Transportador ABC

Los transportadores ABC bacterianos son esenciales para la viabilidad celular, la virulencia y la patogenicidad. ^{[ 1 ] [ 4 ]} Los sistemas de captación de hierro ABC, por ejemplo, son importantes efectores de la virulencia. ^{[ 11 ]} Los patógenos utilizan sideróforos , como la enterobactina , para eliminar el hierro que está en complejo con proteínas de unión al hierro de alta afinidad o eritrocitos . Estas son moléculas quelantes de hierro de alta afinidad que son secretadas por bacterias y reabsorben el hierro en complejos hierro-sideróforo. El gen chvE-gguAB en Agrobacterium tumefaciens codifica importadores de glucosa y galactosa que también están asociados con la virulencia. ^{[ 12 ] [ 13 ]} Los transportadores son extremadamente vitales para la supervivencia celular, de modo que funcionan como sistemas proteicos que contrarrestan cualquier cambio indeseable que ocurra en la célula. Por ejemplo, un posible aumento letal de la fuerza osmótica se contrarresta mediante la activación de transportadores ABC osmosensores que median la captación de solutos. ^{[ 14 ]} Además de funcionar en el transporte, algunas proteínas ABC bacterianas también participan en la regulación de varios procesos fisiológicos. ^{[ 4 ]}

En los sistemas de eflujo bacteriano, ciertas sustancias que deben ser expulsadas de la célula incluyen componentes de la superficie de la célula bacteriana (p. ej., polisacáridos capsulares, lipopolisacáridos y ácido teicoico ), proteínas involucradas en la patogénesis bacteriana (p. ej. , hemólisis , proteína de unión al hemo y proteasa alcalina ), hemo, enzimas hidrolíticas , proteínas de la capa S, factores de competencia, toxinas , antibióticos , bacteriocinas , antibióticos peptídicos , fármacos y sideróforos. ^{[ 15 ]} También desempeñan funciones importantes en las vías biosintéticas, incluyendo la biosíntesis de polisacáridos extracelulares ^{[ 16 ]} y la biogénesis del citocromo . ^{[ 17 ]}

Aunque la mayoría de los transportadores ABC eucariotas son de eflujo, algunos no participan directamente en el transporte de sustratos. En el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística ( CFTR ) y en el receptor de sulfonilurea (SUR), la hidrólisis de ATP está asociada con la regulación de la apertura y el cierre de los canales iónicos transportados por la propia proteína ABC u otras proteínas. ^{[ 5 ]}

Los transportadores ABC humanos están involucrados en varias enfermedades que surgen de polimorfismos en genes ABC y raramente debido a la pérdida completa de función de proteínas ABC individuales. ^{[ 18 ]} Estas enfermedades incluyen enfermedades mendelianas y trastornos genéticos complejos como fibrosis quística, adrenoleucodistrofia , enfermedad de Stargardt , enfermedad de Tangier , inmunodeficiencias, colestasis intrahepática familiar progresiva , síndrome de Dubin-Johnson , pseudoxantoma elástico , hipoglucemia hiperinsulinémica persistente de la infancia debido a hiperplasia adenomatosa focal, sideroblastosis y anemia ligadas al cromosoma X , degeneración macular relacionada con la edad , hipoapoproteinemia familiar, retinosis pigmentaria, distrofia de conos y bastones , y otras. ^{[ 5 ]} La familia humana ABCB (MDR/TAP) es responsable de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) frente a una variedad de fármacos estructuralmente no relacionados. La glicoproteína P ABCB1 o MDR1 también participa en otros procesos biológicos cuya función principal es el transporte de lípidos. Se ha descubierto que media la secreción del esteroide aldosterona por las glándulas suprarrenales, y su inhibición bloqueó la migración de células inmunitarias dendríticas , ^{[ 19 ]} posiblemente relacionado con el transporte hacia el exterior del factor activador de plaquetas (PAF) lipídico. También se ha informado que ABCB1 media el transporte de cortisol y dexametasona , pero no de progesterona en células transfectadas con ABCB1. MDR1 también puede transportar colesterol , análogos de cadena corta y larga de fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), esfingomielina (SM) y glucosilceramida (GlcCer). El transporte multiespecífico de diversos lípidos endógenos a través del transportador MDR1 puede afectar la distribución transmembrana de los lípidos, en particular de especies que normalmente predominan en la capa interna de la membrana plasmática, como PS y PE. ^{[ 18 ]}

