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Western blot

Flujo de trabajo de Western blot La transferencia Western (a veces llamada inmunotransferencia de proteínas ), o transferencia Western , es una técnica analítica ampliamente uti...

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Flujo de trabajo de Western blot

La transferencia Western (a veces llamada inmunotransferencia de proteínas ), o transferencia Western , es una técnica analítica ampliamente utilizada en biología molecular e inmunogenética para detectar proteínas específicas en una muestra de homogeneizado o extracto de tejido, [ 1 ] y para visualizar, distinguir y cuantificar las diferentes proteínas en una combinación proteica compleja. [ 2 ]

La técnica Western blot utiliza tres elementos para separar una proteína específica de un complejo: separación por tamaño, transferencia de la proteína a un soporte sólido y marcaje de la proteína diana mediante anticuerpos primarios y secundarios para su visualización. [ 1 ] Se crea un anticuerpo sintético o de origen animal (conocido como anticuerpo primario ) que reconoce y se une a una proteína diana específica. La membrana de electroforesis se lava en una solución que contiene el anticuerpo primario, antes de eliminar el exceso de anticuerpo. [ 3 ] Se añade un anticuerpo secundario que reconoce y se une al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se visualiza mediante diversos métodos, como tinción , inmunofluorescencia y radiactividad, lo que permite la detección indirecta de la proteína diana específica. [ 3 ]

Otras técnicas relacionadas incluyen el análisis de puntos , el análisis cuantitativo de puntos , la inmunohistoquímica y la inmunocitoquímica , donde se utilizan anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células mediante inmunotinción , y el ensayo inmunoenzimático (ELISA).

El nombre Western blot es un juego de palabras con Southern blot , una técnica para la detección de ADN que lleva el nombre de su inventor, el biólogo inglés Edwin Southern . De manera similar, la detección de ARN se denomina Northern blot . [ 4 ] El término Western blot fue acuñado por W. Neal Burnette en 1981, [ 5 ] aunque el método, pero no el nombre, fue inventado independientemente en 1979 por Jaime Renart, Jakob Reiser y George Stark , [ 6 ] y por Harry Towbin, Theophil Staehelin y Julian Gordon en el Instituto Friedrich Miescher en Basilea , Suiza . [ 7 ] El grupo de Towbin también utilizó anticuerpos secundarios para la detección, asemejándose así al método actual que se utiliza casi universalmente hoy en día. Entre 1979 y 2019 "se ha mencionado en los títulos, resúmenes y palabras clave de más de 400 000 publicaciones indexadas en PubMed " y puede que siga siendo la técnica de análisis de proteínas más utilizada. [ 8 ]

Aplicaciones

Prueba Western blot para el VIH , donde las dos primeras tiras son controles negativos y positivos, seguidas de las pruebas reales.

El Western blot se utiliza ampliamente en bioquímica para la detección cualitativa de proteínas individuales y modificaciones de proteínas (como modificaciones postraduccionales ). Se estima que al menos el 8-9% de todas las publicaciones relacionadas con proteínas aplican Western blots. [ 8 ] Se utiliza como método general para identificar la presencia de una proteína individual específica dentro de una mezcla compleja de proteínas. Una estimación semicuantitativa de una proteína puede derivarse del tamaño y la intensidad del color de una banda de proteína en la membrana del blot. Además, la aplicación de una serie de diluciones de una proteína purificada de concentraciones conocidas puede permitir una estimación más precisa de la concentración de proteína. El Western blot se utiliza de forma rutinaria para la verificación de la producción de proteínas después de la clonación molecular .

