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Variantes de PCR

Las variantes de PCR representan una amplia gama de técnicas que han evolucionado a partir del método básico de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cada una adaptada a ap...

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Las variantes de PCR representan una amplia gama de técnicas que han evolucionado a partir del método básico de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cada una adaptada a aplicaciones específicas en biología molecular , como el análisis genético, la secuenciación de ADN y el diagnóstico de enfermedades, mediante la modificación de factores como el diseño de los cebadores, las condiciones de temperatura y el uso de enzimas.

Modificaciones básicas

A menudo, basta con realizar una pequeña modificación al protocolo estándar de PCR para lograr el objetivo deseado:

La PCR múltiple utiliza varios pares de cebadores que se unen a diferentes secuencias diana. Esto permite el análisis simultáneo de múltiples dianas en una sola muestra. Por ejemplo, en las pruebas de mutaciones genéticas, se pueden combinar seis o más amplificaciones. En el protocolo estándar para la huella genética del ADN , las dianas analizadas suelen amplificarse en grupos de 3 o 4. La amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple ( MLPA ) permite amplificar múltiples dianas utilizando solo un par de cebadores, evitando las limitaciones de resolución de la PCR múltiple. La PCR múltiple también se ha utilizado para el análisis de microsatélites y SNP . [ 1 ]

Variaciones en la longitud de VNTR en seis individuos

La PCR de repeticiones en tándem de número variable (VNTR) se dirige a regiones repetitivas del genoma que presentan variación de longitud . El análisis de los genotipos en las muestras generalmente implica la determinación del tamaño de los productos de amplificación mediante electroforesis en gel . El análisis de segmentos VNTR más pequeños, conocidos como repeticiones cortas en tándem (o STR), es la base de las bases de datos de huellas genéticas como CODIS .

La PCR asimétrica amplifica preferentemente una hebra de un objetivo de ADN de doble hebra. Se utiliza en algunos métodos de secuenciación y sondas de hibridación para generar una hebra de ADN como producto. El termociclado se lleva a cabo exactamente igual que en la PCR convencional, pero con una cantidad limitante o omitiendo uno de los cebadores. Cuando el cebador limitante se agota, la replicación aumenta aritméticamente en lugar de exponencialmente a través de la extensión del cebador en exceso. [ 2 ] Una modificación de este proceso, denominada PCR lineal después de la exponencial ( o PCR tardía ) , utiliza un cebador limitante con una temperatura de fusión (T m ) más alta que el cebador en exceso para mantener la eficiencia de la reacción a medida que la concentración del cebador limitante disminuye a mitad de la reacción. [ 3 ] Véase también PCR de extensión por solapamiento .

Se requieren algunas modificaciones para realizar PCR de largo alcance . El proceso original de PCR basado en Klenow no generaba productos de más de 400 pb. Sin embargo, la polimerasa Taq puede amplificar secuencias de hasta varios miles de pb. [ 4 ] Desde entonces, protocolos modificados con la enzima Taq han permitido amplificar secuencias de más de 50 kb. [ 5 ]

PCR anidada

La PCR anidada se utiliza para aumentar la especificidad de la amplificación del ADN. Se emplean dos pares de cebadores en dos reacciones sucesivas. En la primera PCR, un par de cebadores se utiliza para generar productos de ADN, que pueden contener productos amplificados de regiones no objetivo. Los productos de la primera PCR se utilizan como plantilla en una segunda PCR, empleando uno (hemiseración) o dos cebadores diferentes cuyos sitios de unión se encuentran (anidados) dentro del primer par, lo que aumenta la especificidad. La PCR anidada suele ser más eficaz que la PCR convencional para amplificar de forma específica productos de ADN largos, pero requiere un conocimiento más detallado de la secuencia objetivo.

La PCR cuantitativa ( qPCR ) se utiliza para medir la cantidad específica de ADN (o ARN) diana en una muestra. Al medir la amplificación únicamente durante la fase de crecimiento exponencial, la cantidad de producto medida refleja con mayor precisión la cantidad inicial de la molécula diana. Se utilizan termocicladores especiales que monitorizan la cantidad de producto durante la amplificación.

La PCR cuantitativa en tiempo real ( QRT-PCR ), a veces llamada simplemente PCR en tiempo real ( RT-PCR ), se refiere a un conjunto de métodos que utilizan colorantes fluorescentes, como Sybr Green, o sondas de ADN que contienen fluoróforos , como TaqMan , para medir la cantidad de producto amplificado en tiempo real a medida que avanza la amplificación.