Más recientemente, se ha demostrado la existencia de transportadores ABC en la placenta , lo que indica que podrían desempeñar un papel protector para el feto en desarrollo contra los xenobióticos . ^{[ 20 ]} La evidencia ha demostrado que la expresión placentaria de los transportadores ABC P-glicoproteína (P-gp) y proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) está aumentada en placentas pretérmino en comparación con placentas a término, con una mayor expresión de P-gp en embarazos pretérmino con corioamnionitis. ^{[ 21 ]} En menor medida, el aumento del IMC materno también se asoció con una mayor expresión de transportadores ABC placentarios, pero solo en embarazos pretérmino. ^{[ 21 ]}

La mayoría de los transportadores poseen dominios transmembrana que constan de un total de 12 hélices α, con 6 hélices α por monómero. Dado que los dominios transmembrana (TMD) presentan una gran diversidad estructural, algunos transportadores tienen un número variable de hélices (entre seis y once). Los dominios transmembrana se clasifican en tres conjuntos distintos de plegamientos: importadores ABC de tipo I , importadores ABC de tipo II y exportadores ABC . La clasificación de los plegamientos importadores se basa en la caracterización detallada de las secuencias. ^{[ 23 ]}

El pliegue importador ABC de tipo I se observó originalmente en la subunidad TM ModB del transportador de molibdato . ^{[ 27 ]} Este pliegue diagnóstico también se puede encontrar en las subunidades TM MalF y MalG de MalFGK ₂ ^{[ 28 ]} y en el transportador MetI. ^{[ 29 ]} En el transportador MetI, un conjunto mínimo de 5 hélices transmembrana constituyen este pliegue, mientras que una hélice adicional está presente tanto para ModB como para MalG. La organización común del pliegue es la topología "arriba-abajo" de las hélices TM2-5 que recubren la vía de translocación y la hélice TM1 que envuelve la superficie externa, orientada hacia la membrana, y contacta con las otras hélices TM.

El pliegue del importador ABC de tipo II se observa en el dominio de la hélice TM de BtuCD ^{[ 24 ]} y en Hi1471 ^{[ 30 ]} , un transportador homólogo de Haemophilus influenzae . En BtuCD, el empaquetamiento de las hélices es complejo. El patrón notable es que la hélice TM2 se posiciona a través del centro de la subunidad, donde está rodeada muy cerca por las otras hélices. Mientras tanto, las hélices TM5 y TM10 se posicionan en la interfaz TMD. La región transmembrana de los exportadores ABC está organizada en dos "alas" que están compuestas por las hélices TM1 y TM2 de una subunidad y TM3-6 de la otra, en una disposición de intercambio de dominios. Un patrón prominente es que las hélices TM1-3 están relacionadas con TM4-6 por una rotación aproximada de dos veces alrededor de un eje en el plano de la membrana ^{[ 23 ] .}

El pliegue exportador se observa originalmente en la estructura de Sav1866. Contiene 12 hélices TM, 6 por monómero. ^{[ 23 ]}

El dominio ABC consta de dos dominios: el dominio central catalítico, similar a las ATPasas motoras tipo RecA , y un subdominio α-helicoidal más pequeño y estructuralmente diverso , exclusivo de los transportadores ABC. El dominio más grande suele constar de dos láminas β y seis hélices α, donde se ubican el motivo catalítico Walker A (GXXGXGKS/T, donde X es cualquier aminoácido) o bucle P , y el motivo Walker B (ΦΦΦΦD, donde Φ es un residuo hidrofóbico). El dominio helicoidal consta de tres o cuatro hélices y el motivo característico de ABC , también conocido como motivo LSGGQ , péptido enlazador o motivo C. El dominio ABC también presenta un residuo de glutamina en un bucle flexible denominado bucle Q , tapa o interruptor de γ-fosfato, que conecta el TMD y el ABC. Se presume que el bucle Q participa en la interacción del NBD y el TMD, particularmente en el acoplamiento de la hidrólisis de nucleótidos a los cambios conformacionales del TMD durante la translocación del sustrato. El motivo H o región de conmutación contiene un residuo de histidina altamente conservado que también es importante en la interacción del dominio ABC con el ATP. El nombre casete de unión a ATP deriva de la disposición característica de los pliegues o motivos de esta clase de proteínas tras la formación del sándwich de ATP y la hidrólisis de ATP. ^{[ 4 ] [ 15 ] [ 23 ]}

