Ácido lactobacílico

El ácido lactobacílico , cuyo nombre científico es ácido 10-(2-hexilciclopropil) decanoico, es un compuesto químico natural del grupo de los ácidos grasos . Sus sales se denominan lactobacilos. Una característica especial es el anillo de ciclopropano en la cadena carbonada . El ácido lactobacílico, con 19 átomos de carbono , es un ácido graso con un número impar de átomos de carbono.

El ácido graso fue detectado en la década de 1950 en bacterias del género Lactobacillus , pero también se encuentra en muchas otras especies bacterianas. La biosíntesis bacteriana del ácido lactobacílico tiene lugar a partir del ácido cis - vacénico ( ácido cis -11-octadecenoico), un ácido graso insaturado que tiene un átomo de carbono menos. Las bacterias en un cultivo discontinuo forman el ácido graso al final de la fase exponencial de crecimiento o en la fase temprana de crecimiento estacionario. Estudios previos han demostrado que la biosíntesis y el almacenamiento del ácido lactobacílico en la membrana celular está asociada con un efecto protector para las células bacterianas , aunque el mecanismo exacto no se ha aclarado de manera concluyente. En bacteriología , el ácido graso se utiliza principalmente con fines analíticos, por ejemplo en la identificación de bacterias.

En los años 50, un grupo de trabajo de la Universidad de Pittsburgh realizó una investigación sobre bacterias del género Lactobacillus , que necesitan biotina como factor de crecimiento. Ya se había demostrado que la biotina ya no es necesaria para el crecimiento de las bacterias si en el medio de cultivo están presentes determinados ácidos grasos . Al investigar la influencia de la biotina en el metabolismo de los ácidos grasos , los investigadores se centraron inicialmente en la especie L. arabinosus , que según la sistemática actual se clasifica como L. plantarum ^[1] . Cultivaron las bacterias en un medio de cultivo semisintético , recolectaron las células y extrajeron los lípidos "libres" con acetona y éter dietílico . Esta fracción constituye aproximadamente el 20% de los lípidos totales. Para obtener los lípidos "ligados", se realizó a continuación una hidrólisis ácida , en la que se liberaron los ácidos grasos ligados como ésteres y también se extrajeron con éter dietílico. ^[2]

Los ácidos grasos se metilaron con diazometano para formar los ésteres metílicos y se separaron según sus puntos de ebullición mediante destilación fraccionada . Con base en la curva de destilación, se esperaba la presencia de ésteres de ácidos grasos C ₁₆ , C ₁₈ y C ₁₉ . El ácido graso obtenido de la fracción C _{19 mostró un} punto de fusión a 28-29 °C después de la purificación por recristalización . El compuesto se investigó utilizando numerosos métodos físicos y químicos y su fórmula molecular se determinó como C ₁₉ H ₃₆ O ₂ . En 1950, este fue el segundo ácido graso con 19 átomos de carbono en aislarse de microorganismos. Ya en 1929, se descubrió el ácido tuberculoesteárico , fórmula molecular C ₁₉ H ₃₈ O ₂ ), que se aisló del patógeno de la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis . Por analogía con su nombre, los bioquímicos sugirieron el nombre inglés ' ácido lactobacílico' , ya que el ácido graso se originó a partir de una especie de Lactobacillus . ^[2] El ácido lactobacílico también se ha aislado de L. casei . ^[3] En la publicación, los científicos enfatizaron las implicaciones de su descubrimiento, que contradecía la opinión en ese momento de que solo los ácidos grasos con un número par de átomos de carbono ocurren en la naturaleza. ^[4]

Los lípidos "libres" y "ligados" no difieren significativamente en su composición de ácidos grasos. Además del ácido lactobacílico con una participación del 31%, el ácido palmítico (C16:0), el ácido esteárico (C18:0) y el ácido cis - vaccénico (C18:1 cis -11) con una proporción del 37%, 2% y 20% respectivamente. Los resultados de la prueba del ácido graso recién descubierto mostraron que se trata de un ácido graso saturado . Es estable frente a agentes oxidantes que reaccionarían con un doble enlace en la cadena de carbono. Sin embargo, en la reacción con bromuro de hidrógeno (HBr), se produce una adición de HBr en la molécula . También es posible la hidrogenación, lo que da lugar a varios isómeros de ácidos grasos con la fórmula molecular C ₁₉ H ₃₈ O ₂ , uno de los cuales ha sido identificado como ácido nonadecanoico . El otro compuesto es un ácido graso de cadena ramificada con un grupo metilo como ramificación (ácido metiloctadecanoico), aunque los científicos no pudieron distinguir en ese momento si estaban presentes uno o más isómeros del mismo. Con base en los resultados de los métodos químicos y físicos ( espectroscopia infrarroja y difracción de rayos X ) para la elucidación de la estructura , se propuso como estructura un ácido graso saturado con un anillo de ciclopropano en la cadena carbonada. [ ^2]

