Criopreservación

La congelación lenta y de velocidad controlada , también conocida como congelación programable lenta (SPF) , ^{[ 19 ]} es una técnica en la que las células se enfrían a alrededor de -196  °C en el transcurso de varias horas.

La congelación lenta programable se desarrolló a principios de la década de 1970 y, finalmente, dio como resultado el primer nacimiento de un embrión humano congelado en 1984. Desde entonces, se han utilizado máquinas que congelan muestras biológicas mediante secuencias programables o velocidades controladas en biología humana, animal y celular, congelando mejor las muestras para su posterior descongelación, antes de congelarlas o criopreservarlas en nitrógeno líquido. Estas máquinas se utilizan para congelar ovocitos, piel, productos sanguíneos, embriones, espermatozoides, células madre y para la preservación general de tejidos en hospitales, clínicas veterinarias y laboratorios de investigación de todo el mundo. Por ejemplo, se estima que entre 300.000 y 400.000 nacimientos de embriones congelados mediante congelación lenta representan el 20 % de los aproximadamente 3 millones de nacimientos por fertilización in vitro (FIV). ^{[ 20 ]}

La congelación intracelular letal puede evitarse si el enfriamiento es lo suficientemente lento como para permitir que salga suficiente agua de la célula durante la congelación progresiva del fluido extracelular. Para minimizar el crecimiento de cristales de hielo extracelulares y la recristalización, ^{[ 21 ]} se pueden utilizar biomateriales como alginatos , alcohol polivinílico o quitosano para impedir el crecimiento de cristales de hielo junto con crioprotectores tradicionales de molécula pequeña . ^{[ 22 ]} Esa velocidad difiere entre células de distinto tamaño y permeabilidad al agua : una velocidad de enfriamiento típica de aproximadamente 1  °C/minuto es apropiada para muchas células de mamíferos después del tratamiento con crioprotectores como glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO), pero la velocidad no es un óptimo universal. La  velocidad de 1 °C/minuto se puede lograr utilizando dispositivos como un congelador con control de velocidad o un contenedor de congelación portátil de sobremesa. ^{[ 23 ]}

Diversos estudios independientes han aportado evidencia de que los embriones congelados, almacenados mediante técnicas de congelación lenta, podrían ser, en algunos aspectos, superiores a los embriones frescos en la fecundación in vitro (FIV). Estos estudios indican que el uso de embriones y óvulos congelados, en lugar de embriones y óvulos frescos, reduce el riesgo de muerte fetal y parto prematuro, si bien aún se están investigando las razones exactas.

La vitrificación es un proceso de congelación ultrarrápida que ayuda a prevenir la formación de cristales de hielo y a evitar daños durante la crioconservación.

Los investigadores Greg Fahy y William F. Rall ayudaron a introducir la vitrificación en la criopreservación reproductiva a mediados de la década de 1980. ^{[ 24 ]} A partir del año 2000, los investigadores afirman que la vitrificación proporciona los beneficios de la criopreservación sin el daño debido a la formación de cristales de hielo. ^{[ 25 ]} La situación se volvió más compleja con el desarrollo de la ingeniería de tejidos , ya que tanto las células como los biomateriales necesitan permanecer libres de hielo para preservar una alta viabilidad y funciones celulares, la integridad de los constructos y la estructura de los biomateriales. La vitrificación de constructos de ingeniería de tejidos fue reportada por primera vez por Lilia Kuleshova, ^{[ 26 ]} quien también fue la primera científica en lograr la vitrificación de ovocitos , lo que resultó en un nacimiento vivo en 1999. ^{[ 27 ]} Para la criopreservación clínica, la vitrificación generalmente requiere la adición de crioprotectores antes del enfriamiento. Los crioprotectores son macromoléculas que se añaden al medio de congelación para proteger las células de los efectos nocivos de la formación de cristales de hielo intracelulares o de los efectos de la solución durante el proceso de congelación y descongelación. Permiten una mayor supervivencia celular durante la congelación, reducen el punto de congelación y protegen la membrana celular de los daños causados ​​por la congelación. Los crioprotectores presentan alta solubilidad, baja toxicidad a altas concentraciones, bajo peso molecular y la capacidad de interactuar con el agua mediante enlaces de hidrógeno.