La formación de dímeros de los dos dominios ABC de los transportadores requiere la unión de ATP. ^{[ 31 ]} Generalmente se observa que el estado unido a ATP está asociado con la interfaz más extensa entre los dominios ABC, mientras que las estructuras de los transportadores libres de nucleótidos exhiben conformaciones con mayores separaciones entre los dominios ABC. ^{[ 23 ]} Se han reportado estructuras del estado unido a ATP de NBD aislados para importadores que incluyen HisP, ^{[ 32 ]} GlcV, ^{[ 33 ]} MJ1267, ^{[ 34 ]} E. coli MalK (EcMalK), ^{[ 35 ]} T. litoralis MalK (TlMalK), ^{[ 36 ]} y exportadores como TAP, ^{[ 37 ]} HlyB, ^{[ 38 ]} MJ0796, ^{[ 39 ] [ 40 ]} Sav1866, ^{[ 26 ]} y MsbA. ^{[ 41 ]} En estos transportadores, el ATP se une al dominio ABC. Dos moléculas de ATP se posicionan en la interfaz del dímero, intercaladas entre el motivo Walker A de una subunidad y el motivo LSGGQ de la otra. ^{[ 23 ]} Esto se observó por primera vez en Rad50 ^{[ 42 ]} y se informó en estructuras de MJ0796, la subunidad NBD del transportador LolD de Methanococcus jannaschii ^{[ 40 ]} y EcMalK de un transportador de maltosa. ^{[ 35 ]} Estas estructuras también fueron consistentes con los resultados de estudios bioquímicos que revelaron que el ATP está en contacto cercano con residuos en el bucle P y el motivo LSGGQ durante la catálisis . ^{[ 43 ]}

La unión de nucleótidos es necesaria para asegurar la integridad electrostática y/o estructural del sitio activo y contribuir a la formación de un dímero NBD activo. ^{[ 44 ]} La unión de ATP se estabiliza mediante las siguientes interacciones: (1) interacción de apilamiento de anillos de un residuo aromático conservado que precede al motivo Walker A y el anillo de adenosina del ATP, ^{[ 45 ] [ 46 ]} (2) enlaces de hidrógeno entre un residuo de lisina conservado en el motivo Walker A y los átomos de oxígeno de los fosfatos β y γ del ATP y coordinación de estos fosfatos y algunos residuos en el motivo Walker A con el ion Mg ²⁺ , ^{[ 33 ] [ 37 ]} y (3) coordinación del fosfato γ con la cadena lateral de la serina y los grupos amida del esqueleto de los residuos de glicina en el motivo LSGGQ. ^{[ 47 ]} Además, un residuo que sugiere el acoplamiento estrecho de la unión del ATP y la dimerización es la histidina conservada en el bucle H. Esta histidina contacta con residuos a través de la interfaz del dímero en el motivo Walker A y el bucle D, una secuencia conservada que sigue al motivo Walker B. ^{[ 35 ] [ 40 ] [ 42 ] [ 48 ]}

La hidrólisis enzimática del ATP requiere la unión adecuada de los fosfatos y el posicionamiento del fosfato γ al agua atacante. ^{[ 23 ]} En el sitio de unión de nucleótidos, los átomos de oxígeno de los fosfatos β y γ del ATP están estabilizados por residuos en el motivo Walker A ^{[ 49 ] [ 50 ]} y se coordinan con Mg ²⁺ . ^{[ 23 ]} Este ion Mg ²⁺ también se coordina con el residuo de aspartato terminal en el motivo Walker B a través del H ₂ O atacante. ^{[ 33 ] [ 34 ] [ 39 ]} Se ha descubierto que una base general, que puede ser el residuo de glutamato adyacente al motivo Walker B, ^{[ 31 ] [ 40 ] [ 46 ]} glutamina en el bucle Q, ^{[ 30 ] [ 36 ] [ 40 ]} o una histidina en la región de conmutación que forma un enlace de hidrógeno con el γ-fosfato del ATP, cataliza la velocidad de hidrólisis del ATP al promover el H ₂ O atacante. ^{[ 35 ] [ 36 ] [ 40 ] [ 48 ]} El mecanismo molecular preciso de la hidrólisis del ATP sigue siendo controvertido. ^{[ 4 ]}

