reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) es un método de laboratorio ampliamente utilizado para amplificar rápidamente copias de secuencias de ADN específicas, lo que permite un estudio detallado. La PCR fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en Cetus Corporation . Mullis y el bioquímico Michael Smith , quien había desarrollado otros métodos esenciales para manipular el ADN, recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993. ^{[ 1 ]}

La PCR es fundamental para muchos de los procedimientos utilizados en pruebas genéticas , investigación, incluyendo el análisis de muestras antiguas de ADN , e identificación de agentes infecciosos. Mediante la PCR, se amplifican exponencialmente copias de cantidades muy pequeñas de secuencias de ADN en una serie de ciclos de cambios de temperatura. La PCR es ahora una técnica común y a menudo indispensable en la investigación de laboratorios médicos para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo la investigación biomédica y la ciencia forense . ^{[ 2 ] [ 3 ]}

La mayoría de los métodos de PCR se basan en el ciclado térmico . El ciclado térmico expone los reactivos a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento para permitir diferentes reacciones dependientes de la temperatura, específicamente, la desnaturalización del ADN y la replicación del ADN mediada por enzimas . La PCR emplea dos reactivos principales: cebadores (que son fragmentos cortos de ADN monocatenario conocidos como oligonucleótidos , cuya secuencia es complementaria a la región de ADN objetivo) y una ADN polimerasa termoestable . En el primer paso de la PCR, las dos hebras de la doble hélice del ADN se separan físicamente a alta temperatura en un proceso llamado desnaturalización de ácidos nucleicos . En el segundo paso, la temperatura disminuye y los cebadores se unen a las secuencias complementarias del ADN. Las dos hebras de ADN se convierten entonces en moldes para que la ADN polimerasa ensamble enzimáticamente una nueva hebra de ADN a partir de nucleótidos libres , los bloques de construcción del ADN. A medida que avanza la PCR, el ADN generado se utiliza a su vez como molde para la replicación, poniendo en marcha una reacción en cadena en la que el molde de ADN original se amplifica exponencialmente . ^{[ 4 ]}

Casi todas las aplicaciones de PCR emplean una ADN polimerasa termoestable , como la polimerasa Taq , una enzima aislada originalmente de la bacteria termófila Thermus aquaticus . Si la polimerasa utilizada fuera sensible al calor, se desnaturalizaría a las altas temperaturas de la etapa de desnaturalización . Antes del uso de la polimerasa Taq , la ADN polimerasa debía añadirse manualmente en cada ciclo, lo que resultaba un proceso tedioso y costoso. ^{[ 5 ]}

Las aplicaciones de la técnica incluyen la clonación de ADN para secuenciación , clonación y manipulación de genes, mutagénesis genética; construcción de filogenias basadas en ADN o análisis funcional de genes ; diagnóstico y seguimiento de trastornos genéticos ; amplificación de ADN antiguo; ^{[ 6 ]} análisis de huellas genéticas para la elaboración de perfiles de ADN (por ejemplo, en ciencias forenses y pruebas de paternidad ); y detección de patógenos en pruebas de ácidos nucleicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas .

La PCR amplifica una región específica de una cadena de ADN (el ADN diana). La mayoría de los métodos de PCR amplifican fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilobases (kpb) de longitud, aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kpb. ^{[ 7 ]} La cantidad de producto amplificado está determinada por los sustratos disponibles en la reacción, que se vuelven limitantes a medida que avanza la reacción. ^{[ 8 ]}

Una configuración básica de PCR requiere varios componentes y reactivos, ^{[ 9 ]} entre los que se incluyen:

• una plantilla de ADN que contiene la región objetivo de ADN que se va a amplificar
• Una ADN polimerasa ; una enzima que polimeriza nuevas cadenas de ADN; la polimerasa Taq termorresistente es especialmente común, ^{[ 10 ]} ya que es más probable que permanezca intacta durante el proceso de desnaturalización del ADN a alta temperatura. La polimerasa Pfu es una polimerasa termorresistente con mayor precisión en comparación con Taq debido a su capacidad de corrección de errores, pero funciona más lentamente. Agregar una pequeña cantidad de Pfu a Taq combina los beneficios de ambas. ^{[ 11 ]}
• Dos cebadores de ADN que son complementarios a los extremos 3' (tres prima) de cada una de las hebras con sentido y antisentido del ADN diana (la ADN polimerasa solo puede unirse y elongarse a partir de una región de ADN de doble cadena; sin cebadores, no hay un sitio de iniciación de doble cadena al que la polimerasa pueda unirse); ^{[ 12 ]} Los cebadores específicos que son complementarios a la región diana del ADN se seleccionan de antemano y, a menudo, se fabrican a medida en un laboratorio o se compran a proveedores bioquímicos comerciales.
• Los desoxinucleósido trifosfatos , o dNTP, son los componentes básicos a partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN.
• una solución tampón que proporciona un entorno químico adecuado para la actividad y estabilidad óptimas de la ADN polimerasa.
• cationes bivalentes , típicamenteiones de magnesio (Mg) o manganeso (Mn); Mg ²⁺ es el más común, pero Mn ²⁺ puede usarse para mutagénesis de ADN mediada por PCR , ya que una mayor concentración de Mn ²⁺ aumenta la tasa de error durante la síntesis de ADN; ^{[ 13 ]} y cationes monovalentes , típicamenteiones de potasio (K) ^{[ 14 ]}

La reacción se suele llevar a cabo en un volumen de 10–200 μL en tubos de reacción pequeños ( de 0,2–0,5 mL) en un termociclador . El termociclador calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en cada etapa de la reacción (véase más adelante). Muchos termocicladores modernos utilizan un dispositivo Peltier , que permite calentar y enfriar el bloque que contiene los tubos de PCR simplemente invirtiendo la corriente eléctrica del dispositivo. Los tubos de reacción de paredes delgadas permiten una conductividad térmica favorable para lograr un rápido equilibrio térmico. La mayoría de los termocicladores tienen tapas calefactadas para evitar la condensación en la parte superior del tubo de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecen de tapa calefactada requieren una capa de aceite sobre la mezcla de reacción o una bola de cera dentro del tubo. ^{[ 15 ]}  

Procedimiento

Normalmente, la PCR consiste en una serie de 20 a 40 cambios de temperatura repetidos, llamados ciclos térmicos, y cada ciclo suele constar de dos o tres pasos de temperatura discretos (véase la figura siguiente). El ciclo suele ir precedido de un único paso de temperatura a una temperatura muy alta (> 90 °C (194 °F) ), y seguido de un mantenimiento al final para la extensión del producto final o un breve almacenamiento. Las temperaturas utilizadas y el tiempo de aplicación en cada ciclo dependen de diversos parámetros, como la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTPs en la reacción, y la temperatura de fusión ( T _m ) de los cebadores. ^{[ 16 ]} Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son : inicialización, hibridación y extensión.   

• Inicialización : Este paso solo es necesario para las ADN polimerasas que requieren activación térmica mediante PCR de inicio en caliente . ^{[ 17 ]} Consiste en calentar la cámara de reacción a una temperatura de 94–96 °C (201–205 °F) , o 98 °C (208 °F) si se utilizan polimerasas extremadamente termoestables, y luego mantenerla durante 1–10 minutos. ^{[ 4 ]}    
• Desnaturalización : Este paso es el primer evento del ciclo regular y consiste en calentar la cámara de reacción a 94–98 °C (201–208 °F) durante 20–30 segundos. Esto provoca la fusión , o desnaturalización, del ADN molde de doble cadena al romper los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias, lo que da como resultado dos moléculas de ADN de cadena simple.  
• Recocido : En el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 50–65 °C (122–149 °F) durante 20–40 segundos, lo que permite el recocido de los cebadores a cada una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos monocatenarios que contienen la región objetivo. Los cebadores son secuencias monocatenarias en sí mismas, pero son mucho más cortas que la longitud de la región objetivo, complementando solo secuencias muy cortas en el extremo 3' de cada hebra. ^{[ 18 ]}  