Los Western blots también se utilizan en diagnósticos médicos, por ejemplo, en la prueba del VIH [ 9 ] y la prueba de EEB . La prueba confirmatoria del VIH empleaba anteriormente un Western blot para detectar anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano . Las proteínas de células infectadas por el VIH se separan y se transfieren a una membrana como se describió anteriormente. Luego, el suero que se va a analizar se aplica en el paso de incubación del anticuerpo primario; el anticuerpo libre se elimina mediante lavado y se agrega un anticuerpo secundario antihumano unido a una señal enzimática. Las bandas teñidas indican entonces las proteínas contra las que el suero del paciente contiene anticuerpos. [ 10 ] Un Western blot también se utiliza como prueba definitiva para la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob , un tipo de enfermedad priónica relacionada con el consumo de carne de res contaminada de ganado con encefalopatía espongiforme bovina (EEB, comúnmente conocida como "enfermedad de las vacas locas"). [ 11 ] Otra aplicación es en el diagnóstico de la tularemia . Una evaluación de la capacidad del Western blot para detectar anticuerpos contra F. tularensis reveló que tiene una sensibilidad de casi el 100 % y una especificidad del 99,6 %. [ 12 ] Algunas formas de prueba de la enfermedad de Lyme emplean Western blotting. [ 13 ] Un Western blot también puede usarse como prueba confirmatoria para la infección por hepatitis B [ 14 ] y la infección por HSV-2 (herpes tipo 2). [ 15 ] En medicina veterinaria, un Western blot se usa a veces para confirmar el estado FIV + en gatos. [ 16 ]

Otras aplicaciones de la técnica Western blot incluyen su uso por la Agencia Mundial Antidopaje (AMA). El dopaje sanguíneo es el uso indebido de ciertas técnicas y/o sustancias para aumentar la masa de glóbulos rojos, lo que permite al cuerpo transportar más oxígeno a los músculos y, por lo tanto, aumentar la resistencia y el rendimiento. Hay tres sustancias o métodos ampliamente conocidos utilizados para el dopaje sanguíneo, a saber, la eritropoyetina (EPO), los transportadores sintéticos de oxígeno y las transfusiones de sangre. Cada uno está prohibido en la Lista de Sustancias y Métodos Prohibidos de la AMA. La técnica Western blot se utilizó durante la Copa Mundial de la FIFA 2014 en la campaña antidopaje de ese evento. [ 17 ] En total, Reichel et al. [ 18 ] recolectaron y analizaron más de 1000 muestras en el Laboratorio acreditado por la AMA de Lausana , Suiza . Investigaciones recientes que utilizan la técnica Western blot mostraron una detección mejorada de EPO en sangre y orina basada en nuevos geles horizontales prefabricados Velum SAR optimizados para el análisis de rutina. [ 19 ] Con la adopción de la SAR-PAGE horizontal en combinación con los geles Velum SAR soportados por película prefabricada, la capacidad discriminatoria de la aplicación de microdosis de rEPO mejoró significativamente.

Identificación de la localización de proteínas en las células

Para el desarrollo de medicamentos, la identificación de objetivos terapéuticos y la investigación biológica, es esencial comprender dónde se localizan las proteínas dentro de una célula. [ 2 ] [ 20 ] Las localizaciones subcelulares de las proteínas dentro de la célula y sus funciones están estrechamente relacionadas. La relación entre la función y la localización de las proteínas sugiere que cuando las proteínas se mueven, sus funciones pueden cambiar o adquirir nuevas características. La ubicación subcelular de una proteína se puede determinar utilizando una variedad de métodos. Se han creado y utilizado numerosas herramientas y estrategias computacionales eficientes y fiables para identificar la localización subcelular de las proteínas. [ 21 ] Con la ayuda de métodos de fraccionamiento subcelular, la Western Blot (WB) sigue siendo un método fundamental importante para la investigación y comprensión de la localización de las proteínas. [ 2 ]

Mapeo de epítopos

Debido a sus diversos epítopos , los anticuerpos han despertado interés tanto en la investigación básica como en la clínica. La base de la caracterización y validación de anticuerpos es el mapeo de epítopos. El procedimiento de identificar los sitios de unión (epítopos) de un anticuerpo en la proteína diana se denomina "mapeo de epítopos". Encontrar el epítopo de unión de un anticuerpo es esencial para el descubrimiento y la creación de nuevas vacunas, diagnósticos y terapias. [ 2 ] Como resultado, se han creado varios métodos para mapear los epítopos de los anticuerpos. En este punto, la especificidad de la transferencia Western es la característica principal que la distingue de otras técnicas de mapeo de epítopos. Existen varias aplicaciones de la transferencia Western para el mapeo de epítopos en muestras de piel humana y virus de enfermedades hemorrágicas. [ 2 ] [ 22 ] [ 23 ]