BtuCD e HI1470/1 se clasifican como transportadores ABC grandes (tipo II). La subunidad transmembrana del transportador de vitamina B12 _, BtuCD, contiene 10 hélices transmembrana (TM) y la unidad funcional consta de dos copias del dominio de unión a nucleótidos (NBD) y del dominio transmembrana (TMD). El TMD y el NBD interactúan entre sí a través del bucle citoplasmático entre dos hélices TM y el bucle Q en el ABC. En ausencia de nucleótidos, los dos dominios ABC se pliegan y la interfaz del dímero queda abierta. Una comparación de las estructuras con (BtuCDF) y sin (BtuCD) proteína de unión revela que BtuCD tiene una abertura que mira hacia el periplasma, mientras que en BtuCDF, la conformación orientada hacia el exterior está cerrada a ambos lados de la membrana. Las estructuras de BtuCD y su homólogo, HI1470/1, representan dos estados conformacionales diferentes de un transportador ABC. La vía de translocación predicha en BtuCD está abierta al periplasma y cerrada en el lado citoplasmático de la membrana, mientras que la de HI1470/1 se orienta en la dirección opuesta y está abierta solo al citoplasma. La diferencia en las estructuras es una torsión de 9° de una subunidad TM con respecto a la otra. ^{[ 4 ] [ 23 ] [ 54 ]}

Las estructuras de ModBC-A y MalFGK ₂ -E, que se encuentran en complejo con su proteína de unión, corresponden a pequeños transportadores ABC (tipo I). Los dominios transmembrana (TMD) de ModBC-A y MalFGK ₂ -E tienen solo seis hélices por subunidad. El homodímero de ModBC-A se encuentra en una conformación en la que las subunidades transmembrana (ModB) se orientan en forma de V invertida con una cavidad accesible al citoplasma. Las subunidades ABC (ModC), por otro lado, están dispuestas en una conformación abierta, sin nucleótidos, en la que el bucle P de una subunidad mira hacia el motivo LSGGQ de la otra, pero está separado de él. La proteína de unión ModA se encuentra en una conformación cerrada con el sustrato unido en una hendidura entre sus dos lóbulos y unido a los bucles extracelulares de ModB, donde el sustrato se sitúa directamente sobre la entrada cerrada del transportador. La estructura de MalFGK _{2 -E se asemeja al} estado de transición catalítico para la hidrólisis de ATP. Se encuentra en una conformación cerrada donde contiene dos moléculas de ATP, intercaladas entre los motivos Walker A y B de una subunidad y el motivo LSGGQ de la otra subunidad. La proteína de unión a maltosa (MBP o MalE) se acopla al lado periplásmico de las subunidades TM (MalF y MalG) y se puede encontrar una gran cavidad ocluida en la interfaz de MalF y MalG. La disposición de las hélices TM se encuentra en una conformación cerrada hacia el citoplasma, pero con una abertura que mira hacia el exterior. La estructura sugiere la posibilidad de que la MBP pueda estimular la actividad ATPasa del transportador al unirse. ^{[ 4 ] [ 23 ] [ 54 ]}

El mecanismo de transporte de los importadores respalda el modelo de acceso alternante. El estado de reposo de los importadores es interno, donde la interfaz del dímero del dominio de unión de nucleótidos (NBD) se mantiene abierta por los dominios transmembrana (TMD) y orientada hacia el exterior, pero ocluida del citoplasma. Tras el acoplamiento de la proteína de unión cerrada y cargada con sustrato hacia el lado periplásmico de los dominios transmembrana, el ATP se une y el dímero NBD se cierra. Esto cambia el estado de reposo del transportador a una conformación orientada hacia el exterior, en la que los TMD se han reorientado para recibir el sustrato de la proteína de unión. Después de la hidrólisis del ATP, el dímero NBD se abre y el sustrato se libera al citoplasma. La liberación de ADP y Pi _revierte el transportador a su estado de reposo. La única inconsistencia de este mecanismo con el modelo de cambio de ATP es que la conformación en su estado de reposo, libre de nucleótidos, es diferente de la conformación orientada hacia el exterior esperada. Aunque así sea, el punto clave es que el NBD no se dimeriza a menos que el ATP y la proteína de unión estén unidos al transportador. ^{[ 4 ] [ 15 ] [ 23 ] [ 52 ] [ 54 ]}