Es fundamental determinar la temperatura adecuada para la etapa de hibridación, ya que la eficiencia y la especificidad se ven fuertemente afectadas por ella. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja para permitir la hibridación del cebador a la hebra, pero lo suficientemente alta para que la hibridación sea específica; es decir, el cebador debe unirse únicamente a una parte perfectamente complementaria de la hebra, y en ningún otro lugar. Si la temperatura es demasiado baja, el cebador puede unirse de forma imperfecta. Si es demasiado alta, puede que no se una en absoluto. Una temperatura de hibridación típica es de aproximadamente 3 a 5  °C por debajo de la T _m de los cebadores utilizados. Los enlaces de hidrógeno estables entre bases complementarias se forman solo cuando la secuencia del cebador coincide muy estrechamente con la secuencia del molde. Durante esta etapa, la polimerasa se une al híbrido cebador-molde y comienza la formación del ADN. ^{[ 19 ]}

• Extensión/Elongación : La temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; la temperatura de actividad óptima para la ADN polimerasa termoestable Taq es aproximadamente 75–80 °C ⁽ 167–176 °F) [ ^{20 ] [ 21 ]} aunque comúnmente se usa una temperatura de 72 °C (162 °F) con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena molde de ADN agregando dNTP libres de la mezcla de reacción que son complementarios al molde en la dirección 5'-a-3' , condensando el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxi en el extremo de la cadena de ADN naciente (en elongación). El tiempo preciso requerido para la elongación depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región objetivo de ADN a amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no existen limitaciones debidas a sustratos o reactivos limitantes), en cada paso de extensión/elongación, el número de secuencias de ADN diana se duplica. Con cada ciclo sucesivo, las hebras molde originales más todas las hebras recién generadas se convierten en hebras molde para la siguiente ronda de elongación, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) de la región diana de ADN específica. ^{[ 22 ]}    

Los procesos de desnaturalización, hibridación y elongación constituyen un ciclo único. Se requieren múltiples ciclos para amplificar el ADN diana a millones de copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas tras un número determinado de ciclos es 2ⁿ ^, donde n es el número de ciclos. Por lo tanto, una reacción programada para 30 ciclos produce ^2³⁰ , o 1.073.741.824 copias de la región diana de ADN bicatenario original.

• Elongación final : Este paso único es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70–74 °C (158–165 °F) (el rango de temperatura requerido para la actividad óptima de la mayoría de las polimerasas utilizadas en la PCR) durante 5–15 minutos después del último ciclo de PCR para asegurar que cualquier ADN monocatenario restante se haya elongado completamente.  
• Mantenimiento final : El paso final enfría la cámara de reacción a 4–15 °C (39–59 °F) durante un tiempo indefinido y puede emplearse para el almacenamiento a corto plazo de los productos de PCR.  

Para comprobar si la PCR generó correctamente la región de ADN objetivo prevista (también conocida como amplicón o amplímero ), se puede utilizar la electroforesis en gel de agarosa para separar los productos de la PCR según su tamaño. El tamaño de los productos de la PCR se determina comparándolos con una escalera de ADN , un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de ADN de tamaños conocidos y que migra en el gel junto con los productos de la PCR.

Etapas

Al igual que en otras reacciones químicas, la velocidad y la eficiencia de la PCR se ven afectadas por factores limitantes. Por lo tanto, todo el proceso de PCR se puede dividir en tres etapas según el progreso de la reacción:

• Amplificación exponencial : En cada ciclo, la cantidad de producto se duplica (suponiendo una eficiencia de reacción del 100%). Después de 30 ciclos, una sola copia de ADN puede multiplicarse hasta alcanzar 1.000.000.000 (mil millones) de copias. En cierto modo, se manipula la replicación de una hebra discreta de ADN en un tubo bajo condiciones controladas. ^{[ 23 ]} La reacción es muy sensible: solo se requieren cantidades mínimas de ADN.
• Etapa de estabilización : La reacción se ralentiza a medida que la ADN polimerasa pierde actividad y el consumo de reactivos, como los dNTP y los cebadores, provoca que estos se vuelvan más limitados.
• Meseta : No se acumula más producto debido al agotamiento de los reactivos y la enzima.