La PCR de inicio en caliente es una técnica que se realiza manualmente calentando los componentes de la reacción a la temperatura de fusión del ADN (p. ej., 95  °C) antes de añadir la polimerasa. De esta forma, se evita la amplificación no específica a temperaturas más bajas. [ 6 ] Alternativamente, los reactivos especializados inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea por la unión de un anticuerpo o por la presencia de inhibidores unidos covalentemente que solo se disocian después de una etapa de activación a alta temperatura. La PCR de inicio en caliente/finalización en frío se logra con nuevas polimerasas híbridas que son inactivas a temperatura ambiente y solo se activan a temperaturas elevadas.

En la PCR de descenso gradual de temperatura, la temperatura de hibridación se reduce progresivamente en los ciclos posteriores. En los primeros ciclos, la temperatura de hibridación suele ser de 3 a 5 °C superior a la Tm  estándar de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores es similarmente inferior a la Tm . La temperatura de hibridación inicial más alta conduce a una mayor especificidad en la unión de los cebadores, mientras que las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente al final de la reacción. [ 7 ]

La PCR de ensamblaje (también conocida como ensamblaje por ciclo de polimerasa o PCA ) es la síntesis de estructuras de ADN largas mediante la realización de PCR en un conjunto de oligonucleótidos largos con segmentos cortos superpuestos, para ensamblar dos o más fragmentos de ADN en uno solo. Implica una PCR inicial con cebadores que se superponen y una segunda PCR que utiliza los productos como plantilla para generar el producto final de longitud completa. Esta técnica puede sustituir al ensamblaje basado en ligación . [ 8 ]

En la PCR de colonias , las colonias bacterianas se analizan directamente mediante PCR, por ejemplo, para la detección de construcciones correctas de vectores de ADN . Se toman muestras de las colonias con una punta de pipeta estéril y se transfiere una pequeña cantidad de células a una mezcla de PCR. Para liberar el ADN de las células, la PCR se inicia con un tiempo prolongado a 95  °C (cuando se utiliza una polimerasa estándar) o con un paso de desnaturalización más corto a 100  °C y una polimerasa de ADN quimérica especial. [ 9 ]

La reacción en cadena de la polimerasa digital amplifica simultáneamente miles de muestras, cada una en una gota separada dentro de una emulsión o partición dentro de un micropocillo.

La PCR suicida se utiliza habitualmente en paleogenética u otros estudios donde evitar falsos positivos y garantizar la especificidad del fragmento amplificado es de máxima prioridad. Se describió originalmente en un estudio para verificar la presencia del microbio Yersinia pestis en muestras dentales obtenidas de tumbas del siglo XIV de personas supuestamente fallecidas por la peste durante la epidemia medieval de la Peste Negra . [ 10 ] El método prescribe el uso de cualquier combinación de cebadores solo una vez en una PCR (de ahí el término "suicidio"), que nunca debe haberse utilizado en ninguna reacción de PCR de control positivo, y los cebadores siempre deben dirigirse a una región genómica nunca antes amplificada en el laboratorio utilizando este o cualquier otro conjunto de cebadores. Esto garantiza que no haya ADN contaminante de reacciones de PCR anteriores en el laboratorio, lo que de otro modo podría generar falsos positivos.

COLD-PCR ( PCR de coamplificación a temperatura de desnaturalización más baja ) es un protocolo modificado que enriquece los alelos variantes a partir de una mezcla de muestras de ADN de tipo salvaje y muestras que contienen mutaciones.

Pretratamientos y extensiones

En ocasiones, el proceso básico de PCR puede preceder o seguir a otra técnica.

La RT-PCR (o PCR de transcripción inversa ) se utiliza para transcribir inversamente y amplificar el ARN a ADNc . La PCR está precedida por una reacción con transcriptasa inversa , una enzima que convierte elARN en ADNc. Ambas reacciones pueden combinarse en un tubo, y el paso inicial de calentamiento de la PCR se utiliza para inactivar la transcriptasa. [ 4 ] La polimerasa Tth (descrita más adelante) tiene actividad RT y puede llevar a cabo toda la reacción. La RT-PCR se utiliza ampliamente en el perfilado de expresión , que detecta la expresión de un gen. También puede utilizarse para obtener la secuencia de un transcrito de ARN, lo que puede ayudar a determinar lossitios de inicio y terminación de la transcripción (mediante RACE-PCR ) y facilitar el mapeo de la ubicación de exones e intrones en una secuencia genética. Se ha desarrollado la qRT-PCR multiplex para mejorar la eficiencia de detección del SARS-CoV-2 al permitir que se analicen simultáneamente múltiples dianas virales. [ 11 ]

La PCR de dos colas utiliza un único cebador que se une a una secuencia diana de microARN con extremos 3' y 5', conocidos como hemisondas. [ 12 ] Ambos extremos deben ser complementarios para que se produzca la unión. El extremo 3' se extiende mediante transcriptasa inversa, formando un ADNc largo. Este ADNc se amplifica utilizando dos cebadores de PCR específicos para la secuencia diana. La combinación de dos hemisondas, ambas dirigidas a la secuencia diana corta de microARN, confiere al ensayo de dos colas una sensibilidad y especificidad excepcionales.