La glicoproteína P (3.A.1.201.1) es una proteína bien estudiada asociada con la resistencia a múltiples fármacos. Pertenece a la familia humana ABCB (MDR/TAP) y también se conoce como ABCB1 o MDR1 Pgp . MDR1 consta de un monómero funcional con dos dominios transmembrana (TMD) y dos dominios de unión a nucleótidos (NBD). Esta proteína puede transportar principalmente sustratos catiónicos o eléctricamente neutros, así como un amplio espectro de sustratos anfifílicos. La estructura del monómero ABCB1 de tamaño completo se obtuvo en presencia y ausencia de nucleótido mediante criocristalografía electrónica . Sin el nucleótido, los TMD son aproximadamente paralelos y forman un barril que rodea un poro central, con la abertura orientada hacia el lado extracelular de la membrana y cerrada en la cara intracelular. En presencia del análogo de ATP no hidrolizable, AMP-PNP, los TMD experimentan una reorganización sustancial con tres dominios claramente segregados. Un poro central, que se encuentra entre los dominios transmembrana (TMD), está ligeramente abierto hacia la cara intracelular con un espacio entre dos dominios que permite el acceso del sustrato desde la fase lipídica. El considerable reempaquetamiento y la posible rotación de las hélices transmembrana tras la unión del nucleótido sugieren un modelo de rotación de hélice para el mecanismo de transporte. ^{[ 18 ]}

El genoma de la planta modelo Arabidopsis thaliana es capaz de codificar 120 proteínas ABC en comparación con las 50-70 proteínas ABC que codifican el genoma humano y las moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ). Las proteínas ABC de las plantas se clasifican en 13 subfamilias según su tamaño (completo, medio o cuarto), orientación y similitud general de la secuencia de aminoácidos. ^{[ 67 ]} Los homólogos de resistencia a múltiples fármacos (MDR), también conocidos como glicoproteínas P, representan la subfamilia más grande en plantas con 22 miembros y la segunda subfamilia ABC más grande en general. La subfamilia B de transportadores ABC de plantas (ABCB) se caracteriza por su localización en la membrana plasmática. ^{[ 68 ]} Los transportadores ABCB de plantas se caracterizan expresándolos heterólogamente en Escherichia coli , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe (levadura de fisión) y células HeLa para determinar la especificidad del sustrato. Se ha demostrado que los transportadores ABCB de las plantas transportan la fitohormona ácido indol-3-acético (IAA), ^{[ 69 ]} también conocida como auxina , el regulador esencial para el crecimiento y desarrollo de las plantas. ^{[ 70 ] [ 71 ]} El transporte polar direccional de auxina media las respuestas ambientales de las plantas a través de procesos como el fototropismo y el gravitropismo. ^{[ 72 ]} Dos de los transportadores de auxina mejor estudiados, ABCB1 y ABCB19, se han caracterizado como exportadores primarios de auxina. ^{[ 70 ]} Otros transportadores ABCB, como ABCB4, participan tanto en la exportación como en la importación de auxina. ^{[ 70 ]} A bajas concentraciones intracelulares de auxina, ABCB4 importa auxina hasta que alcanza un cierto umbral, momento en el que invierte su función para exportar únicamente auxina. ^{[ 70 ] [ 73 ]}

La primera estructura de alta resolución reportada para un exportador ABC fue la de Sav1866 (3.A.1.106.2) de Staphylococcus aureus . ^{[ 18 ] [ 74 ]} Sav1866 es un homólogo de los transportadores ABC de múltiples fármacos. Muestra una similitud de secuencia significativa con los transportadores ABC humanos de la subfamilia B que incluye MDR1 y TAP1/TAP2. Se sabe que la actividad ATPasa de Sav1866 es estimulada por fármacos contra el cáncer como la doxorrubicina , la vinblastina y otros, ^{[ 75 ]} lo que sugiere una especificidad de sustrato similar a la de la glicoproteína P y, por lo tanto, un posible mecanismo común de translocación de sustrato. Sav1866 es un homodímero de semitransportadores, y cada subunidad contiene un TMD N-terminal con seis hélices y un NBD C-terminal. Los NBD son similares en estructura a los de otros transportadores ABC, en los que los dos sitios de unión de ATP se forman en la interfaz del dímero entre el motivo Walker A de un NBD y el motivo LSGGQ del otro. La estructura de Sav1866 unida a ADP muestra los NBD en un dímero cerrado y las hélices TM divididas en dos "alas" orientadas hacia el periplasma, formando la conformación orientada hacia el exterior. Cada ala consta de las hélices TM1-2 de una subunidad y TM3-6 de la otra subunidad. Contiene largos bucles intracelulares (ICL o ICD) que conectan los TMD que se extienden más allá de la bicapa lipídica hacia el citoplasma e interactúan con el 8=D. Mientras que los importadores contienen una hélice de acoplamiento corta que contacta con un solo NBD, Sav1866 tiene dos hélices de acoplamiento intracelulares, una (ICL1) contacta con los NBD de ambas subunidades y la otra (ICL2) interactúa solo con la subunidad NBD opuesta. ^{[ 23 ] [ 26 ] [ 54 ]}

