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Articulo de referencia

Edición del genoma

Las diferentes generaciones de endonucleasas de restricción utilizadas para la edición del genoma y las vías de reparación del ADN utilizadas para modificar el ADN objetivo. La ...

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Las diferentes generaciones de endonucleasas de restricción utilizadas para la edición del genoma y las vías de reparación del ADN utilizadas para modificar el ADN objetivo.

La edición del genoma , o ingeniería genómica , o edición genética , es un tipo de ingeniería genética en la que se inserta, elimina, modifica o reemplaza ADN en el genoma de un organismo vivo. A diferencia de las primeras técnicas de ingeniería genética , que insertaban material genético al azar en el genoma del huésped, la edición del genoma dirige las inserciones a ubicaciones específicas.

Las moléculas programables llamadas endonucleasas de restricción , también conocidas como editores genéticos o tijeras moleculares, se utilizan para crear rupturas de doble cadena (DSB) en ubicaciones específicas del genoma. Estas rupturas se reparan mediante recombinación dirigida por homología (HDR) o unión de extremos no homólogos (NHEJ), lo que da lugar a mutaciones dirigidas. [ 1 ] [ 2 ]

El desarrollo de la edición genética CRISPR en 2015 mejoró la eficiencia, la especificidad y la practicidad de la edición genómica a gran escala. [ 3 ]

Uno de los métodos más antiguos y eficientes de edición del geonoma es la edición de bases . [ 4 ] [ 5 ] No requiere la ruptura y recombinación de las cadenas de ADN genómico, evitando así las inserciones y deleciones aleatorias asociadas a estos procedimientos. Sin embargo, solo es apropiado para la edición precisa de nucleótidos individuales . Emplea enzimas modificadoras de nucleobases dirigidas por secuencias guía de ácidos nucleicos. Fue descrito por primera vez en la década de 1990 y ha experimentado un resurgimiento más recientemente. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 4 ]

Desde 2015, la edición del genoma se ha investigado experimentalmente en embriones humanos no viables . [ 9 ] En 2019, nacieron los primeros humanos a partir de embriones editados genéticamente utilizando la técnica CRISPR, como resultado del controvertido caso He Jiankui . [ 10 ]

Historia

La edición del genoma fue pionera en la década de 1990, [ 6 ] antes del advenimiento de las plataformas de edición genética basadas en nucleasas comunes actuales, pero su uso fue limitado por las bajas eficiencias de edición.

En la década de 2000 se introdujo la edición del genoma con nucleasas modificadas (también conocidas como "tijeras moleculares"). A partir de 2011Se utilizaron tres familias de nucleasas modificadas: meganucleasas , nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y nucleasas basadas en efectores tipo activador de la transcripción (TALEN). Todas ellas fueron seleccionadas por Nature Methods como el Método del Año 2011. [ 11 ] En 2015 se introdujo el sistema CRISPR-Cas, [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] y fue seleccionado por Science como el Avance Científico del Año 2015. [ 16 ] Nueve editores de genoma estaban disponibles a partir de 2017 .. [ 17 ]

En 2018, los métodos habituales para dicha edición utilizaban nucleasas modificadas genéticamente para crear rupturas de doble cadena (DSB) en las ubicaciones deseadas del genoma. Las rupturas de doble cadena inducidas se reparan mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la recombinación homóloga (HR), lo que da como resultado mutaciones dirigidas ("ediciones").

En mayo de 2019, abogados en China informaron, a la luz de la supuesta creación por parte del científico chino He Jiankui de los primeros humanos editados genéticamente (véase la controversia de Lulu y Nana ), la redacción de regulaciones que harían responsable a cualquier persona que manipulara el genoma humano mediante técnicas de edición genética, como CRISPR , de cualquier consecuencia adversa relacionada. [ 10 ] Recientemente se ha discutido una perspectiva de precaución sobre los posibles puntos ciegos y riesgos de CRISPR y biotecnologías relacionadas, [ 18 ] centrándose en la naturaleza estocástica de los procesos de control celular.

El Instituto Roslin de la Universidad de Edimburgo desarrolló cerdos resistentes a un virus que causa el síndrome reproductivo y respiratorio porcino , que cuesta a los ganaderos porcinos de EE. UU. y Europa 2600 millones de dólares anuales. [ 19 ]

En febrero de 2020, un ensayo en EE. UU. demostró la seguridad de la edición genética CRISPR en 3 pacientes con cáncer. [ 20 ] En 2020, el tomate Sicilian Rouge High GABA, que produce más de un aminoácido que supuestamente promueve la relajación, fue aprobado para su venta en Japón. [ 19 ]

En 2021, Inglaterra (no el resto del Reino Unido) planeó eliminar las restricciones sobre plantas y animales modificados genéticamente, pasando de una regulación compatible con la Unión Europea a normas más cercanas a las de EE. UU. y otros países. Un informe de la Comisión Europea de abril de 2021 encontró "fuertes indicios" de que el régimen regulatorio actual no era apropiado para la edición genética. [ 19 ] Más adelante en 2021, los investigadores anunciaron una alternativa a CRISPR, denominada proteínas de actividad guiada por elementos móviles obligados (OMEGA), que incluyen IscB, IsrB y TnpB como endonucleasas presentes en transposones y guiadas por pequeños ARN ω. [ 21 ] [ 22 ]

Fondo

La ingeniería genética , como método para introducir nuevos elementos genéticos en los organismos, existe desde la década de 1970. Una desventaja de esta tecnología ha sido la naturaleza aleatoria con la que el ADN se inserta en el genoma del huésped , lo que puede afectar o alterar otros genes dentro del organismo. Sin embargo, se han descubierto varios métodos que dirigen los genes insertados a sitios específicos dentro del genoma de un organismo. [ 6 ] También ha permitido la edición de secuencias específicas dentro de un genoma, así como la reducción de efectos fuera de objetivo. Esto podría utilizarse con fines de investigación, dirigiendo mutaciones a genes específicos, y en terapia génica . Al insertar un gen funcional en un organismo y dirigirlo para reemplazar el defectuoso, podría ser posible curar ciertas enfermedades genéticas .