A partir de sus lípidos, en comparación con los ácidos grasos producidos sintéticamente , pudieron determinar la posición del anillo de ciclopropano y propusieron el nombre de ácido 11,12-metilenoctadecanoico, sin especificar la estereoisomería de la estructura. ^[3]

Visto desde el anillo de ciclopropano, diferentes sustituyentes están presentes en dos átomos de carbono, resultando en cis - trans -isomerismo (ver figura). Los sustituyentes pueden estar en el mismo lado ( cis ) o en diferentes lados ( trans ) del enlace del anillo. Hofmann et al. inicialmente no pudieron aclarar qué estructura estaba realmente presente en el momento del descubrimiento. Sin embargo, en 1954 plantearon la hipótesis de que el isómero cis estaba presente. ^[6] Esto fue confirmado por un grupo de investigación canadiense en 2005. Una descripción clara de la disposición espacial de los sustituyentes es posible con la ayuda de las reglas de prioridad de Cahn-Ingold-Prelog , según las cuales la configuración absoluta de la molécula se da como 11 R ,12 S . ^[7] El nombre derivado ácido (11 R ,12 S )-metilenoctadecanoico se usa comúnmente, ^{[8] [9] [10]} incluso si no corresponde a las recomendaciones de la nomenclatura de la IUPAC . Para la denominación sistemática del ácido lactobacílico, la configuración absoluta se da a partir del anillo de ciclopropano, con un sustituyente C _{6 (grupo hexilo) y un sustituyente C 10} que contiene el grupo carboxi ( ácido decanoico ), dando así ácido 10-[(1 R ,2 S )-2-hexilciclopropil]decanoico ^[11]

Ácido lactobacílico y Lactobacillussäure son traducciones del término inglés ' ácido lactobacílico' , que los científicos propusieron cuando se descubrió este ácido graso (1950) en una especie de Lactobacillus . En la literatura en lengua alemana, el término ácido lactobacílico se utiliza con más frecuencia que ácido lactobacillus. Ya en 1938, otro grupo de investigadores descubrió un ácido graso inusual de la bacteria Agrobacterium tumefaciens (en ese momento llamada Bacterium tumefaciens o Phytomonas tumefaciens ) que se aisló ^[12] y después del nombre genérico como ácido fitomónico . ^[11] Según el conocimiento de los científicos de la época, este ácido graso saturado tenía la fórmula molecular C ₂₀ H ₄₀ O ₂ . La estructura propuesta era un ácido graso de cadena ramificada con un grupo metilo como ramificación, ácido metilnonadecanoico. ^[13] Sin embargo, K. Homann et al. En 1955, se demostró que el compuesto aislado de P. tumefaciens era en realidad ácido lactobacílico. Según ellos, la sustancia investigada originalmente estaba contaminada. ^[14]

Tras el descubrimiento del ácido lactobacílico en los lípidos de Lactobacillus arabinosus , el equipo de Klaus Hofmann también pudo determinar este ácido graso en los lípidos de Lactobacillus casei con un contenido del 16%. ^[3] También está presente en L. acidophilus , L. buchneri , ^[15] L. delbrueckii subsp. bulgaricus , L. delbrueckii subsp. lactis, L. fermentum y L. helveticus con un contenido del 10 al 30%. ^{[16] [15]} Sin embargo, el ácido lactobacílico no está restringido a los miembros del género Lactobacillus o las bacterias del ácido láctico en general. El ácido graso también se encontró en proporciones más altas (10-20%) en bacterias gramnegativas , como Agrobacterium tumefaciens ^[14] y Escherichia coli ^[7] , y en cantidades más pequeñas (5-10%) también en Serratia marcescens , Klebsiella aerogenes y Pseudomonas fluorescens . ^{[17] Las especies} de Brucella también contienen ácido lactobacílico, ^[18] así como las especies de Bordetella , pero el contenido aquí es solo del 1-2% . ^[19]

El ácido lactobacílico se encuentra tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas y se encuentra en géneros estrictamente aerobios , microaerófilos , facultativos y estrictamente anaerobios . géneros. Aunque el ácido graso está ampliamente distribuido en bacterias, no se encuentra en todos los géneros. Las bacterias que no tienen ácidos grasos insaturados en sus lípidos de membrana no tienen ácido lactobacílico. Esto se aplica en particular a las bacterias termófilas y arqueas . Sin embargo, el ácido graso se encuentra bastante raramente en organismos eucariotas . ^[20] Está contenido, por ejemplo, en el aceite de colza , que contiene poco ácido erúcico (las llamadas variedades LEAR). ^[21]