MsbA (3.A.1.106.1) es un transportador ABC multirresistente (MDR) y posiblemente una flipasa de lípidos . Es una ATPasa que transporta lípido A , la porción hidrofóbica del lipopolisacárido (LPS), un sacarolípido basado en glucosamina que constituye la monocapa externa de las membranas externas de la mayoría de las bacterias gramnegativas. El lípido A es una endotoxina , por lo que la pérdida de MsbA de la membrana celular o las mutaciones que alteran el transporte dan como resultado la acumulación de lípido A en la membrana celular interna, lo que provoca la muerte celular. Es un homólogo bacteriano cercano de la glicoproteína P (Pgp) por homología de secuencia de proteínas y tiene especificidades de sustrato superpuestas con el transportador MDR-ABC LmrA de Lactococcus lactis . ^{[ 76 ]} MsbA de E. coli es un 36% idéntico a la mitad NH ₂ -terminal de MDR1 humano, lo que sugiere un mecanismo común para el transporte de sustratos anfipáticos e hidrofóbicos. El gen MsbA codifica un hemitransportador que contiene un dominio transmembrana (TMD) fusionado con un dominio de unión a nucleótidos (NBD). Se ensambla como un homodímero con una masa molecular total de 129,2 kD. MsbA contiene 6 TMD en el lado periplásmico, un NBD ubicado en el lado citoplasmático de la membrana celular y un dominio intracelular (ICD), que une el TMD y el NBD. Esta hélice conservada que se extiende desde los segmentos TMD hacia o cerca del sitio activo del NBD es en gran parte responsable de la interacción entre TMD y NBD. En particular, ICD1 sirve como un pivote conservado alrededor del cual el NBD puede rotar, por lo tanto, permitiendo que el NBD se disocie y dimerice durante la unión e hidrólisis de ATP. ^{[ 4 ] [ 15 ] [ 18 ] [ 23 ] [ 44 ] [ 54 ] [ 55 ] [ 77 ]}

Las estructuras de rayos X de MsbA publicadas anteriormente (y ahora retractadas) eran inconsistentes con el homólogo bacteriano Sav1866. ^{[ 78 ] [ 79 ]} Las estructuras fueron reexaminadas y se encontró un error en la asignación de la mano que resultó en modelos incorrectos de MsbA. Recientemente, los errores han sido rectificados y se han informado nuevas estructuras. ^{[ 41 ]} El estado de reposo de MsbA de E. coli exhibe una forma de "V" invertida con una cámara accesible al interior del transportador, lo que sugiere una conformación abierta y orientada hacia adentro . Los contactos del dímero se concentran entre los bucles extracelulares y, mientras que los NBD están separados por ≈50 Å, las subunidades están enfrentadas. La distancia entre los residuos en el sitio de la interfaz del dímero ha sido verificada mediante experimentos de reticulación ^{[ 80 ]} y estudios de espectroscopia EPR . ^{[ 81 ]} La cámara relativamente grande le permite acomodar grandes grupos de cabeza como el presente en el lípido A. Se requieren cambios conformacionales significativos para mover los grandes grupos de cabeza de azúcar a través de la membrana. La diferencia entre las dos estructuras libres de nucleótidos (apo) es el pivote de ≈30° de las hélices TM4/TM5 con respecto a las hélices TM3/TM6. En el estado apo cerrado (de V. cholerae MsbA), los NBD están alineados y aunque más cerca, no han formado un sándwich de ATP, y los bucles P de los monómeros opuestos están posicionados uno al lado del otro. En comparación con la conformación abierta, la interfaz del dímero de los TMD en la conformación cerrada, orientada hacia adentro tiene contactos extensos. Para ambas conformaciones apo de MsbA, la abertura de la cámara está orientada hacia adentro. La estructura de MsbA-AMP-PNP (5'-adenilil-β-γ-imidodifosfato), obtenida de S. typhimurium , es similar a Sav1866. Los NBD en esta conformación unida al nucleótido y orientada hacia afuera , se unen para formar un sándwich de dímero de ATP canónico, es decir, el nucleótido se sitúa entre el bucle P y el motivo LSGGQ. La transición conformacional de MsbA-cerrado-apo a MsbA-AMP-PNP implica dos pasos, que probablemente sean concertados: un pivote de ≈10° de las hélices TM4/TM5 hacia TM3/TM6, acercando los NBD pero sin alinearlos, seguido de una inclinación de las hélices TM4/TM5 de ≈20° fuera del plano. El movimiento de torsión provoca la separación de las hélices TM3/TM6 de las TM1/TM2, lo que conlleva un cambio de una conformación orientada hacia el interior a una orientada hacia el exterior. De este modo, las modificaciones tanto en la orientación como en el espaciado de los NBD reorganizan drásticamente el empaquetamiento de las hélices transmembrana y, en la práctica, cambian el acceso a la cámara desde la capa interna a la capa externa de la membrana.^{[ 41 ]} Las estructuras determinadas para MsbA son la base del modelo de transporte por inclinación. ^{[ 18 ]} Las estructuras descritas también resaltan la naturaleza dinámica de los exportadores ABC como también lo sugieren losde fluorescenciay EPR. ^{[ 54 ] [ 81 ] [ 82 ]} Trabajos recientes han dado como resultado el descubrimiento de inhibidores de MsbA. ^{[ 83 ] [ 84 ]}