Modificación genética

Recombinación homóloga

Los primeros métodos para dirigir genes a sitios específicos dentro del genoma de un organismo (denominados direccionamiento genético ) se basaban en la recombinación homóloga (RH). [ 23 ] Al crear construcciones de ADN que contienen una plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de RH dentro de la célula inserten la construcción en la ubicación deseada. El uso de este método en células madre embrionarias condujo al desarrollo de ratones transgénicos con genes específicos inactivados . También ha sido posible insertar genes o alterar los patrones de expresión génica . [ 24 ] En reconocimiento a su descubrimiento de cómo se puede utilizar la recombinación homóloga para introducir modificaciones genéticas en ratones a través de células madre embrionarias, Mario Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2007. [ 25 ]

Segmentación condicional

Si se inactiva un gen vital, puede resultar letal para el organismo. Para estudiar la función de estos genes, se utilizaron recombinasas específicas de sitio (SSR). Los dos tipos más comunes son los sistemas Cre-LoxP y Flp-FRT . La recombinasa Cre es una enzima que elimina el ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de manera similar, con la recombinasa Flip reconociendo secuencias FRT. Al cruzar un organismo que contiene los sitios de recombinasa que flanquean el gen de interés con un organismo que expresa la SSR bajo el control de promotores específicos de tejido , es posible inactivar o activar genes solo en ciertas células. Estas técnicas también se utilizaron para eliminar genes marcadores de animales transgénicos. Modificaciones posteriores de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación solo bajo ciertas condiciones, lo que permitió inactivar o expresar genes en momentos o etapas de desarrollo deseados . [ 24 ]

Proceso

Reparación de rotura de doble hebra

Vías de reparación de roturas de ADN bicatenario y edición del genoma mediante nucleasas CRISPR-Cas.

Una forma común de edición genómica se basa en el concepto de mecanismos de reparación de roturas de doble cadena de ADN (DSB). Existen dos vías principales para reparar las DSB: la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la reparación dirigida por homología (HDR). La NHEJ utiliza diversas enzimas para unir directamente los extremos del ADN, mientras que la HDR, más precisa, utiliza una secuencia homóloga como plantilla para regenerar las secuencias de ADN faltantes en el punto de rotura. Esto se puede aprovechar creando un vector con los elementos genéticos deseados dentro de una secuencia homóloga a las secuencias flanqueantes de una DSB. De esta manera, el cambio deseado se insertará en el sitio de la DSB. Si bien la edición genética basada en HDR es similar a la edición genética basada en recombinación homóloga, la tasa de recombinación aumenta al menos tres órdenes de magnitud. [ 26 ]

Nucleasas modificadas

Grupos de nucleasas modificadas genéticamente. Los colores coincidentes indican patrones de reconocimiento de ADN.

La clave para la edición del genoma reside en crear una ruptura de doble cadena (DSB) en un punto específico del genoma. Las enzimas de restricción de uso común son eficaces para cortar el ADN, pero generalmente reconocen y cortan en múltiples sitios. Para superar este desafío y crear rupturas de doble cadena específicas, hasta la fecha se han descubierto y modificado genéticamente cuatro clases distintas de nucleasas:

  • Meganucleasas
  • Nucleasas de dedos de zinc ( ZFN )
  • Nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción ( TALEN )
  • Sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente ( CRISPR /Cas9).

Meganucleasas

Las meganucleasas , descubiertas a finales de la década de 1980, son enzimas de la familia de las endonucleasas que se caracterizan por su capacidad para reconocer y cortar grandes secuencias de ADN (de 14 a 40 pares de bases). [ 27 ] Las meganucleasas más extendidas y mejor conocidas son las proteínas de la familia LAGLIDADG, que deben su nombre a una secuencia de aminoácidos conservada .

Las meganucleasas, que se encuentran comúnmente en especies microbianas, tienen la propiedad única de poseer secuencias de reconocimiento muy largas (>14 pb), lo que las hace naturalmente muy específicas. [ 28 ] [ 29 ] Sin embargo, prácticamente no hay posibilidad de encontrar la meganucleasa exacta necesaria para actuar sobre una secuencia de ADN específica elegida. Para superar este desafío, se han utilizado métodos de mutagénesis y cribado de alto rendimiento para crear variantes de meganucleasa que reconocen secuencias únicas. [ 29 ] [ 30 ] Otros han logrado fusionar varias meganucleasas y crear enzimas híbridas que reconocen una nueva secuencia. [ 31 ] [ 32 ] Otros han intentado alterar los aminoácidos que interactúan con el ADN de la meganucleasa para diseñar meganucleasas específicas de secuencia en un método denominado meganucleasa de diseño racional. [ 33 ] Otro enfoque implica el uso de modelos computacionales para intentar predecir con la mayor precisión posible la actividad de las meganucleasas modificadas y la especificidad de la secuencia de ácidos nucleicos reconocida. [ 34 ]

Se ha creado un gran banco que contiene decenas de miles de unidades de proteínas. Estas unidades se pueden combinar para obtener meganucleasas quiméricas que reconocen el sitio objetivo, proporcionando así herramientas de investigación y desarrollo que satisfacen una amplia gama de necesidades (investigación fundamental, salud, agricultura, industria, energía, etc.). Esto incluye la producción a escala industrial de dos meganucleasas capaces de escindir el gen humano XPC; las mutaciones en este gen dan lugar a la xerodermia pigmentosa , un trastorno monogénico grave que predispone a los pacientes al cáncer de piel y a quemaduras cuando su piel se expone a los rayos UV. [ 35 ]

