ 7 ]
Una familia única de nucleasas son las meganucleasas , que se caracterizan por tener secuencias de reconocimiento más grandes y, por lo tanto, menos comunes, compuestas de 12 a 40 pares de bases. Estas nucleasas son particularmente útiles para la ingeniería genética y la ingeniería del genoma en organismos complejos como plantas y mamíferos, donde los genomas generalmente más grandes (que constan de miles de millones de pares de bases) darían lugar a una digestión específica del sitio frecuente y perjudicial con las nucleasas tradicionales.
Véase también
Referencias
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Nishino T, Morikawa K (diciembre de 2002). "Estructura y función de las nucleasas en la reparación del ADN: forma, agarre y hoja de las tijeras del ADN" . Oncogene . 21 (58): 9022–32 . doi : 10.1038/sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- 1 2 Rittié L, Perbal B (junio de 2008). "Enzimas utilizadas en biología molecular: una guía útil" . Journal of Cell Communication and Signaling . 2 ( 1–2 ): 25–45 . doi : 10.1007/ s12079-008-0026-2 . PMC 2570007. PMID 18766469 .
- ↑ Linn S, Arber W (abril de 1968). "Especificidad del huésped del ADN producido por Escherichia coli, X. Restricción in vitro de la forma replicativa del fago fd" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 59 (4): 1300– 6. Bibcode : 1968PNAS...59.1300L . doi : 10.1073/pnas.59.4.1300 . PMC 224867. PMID 4870862 .
- ↑ Arber W, Linn S (1969). "Modificación y restricción del ADN". Annual Review of Biochemistry . 38 : 467–500 . doi : 10.1146/annurev.bi.38.070169.002343 . PMID 4897066 .
- ↑ Winkler FK, Banner DW, Oefner C, Tsernoglou D, Brown RS, Heathman SP, et al. (mayo de 1993). " La estructura cristalina de la endonucleasa EcoRV y de sus complejos con fragmentos de ADN cognados y no cognados" . The EMBO Journal . 12 (5): 1781– 95. doi : 10.2210/pdb4rve/pdb . PMC 413397. PMID 8491171 .
- ↑ Pingoud, A.; Jeltsch, A. (15 de septiembre de 2001). "Estructura y función de las endonucleasas de restricción de tipo II" . Nucleic Acids Research . 29 (18): 3705– 3727. doi : 10.1093/nar/29.18.3705 . ISSN 1362-4962 . PMC 55916. PMID 11557805 .
- ↑ Hernández. "Nucleasas: de defensores inmunitarios primitivos a herramientas biotecnológicas modernas" . Inmunología . doi : 10.1111/imm.13884 . PMC 11799398 .
Enlaces externos
- Tabla de ejemplos de enzimas de restricción
- Acción de la enzima de restricción EcoRI
- Glosario de enzimas
- Nucleasas (Fuente principal de la página...)
- CE 3.1
- Nucleasas