En lugar de cristalizar , la solución viscosa se convierte en hielo amorfo ; se vitrifica . En vez de un cambio de fase de líquido a sólido por cristalización, el estado amorfo es como un "líquido sólido", y la transformación se produce en un pequeño rango de temperatura conocido como la temperatura de " transición vítrea ".

La vitrificación del agua se ve favorecida por el enfriamiento rápido y puede lograrse sin crioprotectores mediante una disminución extremadamente rápida de la temperatura (megakelvins por segundo). Hasta 2005, se consideraba imposible alcanzar la velocidad necesaria para que el agua pura alcanzara el estado vítreo. ^{[ 28 ]}

Para que se produzca la vitrificación, generalmente se requieren dos condiciones: un aumento de la viscosidad y una disminución de la temperatura de congelación. Muchos solutos producen ambos efectos, pero las moléculas más grandes suelen tener un mayor impacto, sobre todo en la viscosidad. El enfriamiento rápido también favorece la vitrificación.

Para los métodos establecidos de criopreservación, el soluto debe penetrar la membrana celular para lograr una mayor viscosidad y disminuir la temperatura de congelación dentro de la célula. Los azúcares no permean fácilmente a través de la membrana. Aquellos solutos que sí lo hacen, como el DMSO, un crioprotector común, suelen ser tóxicos en altas concentraciones. Uno de los compromisos difíciles de la criopreservación por vitrificación es limitar el daño producido por el propio crioprotector debido a su toxicidad. Las mezclas de crioprotectores y el uso de bloqueadores de hielo han permitido a la empresa 21st Century Medicine vitrificar un riñón de conejo a −135 °C con su mezcla de vitrificación patentada. Tras el recalentamiento, el riñón se trasplantó con éxito a un conejo, con funcionalidad y viabilidad completas, capaz de mantener al conejo indefinidamente como su único riñón funcional. ^{[ 29 ]} En 2000, FM-2030 se convirtió en la primera persona en ser vitrificada con éxito post mortem. ^{[ 30 ]} 

La sangre puede reemplazarse con gases nobles inertes y/o gases metabólicamente vitales como el oxígeno , de modo que los órganos se enfríen más rápidamente y se necesite menos anticongelante. Dado que las regiones de tejido están separadas por gas, las pequeñas expansiones no se acumulan, protegiendo así contra la fragmentación. ^{[ 31 ]} Las presiones de 60 atm pueden ayudar a aumentar las tasas de intercambio de calor. ^{[ 32 ]} La perfusión/persuflación de oxígeno gaseoso puede mejorar la preservación de órganos en comparación con el almacenamiento en frío estático o la perfusión hipotérmica con máquina, ya que la menor viscosidad de los gases puede ayudar a alcanzar más regiones de los órganos preservados y suministrar más oxígeno por gramo de tejido. ^{[ 33 ]}

La criopreservación de embriones se utiliza para el almacenamiento de embriones, por ejemplo, cuando la fecundación in vitro ha dado como resultado más embriones de los que se necesitan en ese momento.

Se ha informado de un embarazo y el consiguiente nacimiento sano a partir de un embrión almacenado durante 27 años, tras el embarazo exitoso de un embrión del mismo lote tres años antes. ^{[ 44 ]} Muchos estudios han evaluado a los niños nacidos de embriones congelados, o "frosties". El resultado ha sido uniformemente positivo, sin aumento de defectos congénitos ni anomalías del desarrollo. ^{[ 45 ]} Un estudio de más de 11.000 embriones humanos criopreservados no mostró un efecto significativo del tiempo de almacenamiento en la supervivencia posterior a la descongelación para ciclos de FIV o donación de ovocitos, ni para embriones congelados en las etapas de pronúcleo o segmentación. ^{[ 46 ]} Además, la duración del almacenamiento no tuvo ningún efecto significativo en el embarazo clínico, el aborto espontáneo, la implantación o la tasa de nacimientos vivos, ya sea de ciclos de FIV o donación de ovocitos. ^{[ 46 ]} Más bien, la edad del ovocito, la proporción de supervivencia y el número de embriones transferidos son predictores del resultado del embarazo. ^{[ 46 ]}