Las meganucleasas tienen la ventaja de causar menos toxicidad en las células que métodos como la nucleasa de dedos de zinc (ZFN), probablemente debido a un reconocimiento de secuencia de ADN más estricto; [ 29 ] sin embargo, la construcción de enzimas específicas de secuencia para todas las secuencias posibles es costosa y requiere mucho tiempo, ya que no se aprovechan las posibilidades combinatorias que utilizan métodos como las ZFN y las fusiones basadas en TALEN.

nucleasas de dedos de zinc

A diferencia de las meganucleasas, el concepto detrás de la tecnología ZFN y TALEN se basa en un dominio catalítico de corte de ADN no específico, que luego puede unirse a péptidos de reconocimiento de secuencias de ADN específicas, como dedos de zinc y efectores tipo activador de la transcripción (TALEs). [ 36 ] El primer paso fue encontrar una endonucleasa cuyo sitio de reconocimiento de ADN y sitio de corte estuvieran separados entre sí, una situación que no es la más común entre las enzimas de restricción. [ 36 ] Una vez encontrada esta enzima, se pudo separar su porción de corte, que sería muy inespecífica ya que no tendría capacidad de reconocimiento. Esta porción podría luego unirse a péptidos de reconocimiento de secuencia que podrían conducir a una especificidad muy alta.

Los motivos de dedos de zinc se encuentran en varios factores de transcripción . El ion zinc, presente en el 8% de todas las proteínas humanas, desempeña un papel importante en la organización de su estructura tridimensional. En los factores de transcripción, se localiza con mayor frecuencia en los sitios de interacción proteína-ADN, donde estabiliza el motivo. La parte C-terminal de cada dedo es responsable del reconocimiento específico de la secuencia de ADN.

Las secuencias reconocidas son cortas, compuestas por aproximadamente 3 pares de bases, pero al combinar de 6 a 8 dedos de zinc cuyos sitios de reconocimiento han sido caracterizados, es posible obtener proteínas específicas para secuencias de alrededor de 20 pares de bases. Por lo tanto, es posible controlar la expresión de un gen específico. Se ha demostrado que esta estrategia puede utilizarse para promover un proceso de angiogénesis en animales. [ 37 ] También es posible fusionar una proteína construida de esta manera con el dominio catalítico de una endonucleasa para inducir una ruptura de ADN dirigida y, por lo tanto, utilizar estas proteínas como herramientas de ingeniería genómica. [ 38 ]

El método generalmente adoptado para esto consiste en asociar dos proteínas de unión al ADN —cada una con 3 a 6 dedos de zinc específicamente seleccionados— con el dominio catalítico de la endonucleasa FokI , las cuales deben dimerizarse para escindir el ADN de doble cadena. Las dos proteínas reconocen dos secuencias de ADN separadas por unos pocos nucleótidos. La unión de las dos proteínas de dedos de zinc a sus secuencias respectivas acerca los dos dominios FokI. FokI requiere dimerización para tener actividad nucleasa, lo que significa que la especificidad aumenta drásticamente, ya que cada nucleasa asociada reconocería una secuencia de ADN única. Para potenciar este efecto, se han diseñado nucleasas FokI que solo pueden funcionar como heterodímeros. [ 39 ]

Se utilizan varios enfoques para diseñar nucleasas de dedos de zinc específicas para las secuencias elegidas. El más extendido consiste en combinar unidades de dedos de zinc con especificidades conocidas (ensamblaje modular). Se han desarrollado diversas técnicas de selección, utilizando bacterias, levaduras o células de mamíferos, para identificar las combinaciones que ofrecen la mejor especificidad y la mejor tolerancia celular. Aunque no se ha informado de la caracterización directa a nivel genómico de la actividad de las nucleasas de dedos de zinc, un ensayo que mide el número total de roturas de ADN de doble cadena en células encontró que solo se producen una o dos de dichas roturas por encima del nivel basal en células tratadas con nucleasas de dedos de zinc con un sitio de reconocimiento compuesto de 24 pb y dominios de nucleasa FokI heterodímeros obligados. [ 39 ]

Las nucleasas que funcionan como heterodímeros evitarían la posibilidad de una actividad homodimérica no deseada y, por lo tanto, aumentarían la especificidad de la rotura de doble cadena (DSB). Aunque las porciones de nucleasa de las construcciones ZFN y TALEN tienen propiedades similares, la diferencia entre estas nucleasas modificadas radica en su péptido de reconocimiento de ADN. Las ZFN se basan en dedos de zinc Cys2-His2 y las construcciones TALEN en TALEs. Ambos dominios peptídicos de reconocimiento de ADN se caracterizan por encontrarse de forma natural en combinaciones en sus proteínas. Los dedos de zinc Cys2-His2 suelen aparecer en repeticiones separadas por 3 pb y se encuentran en diversas combinaciones en una variedad de proteínas que interactúan con ácidos nucleicos, como los factores de transcripción . Cada dedo del dominio de dedo de zinc es completamente independiente y la capacidad de unión de un dedo se ve afectada por su vecino. Los TALEs, por otro lado, se encuentran en repeticiones con una relación de reconocimiento uno a uno entre los aminoácidos y los pares de nucleótidos reconocidos. Debido a que tanto los dedos de zinc como los TALEs aparecen en patrones repetidos, se pueden probar diferentes combinaciones para crear una amplia variedad de especificidades de secuencia. [ 28 ] Los dedos de zinc se han establecido más en estos términos y se han utilizado enfoques como el ensamblaje modular (donde los dedos de zinc correlacionados con una secuencia de triplete se unen en una fila para cubrir la secuencia requerida), OPEN (selección de baja rigurosidad de dominios peptídicos frente a nucleótidos de triplete seguida de selecciones de alta rigurosidad de combinación de péptidos frente al objetivo final en sistemas bacterianos) y el cribado bacteriano de un híbrido de bibliotecas de dedos de zinc, entre otros métodos, para hacer nucleasas específicas de sitio.