Los exportadores ABC poseen un mecanismo de transporte compatible tanto con el modelo de acceso alterno como con el modelo de interruptor de ATP. En los estados apo de los exportadores, la conformación está orientada hacia el interior y los dominios transmembrana (TMD) y los dominios de unión a nucleótidos (NBD) se encuentran relativamente separados para acomodar sustratos anfifílicos o hidrofóbicos. En el caso de MsbA, en particular, el tamaño de la cavidad es lo suficientemente grande como para albergar los grupos de azúcar de los lipopolisacáridos (LPS). Como han sugerido varios grupos, la unión del sustrato inicia el ciclo de transporte. El "golpe de fuerza", es decir, la unión del ATP que induce la dimerización del NBD y la formación del sándwich de ATP, impulsa los cambios conformacionales en los TMD. En MsbA, los grupos de cabeza de azúcar se encuentran secuestrados dentro de la cavidad durante el "golpe de fuerza". La cavidad está revestida de residuos cargados y polares que probablemente se encuentran solvatados, creando un entorno energéticamente desfavorable para los sustratos hidrofóbicos y energéticamente favorable para las fracciones polares en compuestos anfifílicos o grupos de azúcar de los LPS. Dado que el lípido no puede permanecer estable durante mucho tiempo en el entorno de la cámara, el lípido A y otras moléculas hidrofóbicas pueden "voltear" a una posición energéticamente más favorable dentro de la capa externa de la membrana. El "volteo" también puede ser impulsado por el cizallamiento de cuerpo rígido de los TMD mientras las colas hidrofóbicas del LPS son arrastradas a través de la bicapa lipídica. El reempaquetamiento de las hélices cambia la conformación a un estado orientado hacia el exterior. La hidrólisis de ATP puede ensanchar la abertura periplásmica y empujar el sustrato hacia la capa externa de la bicapa lipídica. La hidrólisis de la segunda molécula de ATP y la liberación de Pi _separan los NBD, seguidas de la restauración del estado de reposo, abriendo la cámara hacia el citoplasma para otro ciclo. ^{[ 41 ] [ 44 ] [ 52 ] [ 55 ] [ 81 ] [ 85 ]}

El ensayo de transporte vesicular detecta la translocación de moléculas por transportadores ABC. ^{[ 94 ]} Las membranas preparadas en condiciones adecuadas contienen vesículas orientadas de adentro hacia afuera, con el sitio de unión de ATP y el sitio de unión del sustrato del transportador orientados hacia el tampón externo. Los sustratos del transportador se incorporan a las vesículas de forma dependiente de ATP. Se utiliza una filtración rápida con filtros de fibra de vidrio o membranas de nitrocelulosa para separar las vesículas de la solución de incubación, y el compuesto de prueba atrapado en el interior de las vesículas se retiene en el filtro. La cantidad de moléculas transportadas sin marcar se determina mediante HPLC, LC/MS o LC/MS/MS. Alternativamente, los compuestos se radiomarcan, son fluorescentes o tienen una etiqueta fluorescente para poder cuantificar la radiactividad o la fluorescencia retenida en el filtro.

En los estudios de transporte vesicular se utilizan diversos tipos de membranas procedentes de diferentes fuentes (por ejemplo, células de insectos, líneas celulares de mamíferos transfectadas o seleccionadas). Las membranas están disponibles comercialmente o pueden prepararse a partir de diversas células o incluso tejidos, como las membranas canaliculares del hígado. Este tipo de ensayo tiene la ventaja de medir la distribución real del sustrato a través de la membrana celular. Su desventaja radica en que los compuestos con permeabilidad pasiva media a alta no se retienen dentro de las vesículas, lo que dificulta la realización de mediciones directas del transporte con este tipo de compuestos.