La PCR mediada por ligación utiliza pequeños oligonucleótidos de ADN, denominados «enlazadores» (o adaptadores), que primero se ligan a fragmentos del ADN diana. Posteriormente, se utilizan cebadores de PCR que se unen a las secuencias del enlazador para amplificar los fragmentos diana. Este método se emplea para la secuenciación de ADN, el análisis del genoma mediante caminatas y el análisis de huellas de ADN . [ 13 ] Una técnica relacionada es el polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados , que genera fragmentos diagnósticos de un genoma.

La PCR específica de metilación ( MSP ) se utiliza para identificar patrones de metilación del ADN en islas de citosina-guanina (CpG) en el ADN genómico. [ 14 ] El ADN diana se trata primero con bisulfito de sodio , que convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo , que es complementario a la adenosina en los cebadores de PCR. A continuación, se realizan dos amplificaciones en el ADN tratado con bisulfito: un conjunto de cebadores se une al ADN con citosinas (correspondientes a la citosina metilada) y el otro conjunto se une al ADN con uracilo (correspondientes a la citosina no metilada). La MSP utilizada en la PCR cuantitativa proporciona información cuantitativa sobre el estado de metilación de una isla CpG determinada. [ 15 ]

Otras modificaciones

El ajuste de los componentes en la PCR se utiliza habitualmente para lograr un rendimiento óptimo.

El ion magnesio divalente (Mg ++ ) es necesario para la actividad de la PCR polimerasa. Concentraciones más bajas de Mg ++ aumentarán la fidelidad de la replicación, mientras que concentraciones más altas introducirán más mutaciones. [ 16 ]

Los desnaturalizantes (como el dimetilsulfóxido ) pueden aumentar la especificidad de la amplificación al desestabilizar la unión inespecífica de los cebadores. Otros compuestos químicos, como el glicerol , estabilizan la actividad de la polimerasa durante la amplificación. Los detergentes (como el Triton X-100 ) pueden evitar que la polimerasa se adhiera a sí misma o a las paredes del tubo de reacción.

Las ADN polimerasas incorporan ocasionalmente bases no coincidentes en la cadena en extensión. La PCR de alta fidelidad emplea enzimas con actividad exonucleasa 3'-5' que disminuyen esta tasa de incorporación errónea. Ejemplos de enzimas con actividad correctora incluyen Pfu ; el ajuste de las concentraciones de Mg ++ y dNTP puede ayudar a maximizar la cantidad de productos que coinciden exactamente con el ADN diana original.

Modificaciones de la imprimación

Los ajustes a los oligonucleótidos sintéticos utilizados como cebadores en la PCR son una rica fuente de modificación:

Normalmente, los cebadores de PCR se seleccionan de una región invariable del genoma y se utilizan para amplificar una zona polimórfica entre ellos. En la PCR alelo-específica, se realiza el procedimiento inverso. Al menos uno de los cebadores se selecciona de una zona polimórfica, con las mutaciones localizadas en su extremo 3' (o cerca de él). En condiciones rigurosas, un cebador no complementario no inicia la replicación, mientras que uno complementario sí. Por lo tanto, la aparición de un producto de amplificación indica el genotipo. (Para más información, consulte Genotipado de SNP ).

La PCR específica de secuencias intergénicas (o ISSR-PCR ) es un método de huella genética que utiliza cebadores seleccionados de segmentos repetidos a lo largo del genoma para producir una huella genética única de las longitudes de los productos amplificados. [ 17 ] El uso de cebadores de un segmento comúnmente repetido se denomina Alu-PCR y puede ayudar a amplificar secuencias adyacentes (o entre) estas repeticiones.