Las nucleasas de dedos de zinc son herramientas de investigación y desarrollo que ya se han utilizado para modificar diversos genomas, en particular por los laboratorios del Consorcio de Dedos de Zinc. La empresa estadounidense Sangamo BioSciences utiliza nucleasas de dedos de zinc para investigar la ingeniería genética de células madre y la modificación de células inmunitarias con fines terapéuticos. [ 40 ] [ 41 ] Actualmente, los linfocitos T modificados se encuentran en ensayos clínicos de fase I para tratar un tipo de tumor cerebral ( glioblastoma ) y en la lucha contra el SIDA. [ 39 ]

TALEN

Descripción general del proceso TALEN

Las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN) son proteínas específicas de unión al ADN que presentan una serie de repeticiones de 33 o 34 aminoácidos. Las TALEN son enzimas de restricción artificiales diseñadas mediante la fusión del dominio de corte de ADN de una nucleasa con dominios TALE, que pueden diseñarse para reconocer específicamente una secuencia de ADN única. Estas proteínas de fusión sirven como "tijeras de ADN" fácilmente dirigibles para aplicaciones de edición genética que permiten realizar modificaciones genómicas dirigidas, como la inserción, eliminación, reparación y reemplazo de secuencias en células vivas. [ 42 ] Los dominios de unión al ADN, que pueden diseñarse para unirse a cualquier secuencia de ADN deseada, provienen de los efectores TAL , proteínas de unión al ADN excretadas por el patógeno vegetal Xanthomanos app. Los efectores TAL constan de dominios repetidos, cada uno de los cuales contiene una secuencia altamente conservada de 34 aminoácidos, y reconocen un único nucleótido de ADN dentro del sitio diana. La nucleasa puede crear rupturas de doble cadena en el sitio objetivo que pueden repararse mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ), un proceso propenso a errores, lo que resulta en la interrupción de genes mediante la introducción de pequeñas inserciones o deleciones. Cada repetición está conservada, con la excepción de los denominados di-residuos variables de repetición (RVD) en las posiciones de aminoácidos 12 y 13. Los RVD determinan la secuencia de ADN a la que se unirá la TALE. Esta sencilla correspondencia uno a uno entre las repeticiones de la TALE y la secuencia de ADN correspondiente simplifica el proceso de ensamblaje de matrices de repeticiones para reconocer nuevas secuencias de ADN. Estas TALE pueden fusionarse al dominio catalítico de una nucleasa de ADN, FokI, para generar una nucleasa efectora tipo activador de la transcripción (TALEN). Las construcciones TALEN resultantes combinan especificidad y actividad, generando eficazmente nucleasas específicas de secuencia diseñadas que se unen y cortan secuencias de ADN solo en sitios preseleccionados. El sistema de reconocimiento de dianas TALEN se basa en un código fácil de predecir. Las nucleasas TAL son específicas para su diana debido, en parte, a la longitud de su sitio de unión de más de 30 pares de bases . TALEN puede realizarse dentro de un rango de 6 pares de bases de cualquier nucleótido individual en todo el genoma. [ 43 ]

Las construcciones TALEN se utilizan de forma similar a las nucleasas de dedos de zinc diseñadas y tienen tres ventajas en la mutagénesis dirigida: (1) la especificidad de unión al ADN es mayor, (2) los efectos fuera de objetivo son menores y (3) la construcción de dominios de unión al ADN es más fácil.

CRISPR

Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente) son elementos genéticos que las bacterias utilizan como una especie de inmunidad adquirida para protegerse contra los virus. Consisten en secuencias cortas que se originan en genomas virales y se han incorporado al genoma bacteriano. Las proteínas Cas (proteínas asociadas a CRISPR) procesan estas secuencias y cortan las secuencias de ADN viral correspondientes. Al introducir plásmidos que contienen genes Cas y CRISPR diseñados específicamente en células eucariotas , el genoma eucariota puede cortarse en cualquier posición deseada. [ 44 ]

Grandes inserciones genómicas

Las modificaciones de mayor tamaño solían ser ineficientes y propensas a errores, pero los avances recientes permiten realizar modificaciones de mayor tamaño con bastante fiabilidad. Por ejemplo, la estrategia de pegRNA cuádruple (QuadPE) permitió a los investigadores insertar de forma estable grandes fragmentos de ADN en células humanas, de entre 1,6 y 26 kb, con una eficiencia de aproximadamente el 40 %. [ 45 ]

Edición básica

La edición de bases es uno de los métodos más antiguos y eficientes de edición del geonoma. Aunque solo es apropiada para la edición precisa de bases de nucleótidos individuales , es más confiable que la inserción o eliminación de secuencias de nucleótidos, ya que no requiere la ruptura y recombinación de las cadenas de ADN genómico. Por lo tanto, evita las inserciones y deleciones aleatorias asociadas con estos procedimientos. [ 4 ] [ 5 ] Emplea enzimas modificadoras de nucleobases dirigidas por secuencias guía de ácidos nucleicos. Fue descrita por primera vez en la década de 1990, pero ha experimentado un resurgimiento más recientemente. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 4 ]

Arco

ARCUT significa cortador de ADN de restricción artificial, una técnica desarrollada por Makoto Komiyama. Este método utiliza ácido nucleico peptídico pseudocomplementario (pcPNA) para identificar el sitio de corte dentro del cromosoma. Una vez que el pcPNA especifica el sitio, la escisión se lleva a cabo mediante cerio (CE) y EDTA (mezcla química), que realiza la función de empalme. [ 46 ]

Precisión y eficiencia de las nucleasas modificadas

El método de edición genética con meganucleasas es el menos eficiente de los métodos mencionados anteriormente. Debido a la naturaleza de su elemento de unión al ADN y su elemento de corte, se limita a reconocer un objetivo potencial cada 1000 nucleótidos. [ 15 ] Las ZFN se desarrollaron para superar las limitaciones de las meganucleasas. El número de objetivos posibles que las ZFN pueden reconocer se incrementó a uno cada 140 nucleótidos. [ 15 ] Sin embargo, ambos métodos son impredecibles debido a que sus elementos de unión al ADN se afectan mutuamente. Como resultado, se requieren altos niveles de experiencia y procesos de validación largos y costosos.