La biosíntesis y aparición del ácido lactobacílico está estrechamente relacionada con el ácido dihidrostercúlico ^[22] (compárese con el ácido estercúlico ), que también es un ácido graso saturado con la fórmula molecular C ₁₉ H ₃₆ O ₂ , que contiene un anillo de ciclopropano. Aquí, sin embargo, el anillo se encuentra en las posiciones 9 y 10 de la cadena carbonada, por lo que también se le conoce como ácido cis -9,10-metilenoctadecanoico. ^[20] El ácido dihidrostercúlico también se encuentra en los lípidos de muchos géneros bacterianos, pero también se ha encontrado en eucariotas, por ejemplo en protozoos del grupo Trypanosomatida , aquí en los géneros Crithidia , Leishmania , Leptomonas , Herpetomonas y Phytomonas . ^[23] Según un estudio publicado en 2014, el ácido lactobacílico y el ácido dihidrostercúlico también se encuentran en la leche de vaca en cantidades muy pequeñas (< 0,1% del total de ácidos grasos), pero no en la leche de cabra o de oveja . ^[24]

El ácido lactobacílico se puede aislar de los lípidos de las bacterias, como lo utilizó el grupo de trabajo durante el descubrimiento. Primero, se lleva a cabo la hidrólisis ( saponificación ) de los fosfolípidos o triglicéridos , liberando el ácido graso unido como un éster. Dado que hay otros ácidos grasos presentes además del ácido lactobacílico, luego se lleva a cabo la separación mediante cristalización por extracción con urea o cromatografía en columna . También se puede utilizar el proceso de cristalización fraccionada . ^[25]

La síntesis química es similar a la biosíntesis, partiendo del compuesto insaturado sin anillo de ciclopropano, el ácido vaccénico . En una reacción de Simmons-Smith , al doble enlace del ácido graso insaturado se le añade un carbeno ; para formar el carbeno se utilizan diyodometano y cinc . La reacción de Simmons-Smith es estereoespecífica , para la preparación del ácido cis -11,12-metilenoctadecenoico (ácido lactobacílico) se utiliza el ácido cis -11-octadecenoico ( ácido cis -vaccenoico). ^[26] Éste puede ser de origen natural o sintetizado a partir del ácido 11-octadécico. ^{[3] [27]}

Los principios básicos de la biosíntesis del ácido lactobacílico ya se aclararon en 1961. ^[29] El ácido lactobacílico, así como otros ácidos grasos de ciclopropano de origen natural (también abreviados como CFA o CPFA) se forman a partir de los correspondientes ácidos grasos insaturados , que tienen un átomo de carbono menos, y tienen una configuración cis en el anillo de ciclopropano. ^[20] El precursor del ácido lactobacílico ( ácido cis -11,12-metilenoctadecanoico) es, por tanto, el ácido cis -vaccénico ( ácido cis -11-octadecenoico). Esto se demostró mediante precursores marcados con el isótopo de carbono ¹⁴ C. ^[29]

Con la ayuda de la enzima sintasa de ácidos grasos del ciclopropano, se añade un grupo metileno al doble enlace del ácido cis -vacénico. El grupo metileno se origina a partir de la S -adenosilmetionina . El ácido graso insaturado no está libre, sino que está unido como un éster dentro de los fosfolípidos . El mecanismo de reacción procede a través de la formación de un carbocatión . La enzima cataliza la reacción solo con ácidos grasos insaturados cuyo doble enlace tiene una configuración cis ; los isómeros trans correspondientes no se convierten. ^[20]

Cuando las bacterias se cultivan en un cultivo discontinuo, la formación de CFA se produce de repente en un momento determinado en lugar de aumentar de forma constante en concentración. Al mismo tiempo, se observa una disminución de la concentración del ácido graso insaturado (como precursor). La formación de ácido graso ciclopropano se produce al final de la fase exponencial de crecimiento o en la fase inicial de crecimiento estacionario. ^[20]