Procedimiento

Del gel a la publicación

El método Western blot se compone de una electroforesis en gel para separar las proteínas nativas según su estructura tridimensional o las proteínas desnaturalizadas según la longitud del polipéptido, seguida de una transferencia electroforética a una membrana (generalmente de PVDF o nitrocelulosa ) y un procedimiento de inmunotinción para visualizar una proteína determinada en la membrana.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) se utiliza generalmente para la separación electroforética desnaturalizante de proteínas. El dodecilsulfato de sodio (SDS) se usa como tampón (además de en el gel) para conferir a todas las proteínas presentes una carga negativa uniforme, ya que las proteínas pueden tener carga positiva, negativa o neutra. Antes de la electroforesis, las muestras de proteínas suelen hervirse para desnaturalizar las proteínas presentes. Esto garantiza que las proteínas se separen según su tamaño y evita que las proteasas (enzimas que degradan las proteínas) degraden las muestras. Tras la separación electroforética, las proteínas se transfieren a una membrana (normalmente de nitrocelulosa o PVDF). La membrana se tiñe con Ponceau S para visualizar las proteínas en el blot y asegurar una transferencia correcta. A continuación, las proteínas se bloquean con leche (u otros agentes bloqueantes) para evitar la unión inespecífica de anticuerpos y, posteriormente, se tiñen con anticuerpos específicos para la proteína diana. [ 7 ] [ 6 ] Por último, la membrana se tiñe con un anticuerpo secundario que reconoce la tinción del primer anticuerpo, el cual puede utilizarse para su detección mediante diversos métodos. El paso de electroforesis en gel se incluye en el análisis Western blot para resolver el problema de la reactividad cruzada de los anticuerpos.

Preparación de la muestra

Como paso fundamental en la realización de un Western blot, la preparación de la muestra debe realizarse de manera eficaz, ya que la interpretación de este ensayo se ve influenciada por la preparación de la proteína, que comprende procesos de extracción y purificación de proteínas. [ 24 ] [ 3 ] Para lograr una extracción eficiente de proteínas, es necesario elegir un método de homogeneización adecuado, dado que este es responsable de la ruptura de la membrana celular y la liberación de los componentes intracelulares. [ 3 ] [ 25 ] Además, se necesita un tampón de lisis ideal para obtener cantidades sustanciales de la proteína objetivo, ya que el tampón dirige el proceso de solubilización de la proteína y previene su degradación. Una vez completada la preparación de la muestra, el contenido proteico está listo para ser separado mediante electroforesis en gel. [ 3 ]

electroforesis en gel

electroforesis SDS-PAGE

Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel . La separación de proteínas puede realizarse según el punto isoeléctrico (pI), el peso molecular , la carga eléctrica o una combinación de estos factores. El tipo de separación depende del tratamiento de la muestra y de las características del gel.

La electroforesis en gel más común emplea geles de poliacrilamida y tampones cargados con dodecilsulfato de sodio (SDS). La SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS) mantiene los polipéptidos en un estado desnaturalizado tras ser tratados con agentes reductores fuertes para eliminar la estructura secundaria y terciaria (por ejemplo, enlaces disulfuro [SS] a grupos sulfhidrilo [SH y SH]), lo que permite la separación de proteínas según su masa molecular . Las proteínas analizadas se recubren con el SDS, cargado negativamente, convirtiéndose efectivamente en aniónicas , y migran hacia el ánodo, cargado positivamente (de mayor voltaje) (generalmente con un cable rojo), a través de la malla de acrilamida del gel. Las proteínas más pequeñas migran más rápido a través de esta malla, y así se separan según su tamaño (generalmente medido en kilodaltons, kDa ). La concentración de acrilamida determina la resolución del gel: cuanto mayor sea la concentración de acrilamida, mejor será la resolución de las proteínas de menor peso molecular. Cuanto menor sea la concentración de acrilamida, mejor será la resolución de las proteínas de mayor peso molecular. En la mayoría de los casos, las proteínas se desplazan en una sola dimensión a lo largo del gel.