Las nucleasas TALE, al ser el método más preciso y específico, ofrecen una mayor eficiencia que los dos métodos anteriores. Esta eficiencia se debe a que el elemento de unión al ADN consta de una matriz de subunidades TALE, cada una capaz de reconocer una cadena de nucleótidos de ADN específica de forma independiente, lo que resulta en un mayor número de sitios diana con alta precisión. La creación de nuevas nucleasas TALE requiere aproximadamente una semana y unos cientos de dólares, además de conocimientos especializados en biología molecular e ingeniería de proteínas. [ 15 ]

Las nucleasas CRISPR tienen una precisión ligeramente menor en comparación con las nucleasas TALE. Esto se debe a la necesidad de tener un nucleótido específico en un extremo para producir el ARN guía que CRISPR utiliza para reparar la ruptura de doble cadena que induce. Se ha demostrado que es el método más rápido y económico, con un costo inferior a doscientos dólares y solo unos pocos días de tiempo. [ 15 ] CRISPR también requiere la menor cantidad de experiencia en biología molecular, ya que el diseño reside en el ARN guía en lugar de las proteínas. Una ventaja importante de CRISPR sobre los métodos ZFN y TALEN es que puede dirigirse a diferentes secuencias de ADN utilizando sus sgRNA CRISPR de ~80 nt, mientras que los métodos ZFN y TALEN requerían la construcción y prueba de las proteínas creadas para dirigirse a cada secuencia de ADN. [ 47 ]

Debido a que la actividad fuera del objetivo de una nucleasa activa podría tener consecuencias potencialmente peligrosas a nivel genético y orgánico, la precisión de las meganucleasas, las ZFN, CRISPR y las fusiones basadas en TALEN ha sido un área activa de investigación. Si bien se han reportado cifras variables, las ZFN tienden a tener mayor citotoxicidad que los métodos TALEN o las nucleasas guiadas por ARN, mientras que los enfoques TALEN y guiados por ARN tienden a tener la mayor eficiencia y menos efectos fuera del objetivo. [ 48 ] Con base en la distancia teórica máxima entre la unión al ADN y la actividad de la nucleasa, los enfoques TALEN resultan en la mayor precisión. [ 15 ]

Ingeniería genómica automatizada multiplex (MAGE)

El ADN sintético se introduce repetidamente en múltiples áreas específicas del cromosoma y/o loci, y luego se replica, produciendo células con o sin mutaciones.

Los métodos que utilizaban los científicos e investigadores para estudiar la diversidad genómica y todos los fenotipos asociados eran muy lentos, costosos e ineficientes. Antes de esta nueva revolución, los investigadores tenían que manipular genes individuales y modificar el genoma sección por sección, observar el fenotipo y comenzar de nuevo con otra manipulación genética. [ 49 ] Por lo tanto, los investigadores del Instituto Wyss de la Universidad de Harvard diseñaron MAGE, una tecnología potente que mejora el proceso de edición genómica in vivo. Permite manipulaciones rápidas y eficientes del genoma, todo ello en una máquina lo suficientemente pequeña como para colocarla sobre una mesa de cocina. Estas mutaciones se combinan con la variación que ocurre naturalmente durante la mitosis celular, creando miles de millones de mutaciones celulares.

Combinado químicamente, el ADN monocatenario sintético (ssDNA) y un conjunto de oligonucleótidos se introducen en áreas específicas de la célula, creando así modificaciones genéticas. El proceso cíclico implica la transformación del ssDNA (por electroporación ) seguida del crecimiento celular, durante el cual las proteínas de recombinación homóloga de bacteriófagos median la hibridación del ssDNA con sus dianas genómicas. Los experimentos dirigidos a marcadores fenotípicos selectivos se analizan e identifican mediante el cultivo de las células en medios diferenciales. Cada ciclo requiere finalmente 2,5 horas, además del tiempo necesario para cultivar cultivos isogénicos y caracterizar las mutaciones. Mediante la introducción iterativa de bibliotecas de ssDNA mutagénicos dirigidos a múltiples sitios, MAGE puede generar diversidad genética combinatoria en una población celular. Se pueden realizar hasta 50 ediciones genómicas, desde pares de bases de nucleótidos individuales hasta el genoma completo o redes génicas, simultáneamente, con resultados en cuestión de días. [ 49 ]

Los experimentos MAGE se pueden dividir en tres clases, caracterizadas por distintos grados de escala y complejidad: (i) muchos sitios objetivo, mutaciones genéticas únicas; (ii) un solo sitio objetivo, muchas mutaciones genéticas; y (iii) muchos sitios objetivo, muchas mutaciones genéticas. [ 49 ] Un ejemplo de la clase tres se reflejó en 2009, cuando Church y sus colegas lograron programar Escherichia coli para producir cinco veces la cantidad normal de licopeno, un antioxidante que normalmente se encuentra en las semillas de tomate y que está relacionado con propiedades anticancerígenas. Aplicaron MAGE para optimizar la vía metabólica del 1-desoxi -D -xilulosa 5-fosfato (DXP) en Escherichia coli para sobreproducir licopeno isoprenoide. Les tomó alrededor de 3 días y poco más de $1,000 en materiales. La facilidad, la velocidad y la rentabilidad con la que MAGE puede alterar los genomas pueden transformar la forma en que las industrias abordan la fabricación y producción de compuestos importantes en las industrias de bioingeniería, bioenergía, ingeniería biomédica, biología sintética, farmacéutica, agrícola y química.

Aplicaciones

Genes de plantas, animales y humanos que se modifican con éxito mediante ZFN, lo que demuestra la generalidad de este enfoque.