Como el ácido lactobacílico se descubrió en bacterias que requieren biotina como factor de crecimiento, los estudios se llevaron a cabo inicialmente en estas bacterias en la década de 1950. En el caso de Lactobacillus plantarum (entonces L. arabinosus ), L. casei y L. delbrueckii , se encontró que pueden crecer sin biotina si el medio de cultivo contiene ácido lactobacílico. L. acidophilus , para el cual la biotina no es esencial, es promovido en crecimiento por el ácido lactobacílico. ^[6] Ahora se sabe que la biotina es un componente importante de varias enzimas del metabolismo de las grasas , por ejemplo, la acetil-CoA carboxilasa y la propionil-CoA carboxilasa . También se reconoció en ese momento que varios ácidos grasos saturados tienen efectos inhibidores sobre el crecimiento bacteriano, pero que este efecto es neutralizado por el ácido lactobacílico y algunos ácidos grasos insaturados. ^[30] Desde entonces, varios estudios han demostrado que la síntesis de ácido lactobacílico supone una ventaja para que las bacterias correspondientes se adapten a condiciones ambientales desfavorables. Ejemplos de ello son las temperaturas no óptimas o incluso extremas, la caída del valor de pH en el medio o la entrada en la fase estacionaria de crecimiento. ^[31]

La importancia de la síntesis de ácidos grasos de ciclopropano sigue siendo objeto de investigación. Para ello, se examinaron mutantes de Escherichia coli que carecían del gen cfa , que codifica la enzima sintasa de ácidos grasos de ciclopropano . La ausencia de la enzima no tiene ningún efecto negativo sobre el crecimiento y las bacterias no muestran diferencias fenotípicas , con la excepción de que el ácido lactobacílico u otros ácidos ciclopropanoicos no se encuentran entre los ácidos grasos presentes. ^[20] Se llevó a cabo un experimento similar con mutantes producidos artificialmente de Brucella abortus . Las bacterias todavía pueden multiplicarse en macrófagos , por lo que el ácido lactobacílico no tiene ningún efecto sobre el ciclo de vida intracelular. Sin embargo, si las bacterias se cultivan en un medio de cultivo con un valor de pH bajo y una osmolaridad alta , se puede observar un menor crecimiento en comparación con las células no modificadas. Estas condiciones se pueden transferir a la supervivencia de B. abortus en el medio ambiente, donde también puede producirse un entorno ácido con una osmolaridad alta. Los mutantes que no producen ácido lactobacílico tienen menos posibilidades de sobrevivir allí y, en consecuencia, no pueden transferirse a un huésped con tanta facilidad como ocurre, por ejemplo, en el caso de una infección por frotis. El estudio del promotor del gen cfa también muestra que la expresión se ve favorecida por un pH bajo y una osmolaridad alta, es decir, la enzima CFA sintasa se forma en estas condiciones. ^[32]

Desde el punto de vista del metabolismo energético , la formación del anillo de ciclopropano en el ácido lactobacílico supone un gasto energético relativamente elevado para la célula. La S adenosilmetionina, que actúa como portadora del grupo metileno, debe regenerarse a partir de S adenosilhomocisteína. Esto está asociado a la escisión hidrolítica de tres moléculas de ATP por molécula. Por tanto, se supuso que el anillo de ciclopropano sirve como almacén de un grupo metileno activado para permitir posteriores reacciones de metilación. Esto se contradice con el hecho de que el contenido de ácido lactobacílico permanece constante, al menos en E. coli . El tiempo de biosíntesis sugiere que el ácido graso tiene un efecto protector sobre las células bacterianas en la fase estacionaria posterior. Sin embargo, a pesar de la intensa investigación, todavía no ha sido posible aclarar exactamente en qué consiste este efecto protector. ^[20]

La composición de los ácidos grasos en los fosfolípidos de la membrana celular influye en su fluidez . Una sustitución del ácido cis vaccénico por ácido lactobacílico tiene diferentes efectos dependiendo de la posición del glicerol en la que el ácido graso está esterificado en el fosfoglicérido . Dentro del rango de temperatura relevante para la mayoría de los organismos vivos, la incorporación de un ácido graso con un anillo de ciclopropano tiende a significar que un cambio de temperatura no tiene una influencia importante en la fluidez. Por lo tanto, la biomembrana es fluida en un rango de temperatura algo más amplio. Al contrario de lo que sugiere la estructura del ciclopropano, el ácido lactobacílico, unido a los fosfolípidos, es relativamente estable. En comparación con el ácido graso insaturado (como precursor en la biosíntesis), es incluso más estable en relación con agentes oxidantes suaves, como cuando se trata con ozono ( ozonólisis ) o con oxígeno singlete formado fotoquímicamente . Algunos investigadores interpretan esto como que, aunque la incorporación de ácido lactobacílico a la membrana celular no tiene una influencia significativa en las propiedades físicas de la membrana, sí cambia sus propiedades químicas, lo que constituye una ventaja para el organismo. ^[20]