Los cebadores también pueden diseñarse para ser "degenerados", capaces de iniciar la replicación desde un gran número de ubicaciones objetivo. La amplificación del genoma completo (o WGA ) es un conjunto de procedimientos que permiten la amplificación en múltiples ubicaciones de un genoma desconocido, y que puede estar disponible solo en pequeñas cantidades. Otras técnicas utilizan cebadores degenerados que se sintetizan con múltiples nucleótidos en posiciones específicas (la polimerasa "elige" los cebadores que coinciden correctamente). Además, los cebadores pueden sintetizarse con el análogo de nucleósido inosina , que se hibrida con tres de las cuatro bases normales. Una técnica similar puede forzar a la PCR a realizar mutagénesis dirigida . (Véase también Reacción en cadena de la polimerasa con extensión por solapamiento ).

Normalmente, los cebadores utilizados en la PCR se diseñan para ser totalmente complementarios a la secuencia diana. Sin embargo, la polimerasa tolera desajustes fuera del extremo 3'. Los cebadores con cola incluyen secuencias no complementarias en sus extremos 5'. Un procedimiento común es el uso de cebadores enlazadores , que colocan sitios de restricción en los extremos de los productos de PCR, facilitando así su posterior inserción en vectores de clonación.

La amplificación arbitraria de ADN (RAPD) es una familia de métodos de perfilado de ADN que utilizan cebadores arbitrarios para amplificar ADN de secuencia desconocida mediante PCR. Entre ellos se incluyen la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), la PCR con cebadores arbitrarios (AP-PCR) y la huella genética por amplificación de ADN (DAF). La naturaleza arbitraria de los cebadores utilizados en estos métodos se dirige a regiones anónimas de un genoma o una construcción genética, generando huellas genéticas únicas. Esto distingue a estas técnicas de las metodologías de PCR estándar, que requieren conocer la secuencia objetivo.

Una extensión del método de PCR en colonias (descrito anteriormente) es el uso de cebadores vectoriales . Primero, se insertan fragmentos de ADN diana (o ADNc) en un vector de clonación , y se diseña un único conjunto de cebadores para las regiones del vector que flanquean el sitio de inserción. La amplificación se produce para todo el ADN que se haya insertado. [ 4 ]

La PCR se puede modificar fácilmente para producir un producto marcado que se utilizará posteriormente como sonda de hibridación . Se pueden usar uno o ambos cebadores en la PCR con una etiqueta radiactiva o fluorescente ya incorporada, o bien se pueden añadir las etiquetas después de la amplificación. Estos métodos de marcaje se pueden combinar con la PCR asimétrica (descrita anteriormente) para producir sondas de hibridación eficaces.

La PCR dependiente de RNasa H (rhPCR) puede reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar el número de ensayos en la PCR múltiple. El método utiliza cebadores con un bloque escindible en el extremo 3' que se elimina por la acción de una enzima RNasa HII termoestable. [ 18 ]

ADN polimerasas

En la PCR se utilizan varias ADN polimerasas.

plantilla de ADN

El fragmento de Klenow , derivado de la ADN polimerasa I original de E. coli , fue la primera enzima utilizada en la PCR. Debido a su falta de estabilidad a altas temperaturas, necesita ser repuesto durante cada ciclo y, por lo tanto, no se usa comúnmente en la PCR.

La ADN polimerasa del bacteriófago T4 (familia A) también se utilizó inicialmente en la PCR. Presenta una mayor fidelidad de replicación que el fragmento de Klenow, pero también se destruye con el calor. La ADN polimerasa T7 (familia B) posee propiedades y funciones similares. Se ha aplicado a la mutagénesis dirigida [ 19 ] y a la secuenciación de Sanger [ 20 ] .

La polimerasa Taq , la ADN polimerasa I de Thermus aquaticus , fue la primera polimerasa termoestable utilizada en PCR y sigue siendo la más utilizada. La enzima puede aislarse de su fuente nativa o de su gen clonado expresado en E. coli . [ 4 ] Un fragmento truncado de 61 kDa que carece de actividad exonucleasa 5'-3' se conoce como fragmento de Stoffel y se expresa en E. coli . [ 21 ] La falta de actividad exonucleasa puede permitirle amplificar objetivos más largos que la enzima nativa. Se ha comercializado como AmpliTaq y Klentaq . [ 22 ] También se ha producido una variante diseñada para PCR de inicio en caliente llamada "polimerasa Faststart". Requiere una fuerte activación térmica, evitando así la amplificación no específica debida a la actividad de la polimerasa a baja temperatura.Se han creado muchas otras variantes . [ 23 ] Otras polimerasas de Thermus , como la polimerasa Tth I ( P52028 ) de Thermus thermophilus , se han utilizado en cierta medida.