Las muestras se cargan en los pocillos del gel. Generalmente, se reserva una calle para un marcador o escalera , que es una mezcla comercial de proteínas de peso molecular conocido, teñida para formar bandas visibles y coloreadas. Al aplicar voltaje al gel, las proteínas migran a través de él a diferentes velocidades, según su tamaño. Estas diferentes velocidades de avance (diferentes movilidades electroforéticas ) forman bandas dentro de cada calle . Posteriormente, las bandas de proteínas se comparan con las bandas de la escalera, lo que permite estimar el peso molecular de la proteína.

También es posible utilizar un gel bidimensional que distribuye las proteínas de una sola muestra en dos dimensiones. Las proteínas se separan según su punto isoeléctrico ( pH al que tienen una carga neta neutra) en la primera dimensión y según su peso molecular en la segunda.

Transferir

transferencia Western blot

Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se transfieren desde el interior del gel a una membrana, un soporte sólido, que es una parte esencial del proceso. Existen dos tipos de membrana: nitrocelulosa (NC) o difluoruro de polivinilideno (PVDF ). La membrana de NC tiene una alta afinidad por las proteínas y una gran capacidad de retención. Sin embargo, la NC es frágil y no permite volver a sondear la membrana, mientras que la membrana de PVDF sí lo permite. [ 1 ] El método más utilizado para transferir las proteínas se denomina electrotransferencia . La electrotransferencia utiliza una corriente eléctrica para atraer las proteínas con carga negativa desde el gel hacia el ánodo con carga positiva, y hacia la membrana de PVDF o NC. Las proteínas se mueven desde el interior del gel a la membrana manteniendo la organización que tenían dentro del gel. Un método de transferencia más antiguo consiste en colocar una membrana sobre el gel y una pila de papeles de filtro encima de esta. Toda la pila se coloca en una solución tampón que asciende por el papel por acción capilar , arrastrando consigo las proteínas. En la práctica, este método no se utiliza habitualmente debido a la larga duración del procedimiento.

Como resultado de cualquiera de los procesos de transferencia, las proteínas quedan expuestas en una fina capa de membrana para su detección. Ambos tipos de membrana se eligen por sus propiedades de unión a proteínas no específicas (es decir, se unen a todas las proteínas con la misma eficacia). La unión a proteínas se basa en interacciones hidrofóbicas, así como en interacciones electrostáticas entre la membrana y la proteína. Las membranas de nitrocelulosa son más económicas que las de PVDF, pero son mucho más frágiles y no soportan análisis repetidos.

Tinción de proteínas totales

Unión por Western blot

La tinción de proteínas totales permite visualizar la cantidad total de proteína transferida con éxito a la membrana, lo que permite al usuario comprobar la uniformidad de la transferencia de proteínas y realizar la normalización posterior de la proteína diana con la cantidad real de proteína por carril. La normalización con el llamado "control de carga" se basaba en la inmunotinción de proteínas de referencia en el procedimiento clásico, pero recientemente se está orientando hacia la tinción de proteínas totales debido a sus múltiples beneficios. [ 26 ] Se han descrito al menos siete enfoques diferentes para la tinción de proteínas totales para la normalización de Western blot: Ponceau S , técnicas sin tinción, Sypro Ruby, Epicocconona , Coomassie R-350 , Amido Black y Cy5 . [ 26 ] Para evitar el ruido de la señal, la tinción de proteínas totales debe realizarse antes del bloqueo de la membrana. No obstante, también se han descrito tinciones posteriores al anticuerpo. [ 27 ]

Bloqueo

Dado que la membrana se ha elegido por su capacidad de unión a proteínas y que tanto los anticuerpos como el objetivo son proteínas, deben tomarse medidas para evitar las interacciones entre la membrana y el anticuerpo utilizado para la detección de la proteína objetivo. El bloqueo de la unión inespecífica se logra colocando la membrana en una solución diluida de proteína, típicamente 3-5% de albúmina de suero bovino (BSA) o leche desnatada en polvo (ambas económicas) en solución salina tamponada con Tris (TBS) o I-Block, con un porcentaje mínimo (0,1%) de detergente como Tween 20 o Triton X-100 . Aunque se prefiere la leche desnatada en polvo por su disponibilidad, se necesita una solución de bloqueo adecuada, ya que no todas las proteínas de la leche son compatibles con todas las bandas de detección. [ 1 ] La proteína en la solución diluida se une a la membrana en todos los lugares donde las proteínas objetivo no se han unido. Por lo tanto, cuando se agrega el anticuerpo, este no puede unirse a la membrana y, por consiguiente, el único sitio de unión disponible es la proteína objetivo específica. Esto reduce el ruido de fondo en el producto final del Western blot, lo que da lugar a resultados más claros y elimina los falsos positivos.