En 2012, se había desarrollado una edición genómica eficiente para una amplia gama de sistemas experimentales, desde plantas hasta animales, a menudo más allá del interés clínico, y se estaba convirtiendo en una estrategia experimental estándar en los laboratorios de investigación. [ 50 ] La reciente generación de mutantes de rata, pez cebra , maíz y tabaco mediados por ZFN y las mejoras en los enfoques basados ​​en TALEN dan testimonio de la importancia de los métodos, y la lista se está expandiendo rápidamente. La edición genómica con nucleasas modificadas probablemente contribuirá a muchos campos de las ciencias de la vida, desde el estudio de las funciones genéticas en plantas y animales hasta la terapia génica en humanos. Por ejemplo, el campo de la biología sintética , que tiene como objetivo modificar células y organismos para que realicen funciones novedosas, probablemente se beneficiará de la capacidad de las nucleasas modificadas para agregar o eliminar elementos genómicos y, por lo tanto, crear sistemas complejos. [ 50 ] Además, las funciones genéticas se pueden estudiar utilizando células madre con nucleasas modificadas.

A continuación se enumeran algunas tareas específicas que este método puede realizar:

Modificación genética dirigida en animales

La combinación de descubrimientos recientes en ingeniería genética, en particular la edición genética, y las últimas mejoras en las tecnologías de reproducción bovina (por ejemplo, el cultivo de embriones in vitro ) permite la edición del genoma directamente en ovocitos fertilizados mediante endonucleasas sintéticas altamente específicas. Las endonucleasas guiadas por ARN: repeticiones palindrómicas cortas espaciadas regularmente agrupadas asociadas a Cas9 (CRISPR/Cas9) son una nueva herramienta que amplía aún más el abanico de métodos disponibles . En particular, las endonucleasas CRISPR/Cas9 modificadas genéticamente permiten el uso de múltiples ARN guía para la eliminación simultánea de genes (KO) en un solo paso mediante inyección citoplasmática directa (CDI) en cigotos de mamíferos. [ 51 ]

Además, la edición genética puede aplicarse a ciertos tipos de peces en acuicultura, como el salmón del Atlántico. La edición genética en peces se encuentra actualmente en fase experimental, pero las posibilidades incluyen el crecimiento, la resistencia a enfermedades, la esterilidad, la reproducción controlada y el color. La selección de estas características puede contribuir a un entorno más sostenible y a un mayor bienestar para los peces. [ 52 ]

El salmón AquAdvantage es un salmón del Atlántico modificado genéticamente desarrollado por AquaBounty Technologies . El gen regulador de la hormona del crecimiento en el salmón del Atlántico se reemplaza con el gen regulador de la hormona del crecimiento del salmón Chinook del Pacífico y una secuencia promotora del bacalao de océano [ 53 ].

Gracias al desarrollo paralelo de la transcriptómica unicelular , la edición del genoma y los nuevos modelos de células madre, estamos entrando en un período científicamente apasionante donde la genética funcional ya no se limita a modelos animales, sino que puede realizarse directamente en muestras humanas. El análisis de la expresión génica unicelular ha resuelto un mapa transcripcional del desarrollo humano a partir del cual se están identificando genes candidatos clave para estudios funcionales. Utilizando datos de transcriptómica global para guiar la experimentación, la herramienta de edición del genoma basada en CRISPR ha hecho posible interrumpir o eliminar genes clave para dilucidar su función en un contexto humano. [ 54 ]

Modificación genética dirigida en plantas

Descripción general del flujo de trabajo de GEEN y sus posibilidades de edición.

La edición del genoma mediante Meganucleasa , [ 55 ] ZFN y TALEN proporciona una nueva estrategia para la manipulación genética en plantas y es probable que ayude en la ingeniería de rasgos vegetales deseados mediante la modificación de genes endógenos. Por ejemplo, la adición de genes específicos del sitio en las principales especies de cultivos puede utilizarse para el "apilamiento de rasgos", donde varios rasgos deseados se vinculan físicamente para asegurar su cosegregación durante los procesos de mejoramiento. [ 39 ] Recientemente se han reportado avances en tales casos en Arabidopsis thaliana [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] y Zea mays . En Arabidopsis thaliana , utilizando la focalización de genes asistida por ZFN, se introdujeron dos genes de resistencia a herbicidas (acetolactato sintasa de tabaco SuRA y SuRB) en los loci SuR con hasta un 2% de células transformadas con mutaciones. [ 56 ] En Zea mays , la interrupción del locus objetivo se logró mediante DSB inducidas por ZFN y la NHEJ resultante. También se utilizó ZFN para introducir el casete de expresión del gen de tolerancia a herbicidas (PAT) en el locus endógeno objetivo IPK1 en este caso. [ 59 ] Se ha demostrado que dicha modificación del genoma observada en las plantas regeneradas es heredable y se transmitió a la siguiente generación. [ 59 ] Un ejemplo potencialmente exitoso de la aplicación de técnicas de edición del genoma en el mejoramiento de cultivos se puede encontrar en el banano, donde los científicos utilizaron la edición CRISPR/Cas9 para inactivar el virus de la raya del banano endógeno en el genoma B del banano ( Musa spp. ) para superar un desafío importante en el mejoramiento del banano. [ 60 ]

Además, la ingeniería genómica basada en TALEN se ha probado y optimizado ampliamente para su uso en plantas. [ 61 ] Las fusiones TALEN también han sido utilizadas por una empresa estadounidense de ingredientes alimentarios, Calyxt, [ 62 ] para mejorar la calidad de los productos de aceite de soja [ 63 ] y para aumentar el potencial de almacenamiento de las patatas. [ 64 ]

Se necesitan varias optimizaciones para mejorar la edición de genomas vegetales mediante la focalización mediada por ZFN. [ 65 ] Es necesario un diseño fiable y una posterior prueba de las nucleasas, la ausencia de toxicidad de las mismas, la elección adecuada del tejido vegetal para la focalización, las vías de inducción de la actividad enzimática, la ausencia de mutagénesis fuera de objetivo y una detección fiable de los casos mutados. [ 65 ]