El género arqueano Pyrococcus ha demostrado ser una rica fuente de polimerasas termoestables con actividad correctora. La ADN polimerasa Pfu , aislada de P. furiosus, muestra una disminución de 5 veces en la tasa de error de replicación en comparación con Taq. [ 24 ] Dado que los errores aumentan a medida que avanza la PCR, Pfu es la polimerasa preferida cuando los productos se van a clonar individualmente para secuenciación o expresión. Otras polimerasas menos utilizadas de este género incluyen Pwo ( P61876 ) de Pyrococcus woesei (que es idéntica a Pfu ), [ 25 ] y la polimerasa "Deep Vent" ( Q51334 ) de la cepa GB-D. [ 26 ]

La polimerasa Vent o Tli es una ADN polimerasa extremadamente termoestable aislada de Thermococcus litoralis . La polimerasa de Thermococcus fumicolans ( Tfu ) también se ha comercializado. [ 26 ] La ADN polimerasa de Thermococcus kodakarensis ( Tko , KOD) tiene una fidelidad incluso mayor que la de Pfu . Se vende comercialmente como Pfx . [ 27 ]

También se comercializan mezclas de Taq y polimerasas correctoras, que ofrecen un equilibrio entre la velocidad de Taq y la fidelidad de una polimerasa correctora. [ 26 ] Las técnicas de ingeniería de proteínas han creado polimerasas con una velocidad y fidelidad inigualables por cualquier polimerasa natural conocida, siendo un avance reciente (alrededor de 2015) la fusión con la proteína Sso7d , que mejora la procesividad. [ 28 ] [ 29 ] En 2015 se publicó un método para producir Pfu-Sso7d puro en el laboratorio, [ 30 ] ofreciendo una alternativa a la compra a fuentes comerciales costosas. [ 31 ]

Plantilla de ARN

Las transcriptasas inversas producen ADN a partir de una plantilla de ARN. Se utilizan en la RT-PCR , que primero copia el ARN en ADN y luego amplifica el ADN. Esto resulta útil para detectar fragmentos de ARN y para secuenciar el ARN.

Para este propósito se pueden utilizar transcriptasas inversas retrovirales . Dos opciones comunes son la transcriptasa inversa del AMV y la del MMLV. Además de la actividad transcriptasa inversa, poseen actividad de ARNasa H y TdT , las cuales son indeseables y pueden reducirse mediante el uso de versiones mutadas. Carecen de capacidad de corrección de errores y tienen baja fidelidad. [ 32 ]

La ADN polimerasa Tth tiene actividad de transcriptasa inversa en presencia de iones Mn²⁺ , lo que permite la amplificación por PCR a partir de ARN diana. No tiene capacidad de corrección de errores. [ 33 ] También se han construido mutantes que no requieren manganeso. [ 34 ]

En 2016, los científicos utilizaron con éxito la evolución dirigida para modificar la ADN polimerasa Tko , una enzima con actividad correctora de pruebas, transformándola en una xenotranscriptasa de transcripción inversa (RTX). Esta nueva enzima es capaz de copiar y corregir plantillas de ARN y ADN. Se espera que mejore la precisión en la secuenciación de ARN y otras formas de RT-PCR. [ 35 ] Su comercialización tuvo lugar antes de abril de 2018. [ 36 ]

Modificaciones del mecanismo

En ocasiones, incluso el mecanismo básico de la PCR puede modificarse.

PCR inversa.

A diferencia de la PCR convencional, la PCR inversa permite la amplificación y secuenciación del ADN que rodea una secuencia conocida. Consiste en someter inicialmente el ADN diana a una serie de digestiones con enzimas de restricción y, posteriormente, circularizar los fragmentos resultantes mediante autoligación . Los cebadores se diseñan para extenderse hacia afuera desde el segmento conocido, lo que da como resultado la amplificación del resto del círculo. Esto es especialmente útil para identificar secuencias a ambos lados de diversos insertos genómicos. [ 37 ]

De manera similar, la PCR asimétrica entrelazada térmica (o TAIL-PCR ) se utiliza para aislar secuencias desconocidas que flanquean una región conocida del genoma. Dentro de la secuencia conocida, TAIL-PCR utiliza un par de cebadores anidados con diferentes temperaturas de hibridación. Se utiliza un cebador "degenerado" para amplificar en la dirección opuesta a la secuencia desconocida. [ 38 ]

La naturaleza arbitraria de los cebadores utilizados en la familia de métodos de perfilado de ADN amplificado arbitrariamente (ADN-A) permite identificar regiones anónimas en un genoma o construcción genética, generando huellas genéticas únicas sin necesidad de conocer previamente la secuencia de ácidos nucleicos. Las condiciones de baja rigurosidad de la PCR y los cebadores cortos empleados distinguen estas técnicas de las metodologías de PCR estándar.