Incubación

Proceso de sondeo

Durante el proceso de detección, la membrana se analiza en busca de la proteína de interés mediante un anticuerpo modificado unido a una enzima marcadora. Al entrar en contacto con un sustrato adecuado, esta enzima desencadena una reacción colorimétrica y produce un color. Por diversas razones, este proceso se realiza tradicionalmente en dos etapas, aunque actualmente existen métodos de detección en una sola etapa para ciertas aplicaciones.

Anticuerpo primario

Los anticuerpos primarios se generan cuando una especie huésped o un cultivo de células inmunitarias se expone a la proteína de interés (o a una parte de ella). Normalmente, esto forma parte de la respuesta inmunitaria, mientras que en este caso se extraen y se utilizan como herramientas de detección sensibles y específicas que se unen directamente a la proteína.

Después del bloqueo, una solución de anticuerpo primario (generalmente entre 0,5 y 5 microgramos/mL) diluida en tampón de lavado PBS o TBST se incuba con la membrana bajo agitación suave durante típicamente una hora a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. También se puede incubar a diferentes temperaturas, y las temperaturas más bajas se asocian con una mayor unión, tanto específica (a la proteína diana, la "señal") como no específica ("ruido"). Después de la incubación, la membrana se lava varias veces en tampón de lavado para eliminar el anticuerpo primario no unido y así minimizar el fondo. [ 1 ] Por lo general, la solución de tampón de lavado se compone de una solución salina tamponada con un pequeño porcentaje de detergente, y a veces con leche en polvo o BSA.

Anticuerpo secundario

Tras enjuagar la membrana para eliminar el anticuerpo primario no unido, esta se expone a otro anticuerpo, conocido como anticuerpo secundario . Los anticuerpos provienen de fuentes animales (o cultivos de hibridomas de origen animal ). El anticuerpo secundario reconoce y se une a la porción específica de la especie del anticuerpo primario. Por lo tanto, un anticuerpo secundario anti-ratón se unirá a casi cualquier anticuerpo primario de origen murino y puede denominarse anticuerpo "anti-especie" (por ejemplo, anti-ratón, anti-cabra, etc.). Para permitir la detección de la proteína diana, el anticuerpo secundario suele estar unido a biotina o a una enzima reportera , como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante . Esto significa que varios anticuerpos secundarios se unirán a un anticuerpo primario y potenciarán la señal, permitiendo la detección de proteínas en concentraciones mucho menores que las que se detectarían mediante SDS-PAGE únicamente.

La peroxidasa de rábano picante se une comúnmente a anticuerpos secundarios para permitir la detección de la proteína diana mediante quimioluminiscencia . El sustrato quimioluminiscente es escindido por la peroxidasa de rábano picante, lo que produce luminiscencia . Por lo tanto, la producción de luminiscencia es proporcional a la cantidad de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y, en consecuencia, mide indirectamente la presencia de la proteína diana. Se coloca una lámina sensible de película fotográfica contra la membrana, y la exposición a la luz de la reacción crea una imagen de los anticuerpos unidos a la membrana. Un método más económico pero menos sensible utiliza una tinción con 4-cloronaftol y peróxido de hidrógeno al 1% ; la reacción de los radicales peróxido con el 4-cloronaftol produce una tinción púrpura oscura que puede fotografiarse sin utilizar película fotográfica especializada.

Al igual que en los procedimientos ELISPOT y ELISA , se puede proporcionar a la enzima una molécula de sustrato que será convertida por la enzima en un producto de reacción coloreado que será visible en la membrana (véase la figura siguiente con bandas azules).