En la práctica, la PCR puede fallar por diversas razones, como sensibilidad o contaminación. ^{[ 24 ] [ 25 ]} La contaminación con ADN extraño puede generar productos erróneos y se aborda con protocolos y procedimientos de laboratorio que separan las mezclas previas a la PCR de posibles contaminantes de ADN. ^{[ 9 ]} Por ejemplo, si se analiza ADN de la escena de un crimen, una sola molécula de ADN del personal del laboratorio podría amplificarse y desviar la investigación. Por lo tanto, las áreas de preparación de la PCR se separan del análisis o purificación de otros productos de PCR, se utiliza material plástico desechable y la superficie de trabajo entre las preparaciones de reacción debe limpiarse a fondo.

La especificidad se puede ajustar mediante las condiciones experimentales para evitar la generación de productos espurios. Las técnicas de diseño de cebadores son importantes para mejorar el rendimiento de los productos de PCR y evitar la formación de productos inespecíficos. El uso de componentes de tampón alternativos (como DMSO para ayudar a desnaturalizar el ADN) o enzimas polimerasas puede ayudar con la amplificación de regiones de ADN largas o problemáticas. Por ejemplo, se dice que la polimerasa Q5 es aproximadamente 280 veces menos propensa a errores que la polimerasa Taq y más procesiva. ^{[ 26 ] [ 27 ]} Tanto los parámetros de ejecución (por ejemplo, temperatura y duración de los ciclos) como la adición de reactivos, como la formamida , pueden aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. ^{[ 28 ]} Se pueden realizar simulaciones por computadora de resultados teóricos de PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño de cebadores. ^{[ 29 ]}

La PCR presenta varias ventajas. Es relativamente sencilla de comprender y utilizar, y produce resultados rápidamente. La técnica es altamente sensible y tiene el potencial de generar millones o miles de millones de copias de un producto específico para su secuenciación, clonación y análisis. La qRT-PCR comparte las mismas ventajas que la PCR, con la ventaja adicional de la cuantificación del producto sintetizado. Por lo tanto, resulta útil para analizar alteraciones en los niveles de expresión génica en tumores, microorganismos u otras enfermedades. ^{[ 36 ]}

La PCR es una herramienta de investigación muy potente y práctica. Mediante la PCR se están descifrando las etiologías desconocidas de muchas enfermedades. Esta técnica puede ayudar a identificar la secuencia de virus previamente desconocidos relacionados con los ya conocidos, lo que nos permite comprender mejor la enfermedad en sí. Si se logra simplificar aún más el procedimiento y desarrollar sistemas de detección no radiométricos sensibles, la PCR ocupará un lugar destacado en el laboratorio clínico durante los próximos años. ^{[ 23 ]}

Una limitación importante de la PCR es que se necesita información previa sobre la secuencia objetivo para generar los cebadores que permitirán su amplificación selectiva. ^{[ 36 ]} Esto significa que, por lo general, los usuarios de PCR deben conocer la(s) secuencia(s) precisa(s) corriente arriba de la región objetivo en cada una de las dos plantillas monocatenarias para asegurar que la ADN polimerasa se una correctamente a los híbridos cebador-plantilla y posteriormente genere toda la región objetivo durante la síntesis de ADN. ^{[ 53 ] [ 54 ]} La limitación se compensa cuando se utilizan técnicas de ADN amplificado arbitrariamente, como la huella genética de amplificación de ADN (DAF) ^{[ 55 ]} o la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD). ^{[ 56 ]} Estos métodos de perfilado de ADN utilizan cebadores arbitrarios en reacciones de PCR que no requieren conocimiento de la secuencia.

Al igual que todas las enzimas, las ADN polimerasas también son propensas a errores, lo que a su vez provoca mutaciones en los fragmentos de PCR que se generan. ^{[ 57 ]}

Otra limitación de la PCR es que incluso la menor cantidad de ADN contaminante puede amplificarse, lo que da lugar a resultados erróneos o ambiguos. Para minimizar la posibilidad de contaminación, los investigadores deben reservar salas separadas para la preparación de reactivos , la PCR y el análisis del producto. Los reactivos deben dispensarse en alícuotas de un solo uso . Se deben utilizar de forma rutinaria pipetas con émbolos desechables y puntas de pipeta extralargas. ^{[ 23 ]} Además, se recomienda asegurar que la configuración del laboratorio siga un flujo de trabajo unidireccional. Ningún material o reactivo utilizado en las salas de PCR y análisis debe llevarse a la sala de preparación de PCR sin una descontaminación completa. ^{[ 58 ]}