La criopreservación de tejido ovárico es de interés para las mujeres que desean preservar su función reproductiva más allá del límite natural, o cuyo potencial reproductivo se ve amenazado por la terapia contra el cáncer, ^{[ 47 ]} por ejemplo en neoplasias hematológicas o cáncer de mama. ^{[ 48 ]} El procedimiento consiste en tomar una parte del ovario y congelarla lentamente antes de almacenarla en nitrógeno líquido mientras se lleva a cabo la terapia. El tejido se puede descongelar e implantar cerca de la trompa de Falopio, ya sea ortotópicamente (en la ubicación natural) o heterotópicamente (en la pared abdominal), ^{[ 48 ]} donde comienza a producir nuevos óvulos, permitiendo que ocurra la concepción normal. ^{[ 49 ]} El tejido ovárico también se puede trasplantar a ratones inmunocomprometidos ( ratones SCID ) para evitar el rechazo del injerto , y el tejido se puede recolectar posteriormente cuando se han desarrollado folículos maduros. ^{[ 50 ]}

La criopreservación de ovocitos humanos es una nueva tecnología en la que los óvulos de una mujer ( ovocitos ) se extraen, congelan y almacenan. Posteriormente, cuando está lista para quedar embarazada, los óvulos pueden descongelarse, fertilizarse y transferirse al útero como embriones . Desde 1999, cuando Kuleshova y colaboradores informaron en la revista Human Reproduction sobre el nacimiento del primer bebé a partir de un embrión derivado de óvulos de mujer vitrificados y descongelados, ^{[ 26 ]} este concepto ha sido reconocido y difundido ampliamente. Este avance en la vitrificación de ovocitos de mujer supuso un importante progreso en nuestro conocimiento y práctica del proceso de FIV, ya que la tasa de embarazo clínico es cuatro veces mayor después de la vitrificación de ovocitos que después de la congelación lenta. ^{[ 51 ]} La vitrificación de ovocitos es vital para preservar la fertilidad en pacientes jóvenes con cáncer y para personas que se someten a FIV y que se oponen, por razones religiosas o éticas, a la práctica de congelar embriones.

El semen puede utilizarse con éxito casi indefinidamente tras su criopreservación en un banco de esperma . El periodo de almacenamiento exitoso más prolongado registrado es de 22 años. ^{[ 52 ]} Puede utilizarse para la donación de esperma cuando el receptor desea recibir el tratamiento en un momento o lugar diferente, o como medio para preservar la fertilidad en hombres sometidos a vasectomía o tratamientos que puedan comprometerla, como quimioterapia , radioterapia o cirugía.

La criopreservación de tejido testicular inmaduro es un método en desarrollo para brindar reproducción a niños que necesitan terapia gonadotóxica. Los datos en animales son prometedores, ya que se han obtenido crías sanas después del trasplante de suspensiones de células testiculares congeladas o fragmentos de tejido. Sin embargo, ninguna de las opciones de restauración de la fertilidad a partir de tejido congelado (trasplante de suspensiones celulares, injerto de tejido y maduración in vitro) ha demostrado ser eficaz y segura en humanos hasta el momento. ^{[ 53 ]}

La criopreservación de plantas de musgo enteras , especialmente de Physcomitrella patens , ha sido desarrollada por Ralf Reski y colaboradores ^{[ 54 ]} y se lleva a cabo en el Centro Internacional de Colecciones de Musgo . Este biobanco recolecta, conserva y distribuye mutantes y ecotipos de musgo ^{[ 55 ]} .

Las MSC, cuando se transfunden inmediatamente pocas horas después de la descongelación, pueden mostrar una función reducida o una menor eficacia en el tratamiento de enfermedades en comparación con las MSC que se encuentran en la fase logarítmica de crecimiento celular (frescas). Por lo tanto, las MSC criopreservadas deben volver a la fase logarítmica de crecimiento celular en cultivo in vitro antes de su administración en ensayos clínicos o terapias experimentales. El recultivo de las MSC ayudará a recuperarse del impacto que sufren las células durante la congelación y descongelación. Diversos ensayos clínicos con MSC que utilizaron productos criopreservados inmediatamente después de la descongelación han fracasado en comparación con aquellos que utilizaron MSC frescas. ^{[ 56 ]}

La crioconservación de plantas se está volviendo vital por su valor para la biodiversidad. Las semillas suelen considerarse un importante sistema de transmisión de información genética. La crioconservación de semillas recalcitrantes es la más difícil debido a su intolerancia a las bajas temperaturas y al bajo contenido de agua. ^{[ 57 ]} Sin embargo, la solución de vitrificación vegetal puede resolver el problema y ayudar a crioconservar semillas recalcitrantes (Nymphaea caerulea). ^{[ 58 ]}