Otro método de detección de anticuerpos secundarios utiliza un anticuerpo unido a un fluoróforo de infrarrojo cercano. La luz producida por la excitación de un colorante fluorescente es estática, lo que hace que la detección por fluorescencia sea una medida más precisa y exacta de la diferencia en la señal producida por anticuerpos marcados unidos a proteínas en un Western blot. Las proteínas se pueden cuantificar con precisión porque la señal generada por las diferentes cantidades de proteínas en las membranas se mide en un estado estático, en comparación con la quimioluminiscencia, en la que la luz se mide en un estado dinámico. [ 28 ]

Una tercera alternativa consiste en utilizar un marcador radiactivo en lugar de una enzima acoplada al anticuerpo secundario, como por ejemplo, marcar una proteína de unión a anticuerpos, como la proteína A de Staphylococcus o la estreptavidina, con un isótopo radiactivo de yodo. Dado que otros métodos son más seguros, rápidos y económicos, este método se utiliza actualmente con poca frecuencia; sin embargo, una ventaja de este enfoque es la sensibilidad de la imagen basada en autorradiografía, que permite una cuantificación de proteínas de alta precisión cuando se combina con software óptico (por ejemplo, Optiquant).

Un paso

Históricamente, el proceso de sondeo se realizaba en dos pasos debido a la relativa facilidad de producir anticuerpos primarios y secundarios por separado. Esto ofrece a investigadores y empresas grandes ventajas en términos de flexibilidad, reducción de costes y añade un paso de amplificación al proceso de detección. Sin embargo, con el auge del análisis de proteínas de alto rendimiento y la disminución de los límites de detección, ha surgido interés en desarrollar sistemas de sondeo de un solo paso que permitan un proceso más rápido y con menos consumibles. Esto requiere un anticuerpo sonda que reconozca la proteína de interés y contenga una etiqueta detectable; estas sondas suelen estar disponibles para etiquetas de proteínas conocidas . La sonda primaria se incuba con la membrana de forma similar a como se hace con el anticuerpo primario en un proceso de dos pasos, y luego está lista para la detección directa tras una serie de lavados.

Detección y visualización

Detección quimioluminiscente mediante Western blot

Tras eliminar las sondas no unidas mediante lavado, el Western blot está listo para la detección de las sondas marcadas y unidas a la proteína de interés. En la práctica, no todos los Western blots revelan la proteína en una sola banda de la membrana. Se realizan aproximaciones de tamaño comparando las bandas teñidas con el marcador o escalera cargado durante la electroforesis. Este proceso se repite habitualmente para proteínas estructurales, como la actina o la tubulina , cuyo tamaño no debería variar entre muestras. La cantidad de proteína diana se normaliza con respecto a la proteína estructural para controlar la distribución entre grupos. Una estrategia superior consiste en la normalización con respecto a la proteína total visualizada con tricloroetanol [ 29 ] [ 30 ] o epicoconona [ 31 ] . Esta práctica garantiza la corrección de la cantidad de proteína total en la membrana en caso de errores o transferencias incompletas (véase Normalización del Western blot ) .

Detección colorimétrica

El método de detección colorimétrica se basa en la incubación del Western blot con un sustrato que reacciona con la enzima reportera (como la peroxidasa ) unida al anticuerpo secundario. Esto convierte el colorante soluble en una forma insoluble de otro color que precipita junto a la enzima, tiñendo así la membrana. El desarrollo del Western blot se detiene lavando el colorante soluble. Los niveles de proteína se evalúan mediante densitometría (intensidad de la tinción) o espectrofotometría .

detección quimioluminiscente

Los métodos de detección quimioluminiscente se basan en la incubación del Western blot con un sustrato que emite luminiscencia al exponerse al marcador del anticuerpo secundario. La luz es detectada por cámaras CCD que capturan una imagen digital del Western blot o una película fotográfica. El uso de película para la detección de Western blot está desapareciendo gradualmente debido a la no linealidad de la imagen (cuantificación imprecisa). La imagen se analiza mediante densitometría, que evalúa la cantidad relativa de tinción de proteínas y cuantifica los resultados en términos de densidad óptica. El software más reciente permite un análisis de datos adicional, como el análisis del peso molecular, si se utilizan los estándares adecuados.