Las muestras ambientales que contienen ácidos húmicos pueden inhibir la amplificación por PCR y conducir a resultados inexactos. ^{[ 59 ]}

• PCR alelo-específica o sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) : una técnica de diagnóstico o clonación basada en variaciones de un solo nucleótido (SNV, que no deben confundirse con SNP ) (diferencias de una sola base en un paciente). Cualquier mutación que implique un cambio de una sola base puede detectarse mediante este sistema. Requiere conocimiento previo de una secuencia de ADN, incluidas las diferencias entre alelos , y utiliza cebadores cuyos extremos 3' abarcan el SNV (generalmente se incorpora un tampón de pares de bases alrededor del SNV). ^{[ 60 ]} La amplificación por PCR en condiciones estrictas es mucho menos eficiente en presencia de un desajuste entre la plantilla y el cebador, por lo que una amplificación exitosa con un cebador específico para SNP indica la presencia del SNP específico o pequeñas deleciones en una secuencia. ^{[ 61 ]} Consulte genotipado de SNP para obtener más información.
• La amplificación arbitraria de ADN (RAPD) es una familia de métodos de perfilado de ADN que utilizan cebadores arbitrarios para amplificar ADN de secuencia desconocida mediante PCR. Entre ellos se incluyen   la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), la PCR con cebadores arbitrarios (AP-PCR) y la huella genética por amplificación de ADN (DAF). La naturaleza arbitraria de los cebadores utilizados en estos métodos se dirige a regiones anónimas de un genoma o una construcción genética, generando huellas genéticas únicas. Esto distingue a estas técnicas de las metodologías de PCR estándar, que requieren conocer la secuencia objetivo.
• PCR de ensamblaje o ensamblaje por ciclo de polimerasa (PCA) : síntesis artificial de secuencias largas de ADN mediante PCR aplicada a un conjunto de oligonucleótidos largos con segmentos cortos superpuestos. Los oligonucleótidos alternan entre las direcciones sentido y antisentido, y los segmentos superpuestos determinan el orden de los fragmentos de PCR, produciendo selectivamente el producto final de ADN largo. ^{[ 62 ]}
• PCR asimétrica : amplifica preferentemente una hebra de ADN en una plantilla de ADN de doble hebra. Se utiliza en secuenciación y sondas de hibridación donde se requiere la amplificación de solo una de las dos hebras complementarias. La PCR se lleva a cabo como de costumbre, pero con un gran exceso del cebador para la hebra que se desea amplificar. Debido a la lenta amplificación ( aritmética ) posterior en la reacción, una vez que se ha agotado el cebador limitante, se requieren ciclos adicionales de PCR. ^{[ 63 ]} Una modificación reciente de este proceso, conocida como PCR lineal despuésde la exponencial ( LATE-PCR), utiliza un cebador limitante con una temperatura de fusión ( Tm ) más alta que el cebador en exceso para mantener _la eficiencia de la reacción a medida que la concentración del cebador limitante disminuye a mitad de la reacción. ^{[ 64 ]}
• PCR convectiva : una forma pseudo-isotérmica de realizar PCR. En lugar de calentar y enfriar repetidamente la mezcla de PCR, la solución se somete a un gradiente térmico. El flujo convectivo resultante, impulsado por la inestabilidad térmica, redistribuye automáticamente los reactivos de PCR entre las regiones calientes y frías, permitiendo así la PCR. ^{[ 65 ]} Parámetros como las condiciones de contorno térmicas y la geometría del recinto de PCR pueden optimizarse para obtener una PCR robusta y rápida aprovechando la aparición de campos de flujo caóticos. ^{[ 66 ]} Esta configuración de PCR de flujo convectivo reduce significativamente el consumo de energía del dispositivo y el tiempo de operación.
• PCR dirigida : un método altamente paralelo para recuperar moléculas de ADN precisas para la síntesis de genes. Una biblioteca compleja de moléculas de ADN se modifica con etiquetas flanqueantes únicas antes de la secuenciación masivamente paralela. Los cebadores dirigidos a las etiquetas permiten entonces la recuperación de moléculas con las secuencias deseadas mediante PCR. ^{[ 67 ]}
• PCR digital (dPCR) : se utiliza para medir la cantidad de una secuencia de ADN objetivo en una muestra de ADN. La muestra de ADN se diluye considerablemente, de modo que, tras realizar varias reacciones de PCR en paralelo, algunas no detectan ninguna molécula del ADN objetivo. La concentración de ADN objetivo se calcula a partir de la proporción de resultados negativos. De ahí su nombre: «PCR digital».
• Amplificación dependiente de helicasa : similar a la PCR tradicional, pero utiliza una temperatura constante en lugar de ciclos de desnaturalización y hibridación/extensión. La helicasa de ADN , una enzima que desenrolla el ADN, se utiliza en lugar de la desnaturalización térmica. ^{[ 68 ]}
• PCR de inicio en caliente : una técnica que reduce la amplificación no específica durante las etapas iniciales de la PCR. Puede realizarse manualmente calentando los componentes de la reacción a la temperatura de desnaturalización (p. ej., 95 °C) antes de añadir la polimerasa. ^{[ 69 ]} Se han desarrollado sistemas enzimáticos especializados que inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea por la unión de un anticuerpo ^{[ 17 ] [ 70 ]} o por la presencia de inhibidores unidos covalentemente que se disocian solo después de un paso de activación a alta temperatura. La PCR de inicio en caliente/finalización en frío se logra con nuevas polimerasas híbridas que son inactivas a temperatura ambiente y se activan instantáneamente a la temperatura de elongación.
• La PCR in silico (PCR digital, PCR virtual, PCR electrónica, e-PCR) se refiere a las herramientas computacionales utilizadas para calcular los resultados teóricos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando un conjunto dado de cebadores ( sondas ) para amplificar secuencias de ADN de un genoma o transcriptoma secuenciado. La PCR in silico se propuso como una herramienta didáctica para la biología molecular. ^{[ 71 ]}
• PCR específica de secuencias intersecuenciales (ISSR): un método de PCR para la identificación genética que amplifica regiones entre repeticiones de secuencias simples para producir una huella genética única de longitudes de fragmentos amplificados. ^{[ 72 ]}
• PCR inversa : se utiliza comúnmente para identificar las secuencias flanqueantes alrededor de los insertos genómicos . Implica una serie de digestiones de ADN y autoligación , lo que da como resultado secuencias conocidas en ambos extremos de la secuencia desconocida. ^{[ 73 ]}
• PCR mediada por ligación : utiliza pequeños enlaces de ADN ligados al ADN de interés y múltiples cebadores que se unen a los enlaces de ADN; se ha utilizado para la secuenciación de ADN , el análisis del genoma y el análisis de huellas de ADN . ^{[ 74 ]}
• PCR específica de metilación (MSP): desarrollada por Stephen Baylin y James G. Herman en la Facultad de Medicina Johns Hopkins, ^{[ 75 ]} y se utiliza para detectar la metilación de islas CpG en el ADN genómico. El ADN se trata primero con bisulfito de sodio, que convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo, que es reconocido por los cebadores de PCR como timina. Luego se realizan dos PCR en el ADN modificado, utilizando conjuntos de cebadores idénticos excepto en las islas CpG dentro de las secuencias de los cebadores. En estos puntos, un conjunto de cebadores reconoce el ADN con citosinas para amplificar el ADN metilado, y otro conjunto reconoce el ADN con uracilo o timina para amplificar el ADN no metilado. La MSP mediante qPCR también se puede realizar para obtener información cuantitativa en lugar de cualitativa sobre la metilación.
• PCR con miniprimers : utiliza una polimerasa termoestable (S-Tbr) que puede extenderse a partir de cebadores cortos ("smalligos") de tan solo 9 o 10 nucleótidos. Este método permite dirigir la PCR a regiones de unión de cebadores más pequeñas y se utiliza para amplificar secuencias de ADN conservadas, como el gen del ARNr 16S (o el 18S eucariota). ^{[ 76 ]}
• Amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple ( MLPA ): permite amplificar múltiples objetivos con un solo par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR múltiple (véase más abajo).
• La PCR múltiple consiste en el uso de múltiples conjuntos de cebadores en una sola mezcla de PCR para producir amplicones de diferentes tamaños, específicos para distintas secuencias de ADN. Al analizar varios genes simultáneamente, se puede obtener información adicional en una sola prueba, información que de otro modo requeriría varias veces más reactivos y más tiempo. Las temperaturas de hibridación de cada conjunto de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente en una sola reacción, así como el tamaño de los amplicones. Es decir, la longitud de sus pares de bases debe ser lo suficientemente diferente como para formar bandas distintas al visualizarlas mediante electroforesis en gel .
• PCR asistida por nanopartículas (nanoPCR) : algunas nanopartículas (NP) pueden mejorar la eficiencia de la PCR (de ahí su nombre nanoPCR), e incluso algunas pueden superar a los potenciadores de PCR originales. Se ha informado que los puntos cuánticos (QD) pueden mejorar la especificidad y la eficiencia de la PCR. Los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) y los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNT) son eficientes para mejorar la amplificación de PCR de larga duración. El nanopulvo de carbono (CNP) puede mejorar la eficiencia de la PCR repetida y la PCR de larga duración, mientras que se ha descubierto que el óxido de zinc , el dióxido de titanio y las NP de Ag aumentan el rendimiento de la PCR. Datos previos indicaron que las NP no metálicas mantuvieron una fidelidad de amplificación aceptable. Dado que muchas NP son capaces de mejorar la eficiencia de la PCR, es evidente que existe un gran potencial para las mejoras tecnológicas y el desarrollo de productos de nanoPCR. ^{[ 77 ] [ 78 ]}
• PCR anidada : aumenta la especificidad de la amplificación del ADN al reducir el ruido de fondo debido a la amplificación inespecífica. Se utilizan dos pares de cebadores en dos PCR sucesivas. En la primera reacción, se utiliza un par de cebadores para generar productos de ADN que, además del objetivo deseado, pueden contener fragmentos de ADN amplificados de forma inespecífica. Estos productos se utilizan posteriormente en una segunda PCR con un par de cebadores cuyos sitios de unión son total o parcialmente diferentes y se encuentran en la región 3' de cada uno de los cebadores utilizados en la primera reacción. La PCR anidada suele ser más eficaz que la PCR convencional para amplificar específicamente fragmentos largos de ADN, pero requiere un conocimiento más detallado de las secuencias objetivo.
• PCR de extensión por solapamiento o empalme por extensión por solapamiento (SOEing) : una técnica de ingeniería genética que se utiliza para unir dos o más fragmentos de ADN que contienen secuencias complementarias. Se emplea para unir fragmentos de ADN que contienen genes, secuencias reguladoras o mutaciones; la técnica permite la creación de construcciones de ADN específicas y largas. También puede introducir deleciones, inserciones o mutaciones puntuales en una secuencia de ADN. ^{[ 79 ] [ 80 ]}
• PAN-AC : utiliza condiciones isotérmicas para la amplificación y puede utilizarse en células vivas. ^{[ 81 ] [ 82 ]}
• PAN-PCR : Un método computacional para diseñar ensayos de tipificación bacteriana basados ​​en datos de secuenciación del genoma completo. ^{[ 83 ]}
• PCR cuantitativa (qPCR): se utiliza para medir la cantidad de una secuencia diana (generalmente en tiempo real). Mide cuantitativamente las cantidades iniciales de ADN, ADNc o ARN. La PCR cuantitativa se utiliza comúnmente para determinar si una secuencia de ADN está presente en una muestra y el número de copias de la misma. La PCR cuantitativa tiene un grado de precisión muy alto. Los métodos de PCR cuantitativa utilizan colorantes fluorescentes, como Sybr Green, EvaGreen o sondas de ADN que contienen fluoróforos , como TaqMan , para medir la cantidad de producto amplificado en tiempo real. A veces también se abrevia como RT-PCR ( PCR en tiempo real ), pero esta abreviatura solo debe usarse para la PCR de transcripción inversa . qPCR es la abreviatura adecuada para PCR cuantitativa (PCR en tiempo real).