Métodos de amplificación isotérmica

Se han desarrollado algunos protocolos de amplificación de ADN que pueden utilizarse como alternativa a la PCR. Son isotérmicos, lo que significa que se realizan a temperatura constante. [ 39 ]

La amplificación dependiente de helicasa (HDA) es similar a la PCR tradicional, pero utiliza una temperatura constante en lugar de ciclos de desnaturalización y hibridación/extensión. La helicasa de ADN , una enzima que desenrolla el ADN, se utiliza en lugar de la desnaturalización térmica. [ 40 ] La amplificación isotérmica mediada por bucles es una idea similar, pero se realiza con una polimerasa que desplaza la cadena. [ 41 ]

La reacción de amplificación de enzima de corte (NEAR) y su variante, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), son isotérmicas y replican el ADN a temperatura constante utilizando una polimerasa y una enzima de corte. [ 39 ]

La amplificación por recombinasa polimerasa (RPA) [ 42 ] utiliza una recombinasa para emparejar específicamente los cebadores con el ADN de doble cadena basándose en la homología, dirigiendo así la síntesis de ADN a partir de secuencias de ADN definidas presentes en la muestra. La presencia de la secuencia diana inicia la amplificación del ADN, y no se requiere la fusión térmica ni química del ADN. La reacción progresa rápidamente y da como resultado una amplificación específica del ADN, desde unas pocas copias de la secuencia diana hasta niveles detectables, generalmente en 5-10 minutos. Todo el sistema de reacción es estable como formulación seca y no necesita refrigeración. La RPA puede utilizarse para reemplazar la PCR en diversas aplicaciones de laboratorio, y los usuarios pueden diseñar sus propios ensayos. [ 43 ]

Otros tipos de amplificación isotérmica incluyen la amplificación del genoma completo (WGA), la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) y la amplificación mediada por transcripción (TMA). [ 39 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ (febrero de 2008). "PCR lista para multiplexación: un nuevo método para la genotipificación multiplexada de SSR y SNP" . BMC Genomics . 9 : 80. doi : 10.1186/1471-2164-9-80 . PMC 2275739. PMID 18282271 .  
  2. ↑ Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA (diciembre de 1988). "Secuenciación de ADN con la ADN polimerasa de Thermus aquaticus y secuenciación directa de ADN amplificado por reacción en cadena de la polimerasa" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 85 ( 24): 9436– 9440. Bibcode : 1988PNAS...85.9436I . doi : 10.1073/pnas.85.24.9436 . PMC 282767. PMID 3200828 .  
  3. ↑ Pierce KE, Wangh LJ (2007). "Reacción en cadena de la polimerasa lineal después de la exponencial y tecnologías afines". Diagnóstico de células individuales . Métodos en medicina molecular. Vol. 132. págs. 65–85 . doi : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . ISBN   978-1-59745-298-4. PMID 17876077 . 
  4. 1 2 3 4 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, et al. (enero de 1988). "Amplificación enzimática dirigida por cebadores de ADN con una ADN polimerasa termoestable". Science . 239 (4839): 487– 491. Bibcode : 1988Sci...239..487S . doi : 10.1126/science.239.4839.487 . PMID 2448875 .  
  5. ↑ Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (junio de 1994). "Amplificación eficaz de objetivos largos a partir de inserciones clonadas y ADN genómico humano" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 91 (12): 5695– 5699. Bibcode : 1994PNAS...91.5695C . doi : 10.1073/pnas.91.12.5695 . PMC 44063. PMID 8202550 .  
  6. ↑ Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (abril de 1992). "La prevención del cebado incorrecto previo a la PCR y la dimerización de los cebadores mejora las amplificaciones de bajo número de copias" . Nucleic Acids Research . 20 (7): 1717– 1723. doi : 10.1093/nar/20.7.1717 . PMC 312262. PMID 1579465 .  
  7. ↑ Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (julio de 1991) .PCR de "aterrizaje" para evitar el cebado espurio durante la amplificación genética" . Nucleic Acids Research . 19 (14): 4008. doi : 10.1093/nar/19.14.4008 . PMC 328507. PMID 1861999 .  
  8. ↑ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (octubre de 1995). "Ensamblaje en un solo paso de un gen y un plásmido completo a partir de un gran número de oligodesoxirribonucleótidos". Gene . 164 (1): 49– 53. doi : 10.1016/0378-1119(95)00511-4 . PMID 7590320 . 
  9. ↑ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2006). "Polimerasas de ADN termoestables para un amplio espectro de aplicaciones: comparación de una TopoTaq híbrida robusta con otras enzimas". En Kieleczawa J (ed.). Secuenciación de ADN II: optimización de la preparación y la purificación . Jones and Bartlett. págs. 241–257 . ISBN  978-0-7637-3383-4.
  10. ↑ Raoult D, Aboudharam G, Crubézy E, Larrouy G, Ludes B, Drancourt M (noviembre de 2000). "Identificación molecular mediante "PCR suicida" de Yersinia pestis como agente de la peste negra medieval" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 97 (23): 12800– 12803. Bibcode : 2000PNAS...9712800R . doi : 10.1073 / pnas.220225197 . PMC 18844. PMID 11058154 .  
  11. ↑ Perchetti GA, Nalla AK, Huang ML, Jerome KR, Greninger AL (agosto de 2020). "Multiplexación de conjuntos de cebadores/sondas para la detección de SARS-CoV-2 mediante qRT-PCR" . Journal of Clinical Virology . 129 104499. doi : 10.1016/j.jcv.2020.104499 . PMC 7278635. PMID 32535397 .  
  12. ↑ Androvic P, Valihrach L, Elling J, Sjoback R, Kubista M (septiembre de 2017). "RT-qPCR de dos colas: un método novedoso para la cuantificación de miRNA de alta precisión" . Nucleic Acids Research . 45 (15): e144. doi : 10.1093/nar/gkx588 . PMC 5587787. PMID 28911110 .  
  13. ↑ Mueller PR, Wold B (noviembre de 1989). "Huella in vivo de un potenciador específico del músculo mediante PCR mediada por ligación". Science . 246 (4931): 780– 786. Bibcode : 1989Sci...246..780M . doi : 10.1126/science.2814500 . PMID 2814500 . 
  14. ↑ Herman JG , Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (septiembre de 1996). "PCR específica de metilación: un nuevo ensayo de PCR para el estado de metilación de las islas CpG" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 93 ( 18): 9821–9826 . Bibcode : 1996PNAS...93.9821H . doi : 10.1073/pnas.93.18.9821 . PMC 38513. PMID 8790415 .  
  15. ↑ Hernández HG, Tse MY, Pang SC, Arboleda H, Forero DA (octubre de 2013). "Optimización de metodologías para el análisis de metilación de ADN basado en PCR" . BioTechniques . 55 (4): 181–197 . doi : 10.2144/000114087 . PMID 24107250 . 
  16. ↑ Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M (2002). " Reacción en cadena de la polimerasa multiplex: un enfoque práctico" . Journal of Clinical Laboratory Analysis . 16 (1): 47– 51. doi : 10.1002/jcla.2058 . PMC 6808141. PMID 11835531 .  
  17. ↑ Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D (marzo de 1994). "Huella genética mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa anclada a repeticiones de secuencias simples (SSR)". Genomics . 20 ( 2): 176– 183. doi : 10.1006/geno.1994.1151 . PMID 8020964. S2CID 41802285 .  
  18. ↑ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, et al. (agosto de 2011). "PCR dependiente de RNasa H (rhPCR): especificidad mejorada y detección de polimorfismos de un solo nucleótido mediante cebadores escindibles bloqueados" . BMC Biotechnology . 11 : 80. doi : 10.1186/1472-6750-11-80 . PMC 3224242. PMID 21831278 .   
  19. ↑ Venkitaraman AR (abril de 1989). "Uso de la ADN polimerasa T7 modificada (versión 2.0 de Sequenase) para la mutagénesis dirigida por sitios de oligonucleótidos" . Nucleic Acids Research . 17 (8): 3314. doi : 10.1093/nar/17.8.3314 . PMC 317753. PMID 2726477 .  
  20. ↑ "Thermo Sequenase DNA Polymerase" . Archivado del original el 23 de febrero de 2015. Consultado el 28 de marzo de 2019 .
  21. ↑ Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, et al. (mayo de 1993). "Expresión de alto nivel, purificación y caracterización enzimática de la ADN polimerasa de longitud completa de Thermus aquaticus y una forma truncada deficiente en actividad exonucleasa 5' a 3'" . PCR Methods and Applications . 2 (4): 275– 287. doi : 10.1101/gr.2.4.275 . PMID 8324500 .  
  22. ↑ " Applied Biosystems - Soporte" . www6.appliedbiosystems.com
  23. ↑ Villbrandt B, Sobek H, Frey B, Schomburg D (septiembre de 2000). "Intercambio de dominios: quimeras de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, la ADN polimerasa I de Escherichia coli y la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana" . Protein Engineering . 13 (9): 645– 654. doi : 10.1093/protein/13.9.645 . PMID 11054459 . 
  24. ↑ Cline J, Braman JC, Hogrefe HH (septiembre de 1996). "Fidelidad de PCR de la ADN polimerasa pfu y otras ADN polimerasas termoestables" . Nucleic Acids Research . 24 (18): 3546– 3551. doi : 10.1093/nar/24.18.3546 . PMC 146123. PMID 8836181 .  
  25. ↑ "UniRef100_P61875" . UniProt .
  26. 1 2 3 van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (2008). "Taq y otras ADN polimerasas termoestables". Principios y aspectos técnicos de la amplificación por PCR . págs. 103–18 . doi : 10.1007/978-1-4020-6241-4_7 . ISBN  978-1-4020-6240-7.
  27. ↑ "AccuPrime™ Pfx ADN Polimerasa" .
  28. ↑ "El poder de dos: polimerasas de ADN de fusión" .
  29. ↑ Personal B (8 de diciembre de 2015). "Polimerasa de fusión Sso7d: una revisión de qué es y cómo ayuda a la PCR | Bio-Radiations" .
  30. ↑ "Protocolo para la obtención de la polimerasa Pfu-Sso7d" . barricklab.org .
  31. ↑ Farooqui AK, Ahmad H, Rehmani MU, Husain A (agosto de 2023). "Método rápido y sencillo para la extracción y purificación de Pfu-Sso7d, una ADN polimerasa de alta procesividad". Expresión y purificación de proteínas . 208–209 106276. doi : 10.1016/j.pep.2023.106276 . PMID 37156451 . 
  32. ↑ "Propiedades de la transcriptasa inversa" .
  33. ↑ "MasterAmp™ Tth DNA Polymerase" (PDF) .
  34. ↑ Luo Z, Xue Y, Chen X, Zhang J, Lu C (marzo de 2023). "Actividad de transcriptasa inversa independiente de manganeso de la ADN polimerasa Tth con dos sustituciones de aminoácidos". Protein & Peptide Letters . 30 (3): 193– 200. doi : 10.2174/0929866530666230216113348 .
  35. ↑ Ellefson JW, Gollihar J, Shroff R, Shivram H, Iyer VR, Ellington AD (24 de junio de 2016). "Origen evolutivo sintético de una transcriptasa inversa correctora de pruebas". Science . 352 (6293): 1590–3 . doi : 10.1126/science.aaf5409 . PMID 27339990 . 
  36. ↑ " Transcriptasa inversa WarmStart® RTx | NEB" . www.neb.com
  37. ↑ Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (noviembre de 1988). "Aplicaciones genéticas de una reacción en cadena de la polimerasa inversa" . Genetics . 120 ( 3): 621– 623. doi : 10.1093/genetics/120.3.621 . PMC 1203539. PMID 2852134 .  
  38. ↑ Liu YG, Whittier RF (febrero de 1995). "PCR entrelazada asimétrica térmica: amplificación y secuenciación automatizables de fragmentos de extremos de inserción de clones P1 y YAC para el rastreo cromosómico". Genomics . 25 (3): 674– 681. doi : 10.1016/0888-7543(95)80010-J . PMID 7759102 . 
  39. 1 2 3 "Amplificación isotérmica - Descripción general de la aplicación" . New England BioLabs, Inc. 2020. Consultado el 13 de agosto de 2020 .
  40. ↑ Vincent M, Xu Y, Kong H (agosto de 2004). "Amplificación isotérmica de ADN dependiente de helicasa" . EMBO Reports . 5 (8): 795– 800. doi : 10.1038/sj.embor.7400200 . PMC 1249482. PMID 15247927 .  
  41. ↑ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. (junio de 2000). " Amplificación isotérmica de ADN mediada por bucles" . Nucleic Acids Research . 28 (12): 63e–63. doi : 10.1093/nar/28.12.e63 . PMC 102748. PMID 10871386 .   
  42. ↑ Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA (julio de 2006). "Detección de ADN mediante proteínas de recombinación" . PLOS Biology . 4 (7) e204. doi : 10.1371/journal.pbio.0040204 . PMC 1475771. PMID 16756388 .  
  43. ↑ Lutz S, Weber P, Focke M, Faltin B, Hoffmann J, Müller C, et al. (abril de 2010). "Laboratorio microfluídico en una lámina para el análisis de ácidos nucleicos basado en la amplificación isotérmica de la polimerasa recombinasa (RPA)". Lab on a Chip . 10 (7): 887– 893. doi : 10.1039/b921140c . PMID 20300675 .  
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