Un método común de introducción de CRISPR/Cas9 en plantas es la transformación basada en Agrobacterium . [ 66 ] El T-ADN se introduce directamente en el genoma de la planta mediante un mecanismo T4SS. Los casetes de expresión basados ​​en Cas9 y gRNA se convierten en plásmidos Ti , que se transforman en Agrobacterium para su aplicación en plantas. [ 66 ] Para mejorar la introducción de Cas9 en plantas vivas, se están utilizando virus para una introducción de transgenes más eficaz. [ 66 ]

Investigación

terapia génica

La práctica ideal de terapia génica consiste en reemplazar el gen defectuoso con un alelo normal en su ubicación natural. Esto presenta ventajas sobre la administración viral de genes, ya que no es necesario incluir las secuencias codificantes y reguladoras completas cuando solo se requiere modificar una pequeña parte del gen, como suele ser el caso. [ 67 ] [ 68 ] La expresión de los genes parcialmente reemplazados también es más coherente con la biología celular normal que la de los genes completos transportados por vectores virales.

El primer uso clínico de la edición genómica basada en TALEN se produjo en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda CD19+ en un niño de 11 meses en 2015. Se diseñaron células T de donantes modificadas para atacar las células leucémicas, ser resistentes a Alemtuzumab y evadir la detección por el sistema inmunitario del huésped tras su introducción. [ 69 ] [ 70 ]

Se han realizado extensas investigaciones en células y animales utilizando CRISPR-Cas9 para intentar corregir mutaciones genéticas que causan enfermedades genéticas como el síndrome de Down, la espina bífida, la anencefalia y los síndromes de Turner y Klinefelter. [ 71 ]

En febrero de 2019, científicos médicos que trabajan con Sangamo Therapeutics , con sede en Richmond, California , anunciaron la primera terapia de edición genética humana "in vivo" para alterar permanentemente el ADN , en un paciente con síndrome de Hunter . [ 72 ] Los ensayos clínicos de Sangamo que involucran la edición genética mediante la nucleasa de dedos de zinc (ZFN) están en curso. [ 73 ]

Erradicación de enfermedades

Los investigadores han utilizado sistemas de modificación genética CRISPR-Cas9 para modificar genes asociados con la esterilidad en A. gambiae , el vector de la malaria . [ 74 ] Esta técnica tiene implicaciones adicionales en la erradicación de otras enfermedades transmitidas por vectores, como la fiebre amarilla, el dengue y el Zika. [ 75 ]

El sistema CRISPR-Cas9 puede programarse para modular la población de cualquier especie bacteriana mediante la selección de genotipos clínicos o aislamientos epidemiológicos. Permite potenciar selectivamente las especies bacterianas beneficiosas frente a las dañinas al eliminar los patógenos, lo que le confiere una ventaja sobre los antibióticos de amplio espectro. [ 49 ]

Se están investigando aplicaciones antivirales para terapias dirigidas a virus humanos como el VIH, el herpes y el virus de la hepatitis B. CRISPR se puede utilizar para atacar al virus o al huésped con el fin de interrumpir los genes que codifican las proteínas receptoras de la superficie celular del virus. [ 47 ] En noviembre de 2018, He Jiankui anunció que había editado dos embriones humanos para intentar desactivar el gen CCR5 , que codifica un receptor que el VIH utiliza para entrar en las células. Dijo que las gemelas Lulu y Nana habían nacido unas semanas antes. Afirmó que las niñas aún portaban copias funcionales de CCR5 junto con CCR5 desactivado ( mosaicismo ) y que seguían siendo vulnerables al VIH. El trabajo fue ampliamente condenado por poco ético, peligroso y prematuro. [ 76 ]

En enero de 2019, científicos chinos informaron sobre la creación de cinco monos clonados idénticos mediante edición genética, utilizando la misma técnica de clonación que se empleó con Zhong Zhong y Hua Hua —los primeros monos clonados— y la oveja Dolly , y la misma técnica de edición genética Crispr - Cas9 que supuestamente utilizó He Jiankui para crear a las primeras bebés humanas modificadas genéticamente, Lulu y Nana . Los monos clonados se crearon para estudiar diversas enfermedades. [ 77 ] [ 78 ]

Perspectivas y limitaciones

En el futuro, un objetivo importante de la investigación sobre la edición del genoma con nucleasas modificadas debe ser la mejora de la seguridad y la especificidad de la acción de las nucleasas. [ 79 ] Por ejemplo, mejorar la capacidad de detectar eventos fuera de objetivo puede mejorar nuestra capacidad de aprender formas de prevenirlos. Además, los dedos de zinc utilizados en las ZFN rara vez son completamente específicos, y algunos pueden causar una reacción tóxica. Sin embargo, se ha informado que la toxicidad se reduce mediante modificaciones realizadas en el dominio de escisión de la ZFN. [ 68 ]

Además, la investigación de Dana Carroll sobre la modificación del genoma con nucleasas modificadas ha demostrado la necesidad de comprender mejor la maquinaria básica de recombinación y reparación del ADN. En el futuro, un posible método para identificar objetivos secundarios sería capturar los extremos rotos de las células que expresan las ZFN y secuenciar el ADN flanqueante mediante secuenciación de alto rendimiento. [ 68 ]

Debido a la facilidad de uso y la rentabilidad de CRISPR, actualmente se están realizando numerosas investigaciones al respecto. A pesar de lo reciente del descubrimiento de CRISPR, existen ahora más publicaciones sobre esta tecnología que sobre ZFN y TALEN. [ 47 ] Tanto CRISPR como TALEN son las opciones preferidas para su implementación en producciones a gran escala debido a su precisión y eficiencia.

La edición del genoma también se produce como un proceso natural sin ingeniería genética artificial. Los agentes capaces de editar los códigos genéticos son los virus o los agentes de ARN subvirales.