Un ejemplo de un efecto beneficioso del ácido lactobacílico lo proporciona Oenococcus oeni . La bacteria del ácido láctico se utiliza en la producción de vino para convertir el ácido málico en ácido láctico durante la fermentación maloláctica en ácido láctico, que a su vez es convertido en etanol por la levadura de panadería . De esta manera, se reduce la acidez del vino. En el proceso, Oenococcus oeni se expone a concentraciones relativamente altas de etanol producido por levaduras durante la fermentación alcohólica . Los estudios de la membrana celular de la bacteria han demostrado que la tasa de biosíntesis de fosfolípidos aumenta con el aumento de la concentración de etanol en el medio de cultivo circundante. Además, se forma más ácido lactobacílico en los lípidos de la membrana, mientras que el contenido de ácido cis vaccénico disminuye. Esto se interpreta como un mecanismo de protección contra los efectos tóxicos del etanol. La formación de ácido lactobacílico ayuda a la bacteria a adaptarse a condiciones ambientales desfavorables. ^[33] Se descubrió un efecto protector similar en L. delbrueckii subsp. bulgaricus . Muestra una mejor capacidad de supervivencia frente a la liofilización cuando hay más ácido lactobacílico presente en la membrana celular. ^[34]

El efecto probiótico del Lactobacillus reuteri se atribuye a sustancias inmunomoduladoras que inhiben la producción de la citocina TNF ( factor de necrosis tumoral ) en humanos. El examen de los lípidos de membrana de varias cepas de Lactobacillus reuteri muestra que solo las cepas inhibidoras del TNF tienen ácido lactobacílico. En este experimento, el gen cfa también se inactivó en una cepa bacteriana productora de ácido lactobacílico y se cultivaron los mutantes. El sobrenadante se probó en un cultivo celular y, a diferencia del sobrenadante del tipo salvaje, suprime la producción de TNF. Sin embargo, la adición de ácido lactobacílico como sustancia pura no conduce a la inhibición de la producción de citocinas. Por lo tanto, el ácido graso solo está involucrado indirectamente en la actividad inmunomoduladora de L. reuteri ; una fluidez de membrana alterada se cita como una posible explicación. ^[35]

Con el desarrollo de métodos instrumentales para el análisis de ácidos grasos, la detección de diferentes ácidos grasos en bacterias se ha convertido en una característica analítica común desde la década de 1970. Los patrones de ácidos grasos se utilizan a menudo para la clasificación taxonómica , ya que las especies relacionadas a menudo tienen una composición similar de ácidos grasos en los lípidos. ^[36] El patrón de distribución de ácidos grasos se puede utilizar para diferenciar entre especies de Brucella y Bordetella . ^[18] Los resultados de la investigación de 2013 muestran que la aparición de ácido lactobacílico en Brucella canis depende del origen geográfico de las cepas bacterianas e indican que solo las cepas patógenas humanas contienen este ácido graso. ^[9] También se utiliza para distinguir especies de Weissella ^[37] u otras bacterias de ácido láctico ^[38]

La detección así como la determinación cuantitativa del ácido lactobacílico se lleva a cabo - como es habitual para los ácidos grasos - mediante cromatografía de gases del éster metílico, a menudo como cromatografía de gases con acoplamiento de espectrometría de masas (GC/MS). ^[21] Sin embargo, debido al anillo de ciclopropano, se debe tener cuidado de utilizar un reactivo de metilación adecuado. ^[17] No es adecuado, por ejemplo, el cloruro de hidrógeno en metanol anhidro , ya que este reactivo puede reaccionar con el anillo de ciclopropano, dando como resultado un ácido graso de cadena ramificada con un grupo metoxi . Sin embargo, el metanolato de sodio en metanol anhidro es muy adecuado, al igual que el hidróxido de sodio o el hidróxido de potasio en metanol. ^[20] La formación de 3-piridilmetanol (ésteres de picolinilo) con alcohol nicotinílico se recomienda particularmente para la elucidación estructural mediante métodos de espectrometría de masas . (piridilmetanol). ^[22]

• Klaus Hofmann, Robert A. Lucas, Sylvan M. Sax: La naturaleza química de los ácidos grasos de Lactobacillus arabinosus . En: The Journal of Biological Chemistry. Band 195, No. 2, 1952, p. 473–485, PMID 14946156.
• Dennis W. Grogan, John. E. Cronan, Jr. (1997), "Formación de anillos de ciclopropano en lípidos de membrana de bacterias", Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR , vol. 61, no. 4, págs.  429– 441, doi :10.1128/mmbr.61.4.429-441.1997, PMC  232619 , PMID  9409147{{citation}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )