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cultivo celular

Cultivo celular en una placa de Petri pequeña Células epiteliales en cultivo, teñidas para detectar queratina (rojo) y ADN (verde). El cultivo celular o de tejidos es el proceso...

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Cultivo celular en una placa de Petri pequeña
Células epiteliales en cultivo, teñidas para detectar queratina (rojo) y ADN (verde).

El cultivo celular o de tejidos es el proceso mediante el cual las células se cultivan en condiciones controladas, generalmente fuera de su entorno natural. Después de que las células de interés se han aislado del tejido vivo , posteriormente se pueden mantener en condiciones cuidadosamente controladas. Deben mantenerse a temperatura corporal (37  °C) en una incubadora. [ 1 ] Estas condiciones varían para cada tipo de célula, pero generalmente consisten en un recipiente adecuado con un sustrato o medio rico que proporciona los nutrientes esenciales ( aminoácidos , carbohidratos , vitaminas , minerales ), factores de crecimiento , hormonas y gases ( CO 2 , O 2 ), y regula el entorno fisicoquímico ( tampón de pH , presión osmótica , temperatura ). La mayoría de las células requieren una superficie o un sustrato artificial para formar un cultivo adherente como una monocapa (de una sola célula de espesor), mientras que otras pueden crecer flotando libremente en un medio como un cultivo en suspensión . [ 2 ] Esto generalmente se facilita mediante el uso de un medio de crecimiento líquido, semisólido o sólido , como caldo o agar . El cultivo de tejidos se refiere comúnmente al cultivo de células y tejidos animales , mientras que el término más específico , cultivo de tejidos vegetales, se utiliza para las plantas. La vida útil de la mayoría de las células está determinada genéticamente, pero algunas células cultivadas se han transformado en células inmortales que se reproducen indefinidamente si se les proporcionan las condiciones óptimas.

En la práctica, el término «cultivo celular» se refiere actualmente al cultivo de células derivadas de eucariotas multicelulares , especialmente células animales, a diferencia de otros tipos de cultivo que también cultivan células, como el cultivo de tejidos vegetales , el cultivo de hongos y el cultivo microbiológico (de microorganismos ). El desarrollo histórico y los métodos del cultivo celular están estrechamente relacionados con los del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos . El cultivo viral también guarda relación, ya que las células actúan como huéspedes de los virus.

La técnica de laboratorio para mantener líneas celulares vivas (una población de células descendientes de una sola célula y que contienen la misma composición genética) separadas de su tejido de origen se volvió más robusta a mediados del siglo XX. [ 3 ] [ 4 ]

Historia

El fisiólogo inglés del siglo XIX Sydney Ringer desarrolló soluciones salinas que contenían cloruros de sodio, potasio, calcio y magnesio adecuadas para mantener el latido de un corazón animal aislado fuera del cuerpo. [ 5 ] En 1885 Wilhelm Roux extrajo una sección de la placa medular de un embrión de pollo y la mantuvo en una solución salina tibia durante varios días, estableciendo el principio básico del cultivo de tejidos. En 1907 el zoólogo Ross Granville Harrison demostró el crecimiento de células embrionarias de rana que darían origen a células nerviosas en un medio de linfa coagulada . En 1913, E. Steinhardt, C. Israeli y RA Lambert cultivaron el virus vaccinia en fragmentos de tejido corneal de cobaya . [ 6 ] En 1996, se utilizó por primera vez tejido regenerativo para reemplazar un pequeño segmento de uretra, lo que llevó a comprender que la técnica de obtener muestras de tejido, cultivarlo fuera del cuerpo sin un andamio y volver a aplicarlo, solo puede utilizarse para distancias pequeñas de menos de 1 cm. [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] Ross Granville Harrison , que trabajaba en la Facultad de Medicina Johns Hopkins y luego en la Universidad de Yale , publicó los resultados de sus experimentos de 1907 a 1910, estableciendo la metodología del cultivo de tejidos . [ 10 ] 

Gottlieb Haberlandt fue el primero en señalar las posibilidades del cultivo de tejidos aislados, el cultivo de tejidos vegetales . [ 11 ] Sugirió que las potencialidades de las células individuales mediante el cultivo de tejidos, así como las influencias recíprocas de los tejidos entre sí, podrían determinarse mediante este método. Desde las afirmaciones originales de Haberlandt, se han desarrollado métodos para el cultivo de tejidos y células, lo que ha dado lugar a importantes descubrimientos en biología y medicina. Presentó su idea original de totipotencialidad en 1902, afirmando que «teóricamente, todas las células vegetales son capaces de dar origen a una planta completa». [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] El término cultivo de tejidos fue acuñado por el patólogo estadounidense Montrose Thomas Burrows . [ 15 ]

Las técnicas de cultivo celular experimentaron avances significativos en las décadas de 1940 y 1950 para apoyar la investigación en virología . El cultivo de virus en células permitió la preparación de virus purificados para la fabricación de vacunas . La vacuna inyectable contra la poliomielitis desarrollada por Jonas Salk fue uno de los primeros productos producidos en masa mediante técnicas de cultivo celular. Esta vacuna fue posible gracias a la investigación en cultivo celular de John Franklin Enders , Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins , quienes recibieron el Premio Nobel por su descubrimiento de un método para cultivar el virus en cultivos de células de riñón de mono . El cultivo celular ha contribuido al desarrollo de vacunas para muchas enfermedades. [ 1 ]

Uso moderno

Células cultivadas que crecen en medio de cultivo

En el uso moderno, "cultivo de tejidos" generalmente se refiere al crecimiento de células de un tejido de un organismo multicelular in vitro . Estas células pueden ser células aisladas de un organismo donante ( células primarias ) o una línea celular inmortalizada . Las células se sumergen en un medio de cultivo que contiene nutrientes esenciales y fuentes de energía necesarias para su supervivencia. [ 16 ] Por lo tanto, en su sentido más amplio, "cultivo de tejidos" se usa a menudo indistintamente con "cultivo celular". Por otro lado, el significado estricto de "cultivo de tejidos" se refiere al cultivo de fragmentos de tejido, es decir, cultivo de explantes .

El cultivo de tejidos es una herramienta importante para el estudio de la biología de las células de organismos multicelulares. Proporciona un modelo in vitro del tejido en un entorno bien definido que puede manipularse y analizarse fácilmente. En el cultivo de tejidos animales, las células pueden cultivarse como monocapas bidimensionales (cultivo convencional) o dentro de andamios fibrosos o geles para obtener estructuras tridimensionales más naturalistas similares a los tejidos (cultivo 3D). Un informe de una subvención SBIR de los NIH de 1988 mostró que la electrohilatura podía utilizarse para producir andamios fibrosos poliméricos a escala nano y submicrométrica, específicamente destinados a su uso como sustratos celulares y tisulares in vitro . Este uso temprano de redes fibrosas electrohiladas para el cultivo celular y la ingeniería de tejidos mostró que varios tipos de células se adherirían y proliferarían sobre fibras de policarbonato. Se observó que, a diferencia de la morfología aplanada que se observa típicamente en el cultivo 2D, las células cultivadas en las fibras electrohiladas exhibían una morfología tridimensional más redondeada, generalmente observada en los tejidos in vivo . [ 17 ]

El cultivo de tejidos vegetales, en particular, se ocupa del crecimiento de plantas enteras a partir de pequeños trozos de tejido vegetal, cultivados en un medio. [ 18 ]

Conceptos en el cultivo de células de mamíferos

Aislamiento de células

Las células pueden aislarse de los tejidos para su cultivo ex vivo de varias maneras. Las células pueden purificarse fácilmente de la sangre; sin embargo, solo los glóbulos blancos son capaces de crecer en cultivo. Las células pueden aislarse de tejidos sólidos digiriendo la matriz extracelular con enzimas como la colagenasa , la tripsina o la pronasa , antes de agitar el tejido para liberar las células en suspensión. [ 19 ] [ 20 ] Alternativamente, se pueden colocar trozos de tejido en medios de cultivo , y las células que crecen están disponibles para su cultivo. Este método se conoce como cultivo de explantes .

Las células que se cultivan directamente a partir de un sujeto se conocen como células primarias. Con la excepción de algunas derivadas de tumores, la mayoría de los cultivos de células primarias tienen una vida útil limitada.

Una línea celular establecida o inmortalizada ha adquirido la capacidad de proliferar indefinidamente, ya sea por mutación aleatoria o por modificación deliberada, como la expresión artificial del gen de la telomerasa . Numerosas líneas celulares están bien establecidas como representativas de tipos celulares específicos .

Mantenimiento de células en cultivo

La mayoría de las células primarias aisladas experimentan un proceso de senescencia y dejan de dividirse después de un cierto número de duplicaciones de población, aunque generalmente conservan su viabilidad (lo que se conoce como el límite de Hayflick ).

Una botella de medio de cultivo celular DMEM

Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor que más varía en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento celular . [ 21 ] Las recetas de los medios de crecimiento pueden variar en pH , concentración de glucosa, factores de crecimiento y presencia de otros nutrientes. Los factores de crecimiento utilizados para complementar los medios a menudo se derivan del suero de sangre animal, como suero fetal bovino (FBS), suero de ternero bovino, suero equino y suero porcino. Una complicación de estos ingredientes derivados de la sangre es el potencial de contaminación del cultivo con virus o priones , particularmente en aplicaciones de biotecnología médica . La práctica actual es minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes siempre que sea posible y utilizar lisado de plaquetas humanas (hPL). [ 22 ] Esto elimina la preocupación de la contaminación cruzada de especies cuando se utiliza FBS con células humanas. El hPL ha surgido como una alternativa segura y confiable como reemplazo directo del FBS u otro suero animal. Además, se pueden utilizar medios químicamente definidos para eliminar cualquier rastro de suero (humano o animal), pero esto no siempre se puede lograr con diferentes tipos de células. Las estrategias alternativas incluyen obtener la sangre animal de países con un riesgo mínimo de EEB / EET , como Estados Unidos, Australia y Nueva Zelanda, [ 23 ] y utilizar concentrados de nutrientes purificados derivados del suero en lugar de suero animal completo para el cultivo celular. [ 24 ]

La densidad de siembra (número de células por volumen de medio de cultivo) desempeña un papel fundamental para algunos tipos celulares. Por ejemplo, una menor densidad de siembra hace que las células de la granulosa produzcan estrógeno, mientras que una mayor densidad de siembra las hace parecer células tecales lúteas productoras de progesterona . [ 25 ]

Las células pueden cultivarse en suspensión o en cultivos adherentes . [ 26 ] Algunas células viven naturalmente en suspensión, sin estar adheridas a una superficie, como las células presentes en el torrente sanguíneo. También existen líneas celulares modificadas para sobrevivir en cultivos en suspensión, lo que permite cultivarlas a una densidad mayor que la que se lograría en condiciones adherentes. Las células adherentes requieren una superficie, como plástico para cultivo de tejidos o microportadores , que puede estar recubierta con componentes de la matriz extracelular (como colágeno y laminina) para aumentar las propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación. La mayoría de las células derivadas de tejidos sólidos son adherentes. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotípico , que consiste en cultivar células en un entorno tridimensional (3D) en lugar de placas de cultivo bidimensionales. Este sistema de cultivo 3D es bioquímica y fisiológicamente más similar al tejido in vivo , pero su mantenimiento es técnicamente complejo debido a diversos factores (por ejemplo, la difusión). [ 27 ]

Medios basales para cultivo celular

Existen diferentes tipos de medios de cultivo celular que se utilizan de forma rutinaria en las ciencias biológicas, entre los que se incluyen los siguientes:

Componentes de los medios de cultivo celular

Condiciones típicas de crecimiento

Contaminación cruzada de líneas celulares

La contaminación cruzada de líneas celulares puede ser un problema para los científicos que trabajan con células cultivadas. [ 28 ] Los estudios sugieren que entre el 15 y el 20 % de las veces, las células utilizadas en experimentos han sido identificadas erróneamente o contaminadas con otra línea celular. [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] Incluso se han detectado problemas de contaminación cruzada de líneas celulares en líneas del panel NCI-60 , que se utilizan de forma rutinaria para estudios de cribado de fármacos. [ 32 ] [ 33 ] Los principales repositorios de líneas celulares, incluidos la American Type Culture Collection (ATCC), la European Collection of Cell Cultures (ECACC) y la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), han recibido envíos de líneas celulares de investigadores que fueron identificadas erróneamente por ellos. [ 32 ] [ 34 ] Dicha contaminación plantea un problema para la calidad de la investigación producida utilizando líneas de cultivo celular, y los principales repositorios ahora están autenticando todos los envíos de líneas celulares. [ 35 ] ATCC utiliza huellas dactilares de ADN de repeticiones cortas en tándem (STR) para autenticar sus líneas celulares. [ 36 ]

Para abordar este problema de contaminación cruzada de líneas celulares, se recomienda a los investigadores autenticar sus líneas celulares en un paso temprano para establecer su identidad. La autenticación debe repetirse antes de congelar las reservas de líneas celulares, cada dos meses durante el cultivo activo y antes de cualquier publicación de datos de investigación generados con dichas líneas celulares. Se utilizan muchos métodos para identificar líneas celulares, incluyendo análisis de isoenzimas , tipificación de antígenos leucocitarios humanos (HLA), análisis cromosómico, cariotipado, morfología y análisis STR . [ 36 ]

Un contaminante cruzado significativo de líneas celulares es la línea celular inmortal HeLa . La contaminación por HeLa se observó por primera vez a principios de la década de 1960 en cultivos no humanos en los EE. UU. En la década de 1970, se descubrió contaminación intraespecífica en diecinueve líneas celulares. En 1974, se descubrió que cinco líneas celulares humanas de la Unión Soviética eran HeLa. Un estudio posterior que analizó unas 50 líneas celulares indicó que la mitad tenía marcadores de HeLa, pero que la HeLa contaminante se había hibridado con las líneas celulares originales. Se ha informado de contaminación de células HeLa por gotitas de aire . Incluso Jonas Salk inyectó HeLa sin saberlo en sujetos humanos en un ensayo de vacunas en 1978. [ 37 ]

Otros problemas técnicos

A medida que las células continúan dividiéndose en cultivo, generalmente crecen hasta llenar el área o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:

La elección del medio de cultivo podría afectar la relevancia fisiológica de los hallazgos de los experimentos de cultivo celular debido a las diferencias en la composición y las concentraciones de nutrientes. [ 39 ] Recientemente se mostró un sesgo sistemático en los conjuntos de datos generados para las pantallas de silenciamiento génico CRISPR y RNAi , [ 40 ] y para el perfil metabólico de líneas celulares cancerosas . [ 39 ] El uso de un medio de crecimiento que represente mejor los niveles fisiológicos de nutrientes puede mejorar la relevancia fisiológica de los estudios in vitro y recientemente se desarrollaron tales tipos de medios, como Plasmax [ 41 ] y Human Plasma Like Medium (HPLM), [ 42 ] .

Manipulación de células cultivadas

Entre las manipulaciones comunes que se realizan en cultivos celulares se encuentran los cambios de medio, los subcultivos y la transfección celular. Estas se llevan a cabo generalmente mediante métodos de cultivo de tejidos que se basan en técnicas asépticas . La técnica aséptica tiene como objetivo evitar la contaminación con bacterias, levaduras u otras líneas celulares. Las manipulaciones se realizan típicamente en una cabina de bioseguridad o una cabina de flujo laminar para excluir microorganismos contaminantes. También se pueden añadir antibióticos (por ejemplo, penicilina y estreptomicina ) y antifúngicos (por ejemplo, anfotericina B y solución antibiótica-antimicótica ) al medio de cultivo.

A medida que las células experimentan procesos metabólicos, se produce ácido y el pH disminuye. A menudo, se añade un indicador de pH al medio para medir el agotamiento de nutrientes.

Cambios en los medios

En el caso de cultivos adherentes, el medio de cultivo se puede retirar directamente por aspiración y luego reemplazar. En cultivos no adherentes, el cambio de medio implica centrifugar el cultivo y resuspender las células en medio fresco.

Células de paso

El subcultivo (también conocido como división celular) consiste en transferir una pequeña cantidad de células a un nuevo recipiente. Las células pueden cultivarse durante más tiempo si se dividen regularmente, ya que esto evita la senescencia asociada con una densidad celular alta y prolongada. Los cultivos en suspensión se subcultivan fácilmente con una pequeña cantidad de cultivo que contiene unas pocas células diluidas en un mayor volumen de medio fresco. Para los cultivos adherentes, primero es necesario desprender las células; esto se suele hacer con una mezcla de tripsina - EDTA ; sin embargo, ahora existen otras mezclas de enzimas disponibles para este fin. Una pequeña cantidad de células desprendidas puede utilizarse para sembrar un nuevo cultivo. Algunos cultivos celulares, como las células RAW, se raspan mecánicamente de la superficie del recipiente con raspadores de goma.

Transfección y transducción

Otro método común para manipular células consiste en la introducción de ADN extraño mediante transfección . Esto se realiza a menudo para inducir la expresión de un gen de interés en las células. Más recientemente, la transfección de construcciones de ARN de interferencia (ARNi) se ha consolidado como un mecanismo eficaz para suprimir la expresión de un gen o proteína específicos. El ADN también puede insertarse en las células mediante virus, en métodos denominados transducción , infección o transformación . Los virus, como agentes parásitos, son idóneos para introducir ADN en las células, ya que esto forma parte de su proceso reproductivo habitual.

Líneas celulares humanas establecidas

Las células HeLa cultivadas se han teñido con Hoechst, lo que hace que sus núcleos se vuelvan azules, y son una de las primeras líneas celulares humanas descendientes de Henrietta Lacks , quien murió de cáncer de cuello uterino, del cual se originaron estas células.

Las líneas celulares de origen humano han sido objeto de cierta controversia en bioética , ya que pueden sobrevivir a su organismo de origen y utilizarse posteriormente en el descubrimiento de tratamientos médicos lucrativos. En una decisión pionera en este ámbito, la Corte Suprema de California dictaminó en el caso Moore v. Regents of the University of California que los pacientes humanos no tienen derechos de propiedad sobre las líneas celulares derivadas de órganos extraídos con su consentimiento. [ 43 ]

Es posible fusionar células normales con una línea celular inmortalizada . Este método se utiliza para producir anticuerpos monoclonales . En resumen, los linfocitos aislados del bazo (o posiblemente de la sangre) de un animal inmunizado se combinan con una línea celular de mieloma inmortalizada (linaje de células B) para producir un hibridoma que posee la especificidad de anticuerpos del linfocito primario y la inmortalidad del mieloma. Se utiliza un medio de cultivo selectivo (HA o HAT) para eliminar las células de mieloma no fusionadas; los linfocitos primarios mueren rápidamente en cultivo y solo sobreviven las células fusionadas. Estas se analizan para detectar la producción del anticuerpo requerido, generalmente en grupos inicialmente y luego después de la clonación individual.

cepas celulares

Una cepa celular se deriva de un cultivo primario o de una línea celular mediante la selección o clonación de células con propiedades o características específicas que deben definirse. Las cepas celulares son células adaptadas al cultivo, pero, a diferencia de las líneas celulares, tienen un potencial de división finito. Las células no inmortalizadas dejan de dividirse tras 40 a 60 duplicaciones de población [ 44 ] y, posteriormente, pierden su capacidad de proliferación (un evento determinado genéticamente conocido como senescencia). [ 45 ]

Aplicaciones del cultivo celular

El cultivo masivo de líneas celulares animales es fundamental para la fabricación de vacunas virales y otros productos biotecnológicos. El cultivo de células madre humanas se utiliza para aumentar el número de células y diferenciarlas en diversos tipos de células somáticas para trasplante. [ 46 ] El cultivo de células madre también se utiliza para obtener las moléculas y exosomas que liberan las células madre con fines de desarrollo terapéutico. [ 47 ]

Los productos biológicos producidos mediante la tecnología de ADN recombinante (ADNr) en cultivos de células animales incluyen enzimas , hormonas sintéticas , inmunobiológicos ( anticuerpos monoclonales , interleucinas , linfocinas ) y agentes anticancerígenos . Aunque muchas proteínas más simples pueden producirse utilizando ADNr en cultivos bacterianos, las proteínas más complejas que están glicosiladas (modificadas con carbohidratos) actualmente deben producirse en células animales. Las células de mamíferos aseguran que las proteínas expresadas se plieguen correctamente y posean glicosilación y modificaciones postraduccionales similares a las humanas. [ 48 ] Un ejemplo importante de una proteína tan compleja es la hormona eritropoyetina . El costo de cultivar células de mamíferos es alto, por lo que se está investigando para producir dichas proteínas complejas en células de insectos o en plantas superiores, el uso de células embrionarias individuales y embriones somáticos como fuente para la transferencia directa de genes mediante bombardeo de partículas, expresión génica transitoria y observación por microscopía confocal es una de sus aplicaciones. También permite confirmar el origen unicelular de los embriones somáticos y la asimetría de la primera división celular, que inicia el proceso.

El cultivo celular es también una técnica clave para la agricultura celular , cuyo objetivo es proporcionar tanto nuevos productos como nuevas formas de producir productos agrícolas existentes, como leche, carne (cultivada) , fragancias y cuerno de rinoceronte, a partir de células y microorganismos. Por lo tanto, se considera un medio para lograr una agricultura sin animales . Además, es una herramienta fundamental para la enseñanza de la biología celular. [ 49 ]

Cultivo celular en dos dimensiones

La investigación en ingeniería de tejidos , células madre y biología molecular implica principalmente cultivos de células en placas de plástico planas. Esta técnica se conoce como cultivo celular bidimensional (2D) y fue desarrollada por primera vez por Wilhelm Roux , quien, en 1885, extrajo una porción de la placa medular de un embrión de pollo y la mantuvo en solución salina tibia durante varios días en una placa de vidrio plana. Gracias al avance de la tecnología de polímeros , surgió la placa de plástico estándar actual para el cultivo celular 2D, comúnmente conocida como placa de Petri . A Julius Richard Petri , bacteriólogo alemán , se le atribuye generalmente esta invención mientras trabajaba como asistente de Robert Koch . Actualmente, varios investigadores también utilizan matraces de laboratorio , recipientes cónicos e incluso bolsas desechables como las que se usan en biorreactores de un solo uso .

Además de las placas de Petri, los científicos llevan mucho tiempo cultivando células en matrices de origen biológico, como colágeno o fibrina, y más recientemente, en hidrogeles sintéticos como poliacrilamida o PEG. Lo hacen para obtener fenotipos que no se expresan en sustratos rígidos convencionales. Existe un creciente interés en controlar la rigidez de la matriz , [ 50 ] un concepto que ha dado lugar a descubrimientos en campos como:

Cultivo celular en tres dimensiones

El cultivo celular en tres dimensiones ha sido promocionado como "La nueva dimensión de la biología". [ 65 ] En la actualidad, la práctica del cultivo celular sigue basándose en diversas combinaciones de estructuras celulares simples o múltiples en 2D. [ 66 ] Actualmente, hay un aumento en el uso de cultivos celulares 3D en áreas de investigación que incluyen el descubrimiento de fármacos , la biología del cáncer, la medicina regenerativa , la evaluación de nanomateriales y la investigación básica en ciencias de la vida . [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ] Los cultivos celulares 3D pueden cultivarse utilizando un andamio o matriz, o de manera libre de andamio. Los cultivos basados ​​en andamios utilizan una matriz 3D acelular o una matriz líquida. Los métodos libres de andamios normalmente se generan en suspensiones. [ 70 ] Hay una variedad de plataformas utilizadas para facilitar el crecimiento de estructuras celulares tridimensionales, incluyendo sistemas de andamiaje como matrices de hidrogel [ 71 ] y andamios sólidos, y sistemas sin andamiaje como placas de baja adhesión, levitación magnética facilitada por nanopartículas , [ 72 ] placas de gota colgante, [ 73 ] [ 74 ] y cultivo celular rotatorio. El cultivo de células en 3D conduce a una amplia variación en firmas de expresión génica y parcialmente imita los tejidos en estados fisiológicos. [ 75 ] Un modelo de cultivo celular 3D mostró un crecimiento celular similar al in vivo que un cultivo monocapa, y los tres cultivos fueron capaces de mantener el crecimiento celular. [ 76 ] A medida que se ha desarrollado el cultivo 3D, resulta tener un gran potencial para diseñar modelos de tumores e investigar la transformación maligna y la metástasis, los cultivos 3D pueden proporcionar una herramienta exagerada para comprender los cambios, las interacciones y la señalización celular. [ 77 ]

Cultivo celular 3D en andamios

Eric Simon, en un informe de una subvención SBIR de los NIH de 1988, demostró que la electrohilatura podía utilizarse para producir andamios fibrosos de poliestireno y policarbonato a escala nanométrica y submicrométrica, específicamente destinados a su uso como sustratos celulares in vitro . Este uso inicial de redes fibrosas electrohiladas para el cultivo celular y la ingeniería de tejidos demostró que varios tipos de células, incluyendo fibroblastos de prepucio humano (HFF), carcinoma humano transformado (HEp-2) y epitelio pulmonar de visón (MLE), se adherirían y proliferarían sobre las fibras de policarbonato. Se observó que, a diferencia de la morfología aplanada que se observa típicamente en cultivos 2D, las células cultivadas en las fibras electrohiladas exhibían una morfología tridimensional redondeada más histotípica, generalmente observada in vivo . [ 17 ]

Cultivo celular tridimensional en hidrogeles

Como la matriz extracelular (MEC) natural es importante en la supervivencia, proliferación, diferenciación y migración de las células, diferentes matrices de cultivo de hidrogel que imitan la estructura de la MEC natural se consideran enfoques potenciales para el cultivo celular similar al in vivo. [ 78 ] Los hidrogeles están compuestos de poros interconectados con alta retención de agua, lo que permite el transporte eficiente de sustancias como nutrientes y gases. Hay varios tipos diferentes de hidrogeles de materiales naturales y sintéticos disponibles para el cultivo celular 3D, incluidos hidrogeles de extracto de MEC animal, hidrogeles de proteínas, hidrogeles de péptidos, hidrogeles de polímeros e hidrogel de nanocelulosa a base de madera .

Cultivo celular 3D mediante levitación magnética

El método de cultivo celular tridimensional por levitación magnética (MLM) consiste en el crecimiento de tejido tridimensional mediante la inducción de células tratadas con nanopartículas magnéticas en campos magnéticos con variación espacial, utilizando imanes de neodimio. Este método promueve la interacción célula-célula al elevar las células hasta la interfaz aire/líquido de una placa de Petri estándar. Las nanopartículas magnéticas están compuestas por nanopartículas de óxido de hierro magnético, nanopartículas de oro y el polímero polilisina. El cultivo celular tridimensional es escalable, permitiendo cultivar desde 500 células hasta millones, o desde una sola placa hasta sistemas de alto rendimiento y bajo volumen.

Cultivo de tejidos e ingeniería tisular

El cultivo celular es un componente fundamental del cultivo de tejidos y la ingeniería de tejidos , ya que establece las bases para el crecimiento y mantenimiento de células in vitro . La principal aplicación del cultivo de células humanas se encuentra en la industria de células madre, donde las células madre mesenquimales se aíslan, cultivan y almacenan a largo plazo mediante criopreservación optimizada, para conservar su diferenciación estable y sus propiedades inmunomoduladoras tras la descongelación, de cara a futuras aplicaciones. La ingeniería de tejidos ofrece mejoras significativas en la atención médica de bajo coste para cientos de miles de pacientes anualmente.

Vacunas

Actualmente, las vacunas contra la poliomielitis , el sarampión , las paperas , la rubéola y la varicela se elaboran mediante cultivos celulares. Debido a la amenaza de la pandemia del virus H5N1 , el gobierno de Estados Unidos financia la investigación sobre el uso de cultivos celulares para la producción de vacunas contra la gripe . Entre las ideas innovadoras en este campo se incluyen las vacunas basadas en ADN recombinante , como la que utiliza el adenovirus humano (un virus del resfriado común) como vector, [ 79 ] [ 80 ] y nuevos adyuvantes. [ 81 ]

Cocultivo celular

La técnica de cocultivo se utiliza para estudiar la comunicación celular entre dos o más tipos de células en una placa o en una matriz 3D. El cultivo de diferentes células madre y la interacción de células inmunitarias pueden investigarse en un modelo in vitro similar al tejido biológico. Dado que la mayoría de los tejidos contienen más de un tipo de célula, es importante evaluar su interacción en un entorno de cultivo 3D para comprender mejor dicha interacción e introducir tejidos miméticos. Existen dos tipos de cocultivo: directo e indirecto. Mientras que la interacción directa implica que las células estén en contacto directo entre sí en el mismo medio de cultivo o matriz, la interacción indirecta implica diferentes entornos, lo que permite la participación de factores solubles y de señalización. [ 15 ] [ 82 ]

La diferenciación celular en modelos tisulares durante la interacción entre células puede estudiarse mediante el sistema de cocultivo para simular tumores cancerosos, evaluar el efecto de fármacos en ensayos terapéuticos y estudiar dicho efecto. El sistema de cocultivo en modelos 3D puede predecir la respuesta a la quimioterapia y la terapia endocrina si el microambiente define el tejido biológico para las células.

En ingeniería de tejidos se utiliza un método de cocultivo para generar la formación de tejido con múltiples células que interactúan directamente. [ 83 ]

Representación esquemática del cultivo en 2D, cultivo en 3D, órgano en un chip y estudio in vivo.

Cultivo celular en un dispositivo microfluídico

La técnica de microfluídica consiste en el desarrollo de sistemas capaces de realizar procesos en flujo, generalmente a escala micrométrica. Los chips microfluídicos, también conocidos como laboratorios en un chip, permiten llevar a cabo procedimientos y reacciones continuas con una cantidad reducida de reactivos y espacio. Estos sistemas posibilitan la identificación y el aislamiento de células y moléculas individuales cuando se combinan con ensayos biológicos adecuados y técnicas de detección de alta sensibilidad. [ 84 ] [ 85 ]

Órgano en un chip

Los sistemas OoC imitan y controlan el microambiente de las células mediante el cultivo de tejidos en microfluídica. Al combinar la ingeniería de tejidos, la fabricación de biomateriales y la biología celular, ofrecen la posibilidad de establecer un modelo biomimético para el estudio de enfermedades humanas en el laboratorio. En los últimos años, la ciencia del cultivo celular 3D ha experimentado un progreso significativo, lo que ha llevado al desarrollo de OoC. OoC se considera un paso preclínico que beneficia los estudios farmacéuticos, el desarrollo de fármacos y la modelización de enfermedades. [ 86 ] [ 87 ] OoC es una tecnología importante que puede salvar la brecha entre las pruebas en animales y los estudios clínicos, y, gracias a los avances científicos alcanzados, podría sustituir a los estudios in vivo para la administración de fármacos y los estudios fisiopatológicos. [ 88 ]

Cultivo de células no mamíferas

Además del cultivo de líneas celulares inmortalizadas bien establecidas, las células de explantes primarios de una gran variedad de organismos pueden cultivarse durante un período limitado antes de que se produzca la senescencia (véase el límite de Hayflick). Las células primarias cultivadas se han utilizado ampliamente en la investigación, como es el caso de los queratocitos de peces en estudios de migración celular. [ 89 ] [ 49 ] [ 90 ]

Métodos de cultivo de células vegetales

Los cultivos de células vegetales se suelen cultivar como cultivos en suspensión en un medio líquido o como cultivos de callos en un medio sólido. El cultivo de células vegetales indiferenciadas y callos requiere el equilibrio adecuado de las hormonas de crecimiento vegetal auxina y citoquinina .

cultivo de células de insectos

Las células derivadas de Drosophila melanogaster (principalmente, las células Schneider 2 ) pueden utilizarse para experimentos que serían difíciles de realizar en moscas o larvas vivas, como estudios bioquímicos o estudios con siRNA . Las líneas celulares derivadas del gusano cogollero Spodoptera frugiperda , incluidas Sf9 y Sf21 , y del gusano de la col Trichoplusia ni , células High Five , se utilizan comúnmente para la expresión de proteínas recombinantes mediante baculovirus . [ 91 ]

Métodos de cultivo de bacterias y levaduras

En el caso de las bacterias y las levaduras, generalmente se cultivan pequeñas cantidades de células en un soporte sólido que contiene nutrientes incorporados, normalmente un gel como el agar, mientras que los cultivos a gran escala se cultivan con las células suspendidas en un caldo nutritivo.

Métodos de cultivo viral

El cultivo de virus requiere el cultivo de células de origen mamífero, vegetal, fúngico o bacteriano como huéspedes para el crecimiento y la replicación del virus. En las condiciones adecuadas, se pueden generar virus completos de tipo salvaje , virus recombinantes o productos virales en tipos celulares distintos de sus huéspedes naturales. Dependiendo de la especie del virus, la infección y la replicación viral pueden provocar la lisis de la célula huésped y la formación de una placa viral .

Líneas celulares comunes

Líneas celulares humanas
Líneas celulares de primates
Líneas celulares de ratón
Líneas celulares de tumores de rata
Otras líneas celulares de mamíferos
  • BHK21 cell (Baby Hamster Kidney)
  • MDBK cell (Madin-Darby Bovine Kidney)
  • DF-1 cell (chicken fibroblast)
  • DogMDCK kidney epithelial
Other vertebrate cell lines
Plant cell lines
  • Tobacco BY-2 cells (kept as cell suspension culture, they are model system of plant cell)
  • Nicotiana tabaccum cv. Virginia Bright Italia 0 (VBI-0) cells, suspension culture
  • Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia (Col) cells, suspension culture
  • Arabidopsis thaliana, ecotype Landsberg erecta (Ler) cells, suspension culture

List of cell lines

Véase también

Referencias y notas

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  • Tabla de líneas celulares comunes de la 4ª edición de Alberts.
  • Células cancerosas en cultivo
  • Evolución de las superficies de cultivo celular
  • Versión hipertextual de la base de datos de líneas celulares
  • Aplicaciones de cultivo celular archivadas el 13 de marzo de 2017 en Wayback Machine : recursos que incluyen notas de aplicación y protocolos para crear un entorno ideal para el cultivo de células desde el principio.
  • Fundamentos del cultivo celular : Introducción al cultivo celular, que abarca temas como la configuración del laboratorio, la seguridad y la técnica aséptica, incluyendo protocolos básicos de cultivo celular y formación en vídeo.
  • Base de datos de personalidades destacadas en el cultivo celular e investigación relacionada.
  • Repositorios celulares de Coriell
  • Introducción al cultivo celular. Archivado el 11 de septiembre de 2017 en Wayback Machine. Este seminario web presenta la historia, la teoría, las técnicas básicas y los posibles inconvenientes del cultivo de células de mamíferos.
  • El Centro Nacional de Ciencias Celulares (NCCS), Pune, India; repositorio nacional de líneas celulares/hibridomas, etc.
  • Public Health England archivado el 7 de junio de 2022 en Wayback Machine , Colecciones Culturales de Public Health England (ECACC)