Detección radiactiva

Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimáticos, sino que permiten colocar la película de rayos X médica directamente sobre el Western blot, que se revela al exponerse al marcador y crea regiones oscuras que corresponden a las bandas de proteínas de interés (véase la imagen superior). La importancia de los métodos de detección radiactiva está disminuyendo debido a su peligrosa radiación , su elevado coste y los altos riesgos para la salud y la seguridad. La ECL (quimioluminiscencia mejorada) ofrece una alternativa útil.

Detección por fluorescencia

Western blot utilizando un anticuerpo primario anti- ácido lipoico y un anticuerpo secundario marcado con colorante IR en extractos de Leishmania major.

La sonda marcada con fluorescencia se excita con luz y la emisión de la excitación es detectada por un fotosensor, como una cámara CCD equipada con filtros de emisión adecuados, que captura una imagen digital del Western blot y permite un análisis de datos posterior, como el análisis del peso molecular y el análisis cuantitativo del Western blot. La fluorescencia se considera uno de los mejores métodos de cuantificación, pero es menos sensible que la quimioluminiscencia. [ 32 ]

Sondeo secundario

Una diferencia importante entre las membranas de nitrocelulosa y PVDF radica en su capacidad para eliminar anticuerpos y reutilizarlas para sondas de anticuerpos posteriores. Si bien existen protocolos bien establecidos para la eliminación de anticuerpos en membranas de nitrocelulosa, la mayor resistencia del PVDF facilita este proceso y permite una mayor reutilización antes de que el ruido de fondo limite los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe sumergirse en etanol al 95 %, isopropanol o metanol antes de su uso. Las membranas de PVDF también tienden a ser más gruesas y resistentes a los daños durante su uso. [ 33 ]

Especificación de requisitos mínimos para Western Blot

Para garantizar la reproducibilidad de los resultados de los Western blots, es importante informar sobre los diversos parámetros mencionados anteriormente, incluyendo la preparación de la muestra, la concentración de proteína utilizada para la carga, el porcentaje de gel y las condiciones de electroforesis, los diferentes métodos de transferencia, las condiciones de bloqueo, la concentración de anticuerpos y los métodos de identificación y cuantificación. Muchos de los artículos publicados no abarcan todas estas variables. Por lo tanto, es crucial describir las diferentes circunstancias o parámetros experimentales para aumentar la repetibilidad y la precisión de los Western blots. Para aumentar la repetibilidad de los Western blots, se requiere un criterio mínimo de reporte. [ 2 ] [ 34 ]

Electroforesis en gel bidimensional

La electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) utiliza los principios y técnicas descritos anteriormente. Como su nombre indica, la SDS-PAGE bidimensional implica la migración de polipéptidos en dos dimensiones. Por ejemplo, en la primera dimensión, los polipéptidos se separan según su punto isoeléctrico , mientras que en la segunda dimensión se separan según su peso molecular . El punto isoeléctrico de una proteína determinada está determinado por la proporción de aminoácidos con carga positiva (p. ej., lisina, arginina) y negativa (p. ej., glutamato, aspartato), donde los aminoácidos con carga negativa contribuyen a un punto isoeléctrico bajo y los aminoácidos con carga positiva a un punto isoeléctrico alto. Las muestras también pueden separarse primero en condiciones no reductoras mediante SDS-PAGE, y en condiciones reductoras en la segunda dimensión, lo que rompe los enlaces disulfuro que mantienen unidas las subunidades. La SDS-PAGE también puede combinarse con la electroforesis en gel de poliacrilamida con urea (urea-PAGE) para obtener un gel bidimensional.

En principio, este método permite separar todas las proteínas celulares en un único gel de gran tamaño. Una ventaja importante es que suele distinguir entre diferentes isoformas de una misma proteína, por ejemplo, una proteína fosforilada (mediante la adición de un grupo con carga negativa). Las proteínas separadas pueden extraerse del gel y analizarse mediante espectrometría de masas , que determina su peso molecular.

Problemas

Problemas de detección

Puede haber una señal débil o ausente en la banda por varias razones relacionadas con la cantidad de anticuerpo y antígeno utilizados. Este problema podría resolverse utilizando las concentraciones y diluciones ideales de antígeno y anticuerpo especificadas en la hoja de datos del proveedor. Aumentar el tiempo de exposición en el software del sistema de detección puede solucionar las bandas débiles causadas por concentraciones bajas de muestra y anticuerpo. [ 2 ]

Problemas de múltiples bandas

Cuando la proteína se degrada por acción de las proteasas, pueden aparecer varias bandas distintas a las esperadas de bajo peso molecular. La aparición de numerosas bandas puede prevenirse preparando adecuadamente las muestras de proteína con suficientes inhibidores de proteasas. Pueden aparecer múltiples bandas en la región de alto peso molecular debido a que algunas proteínas forman dímeros, trímeros y multímeros; este problema puede resolverse calentando la muestra durante periodos de tiempo más prolongados. Las proteínas con modificaciones postraduccionales (MPT) o numerosas isoformas provocan la aparición de varias bandas en diferentes rangos de peso molecular. Las MPT pueden eliminarse de una muestra mediante productos químicos específicos, que también eliminan las bandas adicionales. [ 2 ]

Fondo alto

Las altas concentraciones de anticuerpos, el bloqueo inadecuado, el lavado insuficiente y el tiempo de exposición excesivo durante la obtención de imágenes pueden generar un alto nivel de fondo en las membranas. Este alto nivel de fondo podría evitarse corrigiendo estos problemas. [ 2 ]

Bandas irregulares y desiguales

Se ha afirmado que se han producido diversas bandas extrañas y desiguales, incluyendo puntos negros, manchas o bandas blancas y bandas curvas. Los puntos de bloqueo se eliminan de las membranas mediante un bloqueo eficaz. Se desarrollan manchas blancas como resultado de burbujas entre la membrana y el gel. Aparecen bandas blancas en las membranas cuando los anticuerpos primarios y secundarios están presentes en concentraciones significativas. Debido al alto voltaje utilizado durante la electroforesis y la rápida migración de proteínas, aparecen bandas con forma de carita sonriente en las membranas. Las bandas extrañas en la membrana se resuelven solucionando estos problemas. [ 2 ]

Medidas de mitigación

Durante la transferencia Western, pueden surgir diversos problemas relacionados con las diferentes etapas del procedimiento. Estos problemas pueden originarse en el análisis de proteínas, como la detección de proteínas con baja o nula modificación postraduccional. Además, pueden deberse a la selección de anticuerpos, ya que la calidad de estos desempeña un papel fundamental en la detección específica de proteínas. [ 3 ] Debido a la presencia de este tipo de problemas, se están desarrollando diversas mejoras en la preparación de lisados ​​celulares y en los procedimientos de transferencia para obtener resultados fiables. Asimismo, para lograr un análisis más sensible y superar los problemas asociados con la transferencia Western, se han desarrollado y utilizado diversas técnicas, como la transferencia Western de largo alcance , la transferencia por difusión, la transferencia Western con resolución de célula única y la transferencia Western microfluídica automatizada . [ 3 ]

Presentación

Los investigadores utilizan distintos programas informáticos para procesar y alinear las secciones de imágenes y así lograr una presentación elegante de los resultados de la transferencia Western. Entre las herramientas más populares se encuentran Adobe Illustrator , GIMP , ImageJ , Microsoft PowerPoint y Sciugo .

Véase también

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 Mahmood T, Yang PC (septiembre de 2012). "Western blot: técnica, teoría y resolución de problemas" . North American Journal of Medical Sciences . 4 (9): 429– 434. doi : 10.4103/1947-2714.100998 (inactivo el 12 de julio de 2025). PMC 3456489. PMID 23050259 .  {{cite journal}}: CS1 maint: DOI inactivo desde julio de 2025 ( enlace )
  2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Begum H, Murugesan P, Tangutur AD (junio de 2022). "Western blotting: un elemento fundamental en la investigación científica y biomédica" . BioTechniques . 73 ( 1): 58– 69. doi : 10.2144/btn-2022-0003 . PMID 35775367. S2CID 250175915 .  
  3. 1 2 3 4 5 6 7 Mishra M, Tiwari S, Gomes AV (noviembre de 2017). "Purificación y análisis de proteínas: técnicas de Western blotting de próxima generación" . Expert Review of Proteomics . 14 (11): 1037– 1053. doi : 10.1080/14789450.2017.1388167 . PMC 6810642. PMID 28974114 .  
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