Aunque el ADN tiene mayor eficiencia que muchos otros métodos en genética inversa, aún no es altamente eficiente; en muchos casos, menos de la mitad de las poblaciones tratadas obtienen los cambios deseados. [ 56 ] Por ejemplo, cuando se planea usar el NHEJ de la célula para crear una mutación, los sistemas HDR de la célula también estarán trabajando corrigiendo la DSB con tasas de mutación más bajas.

Tradicionalmente, los ratones han sido la opción más común para los investigadores como modelo de enfermedad. CRISPR puede ayudar a cerrar la brecha entre este modelo y los ensayos clínicos en humanos mediante la creación de modelos de enfermedad transgénicos en animales más grandes, como cerdos, perros y primates no humanos. [ 80 ] [ 81 ] Utilizando el sistema CRISPR-Cas9, la proteína Cas9 programada y el sgRNA se pueden introducir directamente en cigotos fertilizados para lograr las modificaciones genéticas deseadas al crear modelos transgénicos en roedores. Esto permite omitir la etapa habitual de selección celular en la generación de líneas transgénicas y, como resultado, reduce el tiempo de generación en un 90 %. [ 81 ]

Una de las posibilidades que ofrece CRISPR gracias a su eficacia es la aplicación en xenotrasplantes. En ensayos de investigación previos, CRISPR demostró su capacidad para identificar y eliminar retrovirus endógenos, lo que reduce el riesgo de transmisión de enfermedades y disminuye las barreras inmunitarias. [ 47 ] La ​​eliminación de estos problemas mejora la función del órgano donado, lo que acerca esta aplicación a la realidad.

En las plantas, la edición del genoma se considera una solución viable para la conservación de la biodiversidad. Los sistemas de modificación genética son una herramienta potencial para alterar la tasa reproductiva de las especies invasoras , aunque existen riesgos significativos asociados. [ 82 ]

Mejora humana

Muchos transhumanistas ven la edición del genoma como una herramienta potencial para el mejoramiento humano . [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ] El biólogo australiano y profesor de genética David Andrew Sinclair señala que "las nuevas tecnologías con edición del genoma permitirán que se utilice en individuos (...) para tener (...) hijos más sanos" – bebés de diseño . [ 86 ] Según un informe de septiembre de 2016 del Consejo Nuffield de Bioética, en el futuro podría ser posible mejorar a las personas con genes de otros organismos o genes totalmente sintéticos para, por ejemplo, mejorar la visión nocturna y el sentido del olfato . [ 87 ] [ 88 ] George Church ha compilado una lista de posibles modificaciones genéticas para rasgos posiblemente ventajosos, como una menor necesidad de sueño , cambios relacionados con la cognición que protegen contra la enfermedad de Alzheimer, resistencias a enfermedades y capacidades de aprendizaje mejoradas , junto con algunos de los estudios asociados y posibles efectos negativos. [ 89 ] [ 90 ] 

La Academia Nacional de Ciencias y la Academia Nacional de Medicina de Estados Unidos publicaron un informe en febrero de 2017 que brindaba apoyo condicionado a la edición del genoma humano. [ 91 ] Recomendaron que los ensayos clínicos para la edición del genoma podrían permitirse algún día una vez que se hayan encontrado respuestas a los problemas de seguridad y eficacia, "pero solo para afecciones graves bajo una supervisión estricta". [ 92 ]

Riesgos

En la Evaluación Mundial de Amenazas de 2016 de la Comunidad de Inteligencia de EE. UU., el Director de Inteligencia Nacional de Estados Unidos, James R. Clapper , calificó la edición del genoma como un arma potencial de destrucción masiva , afirmando que la edición del genoma realizada por países con estándares regulatorios o éticos "diferentes a los de los países occidentales" probablemente aumenta el riesgo de la creación de agentes o productos biológicos dañinos. Según la declaración, la amplia distribución, el bajo costo y el ritmo acelerado de desarrollo de esta tecnología, su uso indebido deliberado o no intencional, podrían tener implicaciones económicas y de seguridad nacional de gran alcance. [ 93 ] [ 94 ] [ 95 ] Por ejemplo, tecnologías como CRISPR podrían usarse para crear "mosquitos asesinos", causar plagas que aniquilen cultivos básicos o crear virus altamente letales. [ 95 ]

Según un informe de septiembre de 2016 del Consejo Nuffield de Bioética , la simplicidad y el bajo costo de las herramientas para editar el código genético permitirán a aficionados —o « biohackers » — realizar sus propios experimentos, lo que supone un riesgo potencial por la liberación de insectos genéticamente modificados. El informe también concluyó que los riesgos y beneficios de modificar el genoma de una persona —y que esos cambios se transmitan a las generaciones futuras— son tan complejos que exigen un análisis ético urgente. Dichas modificaciones podrían tener consecuencias imprevistas que podrían perjudicar no solo al niño, sino también a sus futuros hijos, ya que el gen alterado estaría presente en sus espermatozoides u óvulos. [ 87 ] [ 88 ] En 2001, los investigadores australianos Ronald Jackson e Ian Ramshaw fueron criticados por publicar un artículo en el Journal of Virology que exploraba el control potencial de los ratones, una plaga importante en Australia, mediante la infección de estos con un virus de la viruela murina modificado que causaría infertilidad, ya que la información sensible proporcionada podría conducir a la fabricación de armas biológicas por parte de potenciales bioterroristas que podrían usar el conocimiento para crear cepas resistentes a las vacunas de otros virus de la viruela, como la viruela humana , que podrían afectar a los humanos. [ 88 ] [ 96 ] Además, existen preocupaciones adicionales sobre los riesgos ecológicos de liberar impulsos genéticos en poblaciones silvestres. [ 88 ] [ 97 ] [ 98 ]    

Premio Nobel

En 2007, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Mario Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies "por sus descubrimientos de principios para introducir modificaciones genéticas específicas en ratones mediante el uso de células madre embrionarias". [ 25 ]

En 2020, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna por "el desarrollo de un método para la edición del genoma". [ 99 ]

Véase también

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