El ensayo de transporte vesicular puede realizarse de forma indirecta, donde los fármacos de prueba que interactúan modulan la velocidad de transporte de un compuesto indicador. Este tipo de ensayo es especialmente adecuado para la detección de posibles interacciones entre fármacos y entre fármacos y sustratos endógenos. No es sensible a la permeabilidad pasiva de los compuestos y, por lo tanto, detecta todos los compuestos que interactúan. Sin embargo, no proporciona información sobre si el compuesto analizado es un inhibidor del transportador o un sustrato del transportador que inhibe su función de forma competitiva. Un ejemplo típico de un ensayo de transporte vesicular indirecto es la detección de la inhibición del transporte de taurocolato por ABCB11 ( BSEP ).

Las células que expresan transportadores de eflujo bombean activamente los sustratos fuera de la célula, lo que resulta en una menor tasa de acumulación de sustrato, una menor concentración intracelular en estado estacionario o una tasa más rápida de eliminación del sustrato de las células cargadas con el sustrato. Los sustratos radiactivos transportados o los colorantes fluorescentes marcados pueden medirse directamente, o en una configuración indirecta, la modulación de la acumulación de un sustrato sonda (por ejemplo, colorantes fluorescentes como la rodamina 123 o la calceína) puede determinarse en presencia de un fármaco de prueba. ^{[ 89 ]}

Calceína-AM, un derivado de calceína de alta permeabilidad , penetra fácilmente en las células intactas, donde las esterasas endógenas la hidrolizan rápidamente a calceína fluorescente. A diferencia de la calceína-AM, la calceína tiene baja permeabilidad y, por lo tanto, queda atrapada en la célula y se acumula. Dado que la calceína-AM es un excelente sustrato de los transportadores de eflujo MDR1 y MRP1, las células que expresan estos transportadores bombean la calceína-AM fuera de la célula antes de que las esterasas puedan hidrolizarla. Esto resulta en una menor tasa de acumulación celular de calceína. Cuanto mayor sea la actividad de MDR en la membrana celular, menor será la acumulación de calceína en el citoplasma. En las células que expresan MDR, la adición de un inhibidor de MDR o un sustrato de MDR en exceso aumenta drásticamente la tasa de acumulación de calceína. La actividad del transportador de múltiples fármacos se refleja en la diferencia entre las cantidades de colorante acumuladas en presencia y ausencia del inhibidor. Mediante el uso de inhibidores selectivos, se puede distinguir fácilmente la actividad de transporte de MDR1 y MRP1. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las interacciones de fármacos con transportadores y también para cuantificar la actividad MDR de las células. El ensayo de calceína es un ensayo patentado por SOLVO Biotechnology.

En los seres humanos se conocen 49 transportadores ABC, que la Organización del Genoma Humano clasifica en siete familias.

Puede encontrar una lista completa de los transportadores ABC humanos en ^{[ 95 ] .}

El siguiente sistema de clasificación para transportadores de solutos transmembrana se ha construido en la base de datos TCDB. ^{[ 97 ]}

Tres familias de exportadores ABC se definen por sus orígenes evolutivos. ^{[ 6 ]} Los exportadores ABC1 evolucionaron por triplicación intragénica de un precursor de 2 TMS (TMS = segmento transmembrana. Una proteína "2 TMS" tiene 2 segmentos transmembrana) para dar proteínas de 6 TMS. Los exportadores ABC2 evolucionaron por duplicación intragénica de un precursor de 3 TMS, y los exportadores ABC3 evolucionaron a partir de un precursor de 4 TMS que se duplicó extragénicamente para dar dos proteínas de 4 TMS, ambas necesarias para la función de transporte, o intragénicamente para dar proteínas de 8 o 10 TMS. Las proteínas de 10 TMS parecen tener dos TMS adicionales entre las dos unidades repetidas de 4 TMS. ^{[ 98 ]} La mayoría de los sistemas de captación (todos excepto 3.A.1.21) son del tipo ABC2, divididos en tipo I y tipo II por la forma en que manejan los nucleótidos. Una subfamilia especial de importadores ABC2 llamada ECF utiliza una subunidad separada para el reconocimiento del sustrato. ^{[ 99 ]}

ABC1 ( InterPro : IPR036640 ): 

ABC2 ( InterPro : IPR000412 [parcial]): 

ABC3 ( InterPro : IPR003838 ):