Los hongos, especialmente los zigomicetos, ascomicetos y basidiomicetos superiores, independientemente de su esporulación, pueden almacenarse en nitrógeno líquido o ultracongelarse. La crioconservación es un método fundamental para los hongos que no esporulan (de lo contrario, se pueden utilizar otros métodos de conservación de esporas a menor costo y con mayor facilidad), los que esporulan pero tienen esporas delicadas (grandes o sensibles a la liofilización), los patógenos (es peligroso mantener hongos metabólicamente activos) o los que se van a utilizar para la obtención de cepas genéticas (idealmente, para que tengan una composición idéntica a la del depósito original). Al igual que con muchos otros organismos, se utilizan crioprotectores como DMSO o glicerol (por ejemplo, glicerol al 10 % para hongos filamentosos o glicerol al 20 % para levaduras). Las diferencias en la elección de crioprotectores dependen de la especie (o clase), pero generalmente para los hongos, los crioprotectores penetrantes como el DMSO, el glicerol o el polietilenglicol son los más efectivos (otros no penetrantes incluyen azúcares como el manitol, el sorbitol, el dextrano, etc.). No se recomienda la repetición de ciclos de congelación-descongelación, ya que puede disminuir la viabilidad. Se recomiendan congeladores de reserva o sitios de almacenamiento de nitrógeno líquido. A continuación se resumen varios protocolos de congelación (cada uno utiliza criotubos de polipropileno con tapón de rosca): ^{[ 61 ]}

Muchas cepas de laboratorio cultivables comunes se congelan profundamente para preservar existencias genéticamente y fenotípicamente estables a largo plazo. ^{[ 62 ]} El subcultivo y las muestras refrigeradas prolongadas pueden provocar la pérdida de plásmidos o mutaciones. Los porcentajes finales comunes de glicerol son 15, 20 y 25. De una placa de cultivo fresca, se elige una sola colonia de interés y se realiza un cultivo líquido. A partir del cultivo líquido, el medio se mezcla directamente con una cantidad igual de glicerol; la colonia debe revisarse para detectar cualquier defecto como mutaciones. Todos los antibióticos deben lavarse del cultivo antes del almacenamiento a largo plazo. Los métodos varían, pero la mezcla puede hacerse suavemente por inversión o rápidamente por vórtice y el enfriamiento puede variar colocando el criotubo directamente a −50 a −95  °C, congelando rápidamente en nitrógeno líquido o enfriando gradualmente y luego almacenando a −80  °C o más frío (nitrógeno líquido o vapor de nitrógeno líquido). La recuperación de bacterias también puede variar; por ejemplo, si las microesferas se almacenan dentro del tubo, se pueden usar las pocas que quedan para sembrar, o bien, se puede raspar el cultivo congelado con un asa y luego sembrarlo. Sin embargo, dado que se necesita poco cultivo, nunca se debe descongelar completamente el tubo y se deben evitar los ciclos repetidos de congelación y descongelación. No es posible lograr una recuperación del 100%, independientemente de la metodología. ^{[ 63 ] [ 64 ] [ 65 ]}

Los nematodos microscópicos Panagrolaimus detritophagus y Plectus parvus, que habitan en el suelo, son los únicos organismos eucariotas que han demostrado ser viables tras ser criopreservados durante muchos años (entre 30.000 y 40.000 años). En este caso, la preservación fue natural, no artificial, debido al permafrost . Revivieron al ser calentados.

Se ha demostrado que varias especies animales, incluyendo peces, anfibios y reptiles, toleran la congelación. Al menos cuatro especies de ranas ( Pseudacris crucifer , Hyla versicolor , Pseudacris triseriata , Lithobates sylvaticus ) y varias especies de tortugas ( Terrapene carolina , crías de Chrysemys picta ), lagartos y serpientes toleran la congelación y han desarrollado adaptaciones para sobrevivir a ella. Si bien algunas ranas hibernan bajo tierra o en el agua, sus temperaturas corporales descienden hasta -5 a -7  °C, lo que provoca su congelación. La rana de bosque ( Lithobates sylvaticus ) puede soportar congelaciones repetidas, durante las cuales aproximadamente el 65 % de su fluido extracelular se convierte en hielo. ^{[ 62 ]}

Se ha reanimado a ratas a partir de temperaturas cercanas a 0 (pero no congeladas). ^{[ 66 ]}