• PCR de complemento inverso (RC-PCR): Permite la adición independiente de dominios funcionales o secuencias específicas a cualquiera de los extremos del amplicón generado en una única reacción en tubo cerrado. Este método genera cebadores específicos para la secuencia diana dentro de la reacción mediante la interacción de cebadores universales (que contienen las secuencias o dominios deseados) y sondas RC.
• PCR de transcripción inversa (RT-PCR) : para amplificar ADN a partir de ARN. La transcriptasa inversa transcribe el ARN en ADNc , que luego se amplifica mediante PCR. La RT-PCR se utiliza ampliamente en el análisis de expresión génica para determinar la expresión de un gen o identificar la secuencia de un transcrito de ARN, incluyendo los sitios de inicio y terminación de la transcripción. Si se conoce la secuencia de ADN genómico de un gen, la RT-PCR puede utilizarse para mapear la ubicación de los exones e intrones en el gen. El extremo 5' de un gen (que corresponde al sitio de inicio de la transcripción) se identifica típicamente mediante RACE-PCR ( Amplificación Rápida de los Extremos del ADNc ).
• PCR dependiente de RNasa H (rhPCR): una modificación de la PCR que utiliza cebadores con un bloque de extensión 3' que puede eliminarse mediante una enzima RNasa HII termoestable. Este sistema reduce los dímeros de cebadores y permite realizar reacciones multiplexadas con un mayor número de cebadores. ^{[ 84 ]}
• PCR con cebador único específico (SSP-PCR): permite la amplificación de ADN de doble cadena incluso cuando la información de secuencia solo está disponible en un extremo. Este método permite la amplificación de genes para los que solo se dispone de información de secuencia parcial y permite el rastreo genómico unidireccional desde regiones conocidas hacia regiones desconocidas del cromosoma. ^{[ 85 ]}
• PCR en fase sólida : abarca múltiples significados, incluyendo la amplificación de polonias (donde las colonias de PCR se derivan en una matriz de gel, por ejemplo), PCR puente ^{[ 86 ]} (los cebadores están unidos covalentemente a una superficie de soporte sólido), PCR en fase sólida convencional (donde la PCR asimétrica se aplica en presencia de un soporte sólido que contiene un cebador con una secuencia que coincide con uno de los cebadores acuosos) y PCR en fase sólida mejorada ^{[ 87 ]} (donde la PCR en fase sólida convencional se puede mejorar empleando un cebador de soporte sólido anidado y de alta Tm con la aplicación opcional de un "paso" térmico para favorecer el cebado del soporte sólido).
• PCR suicida : se utiliza típicamente en paleogenética u otros estudios donde evitar falsos positivos y asegurar la especificidad del fragmento amplificado es la máxima prioridad. Se describió originalmente en un estudio para verificar la presencia del microbio Yersinia pestis en muestras dentales obtenidas de tumbas del siglo XIV de personas supuestamente muertas por la peste durante la epidemia medieval de la Peste Negra . ^{[ 88 ]} El método prescribe el uso de cualquier combinación de cebadores solo una vez en una PCR (de ahí el término "suicidio"), que nunca debe haberse utilizado en ninguna reacción de PCR de control positivo, y los cebadores siempre deben dirigirse a una región genómica nunca antes amplificada en el laboratorio utilizando este o cualquier otro conjunto de cebadores. Esto asegura que no haya ADN contaminante de reacciones de PCR anteriores en el laboratorio, lo que de otro modo podría generar falsos positivos.
• PCR asimétrica térmica entrelazada (TAIL-PCR) : para el aislamiento de una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. Dentro de la secuencia conocida, TAIL-PCR utiliza un par de cebadores anidados con diferentes temperaturas de hibridación; se utiliza un cebador degenerado para amplificar en la dirección opuesta a partir de la secuencia desconocida. ^{[ 89 ]}
• PCR de descenso gradual ( PCR escalonada ): una variante de PCR que busca reducir el ruido de fondo inespecífico disminuyendo gradualmente la temperatura de hibridación a medida que avanza el ciclo de PCR. La temperatura de hibridación en los ciclos iniciales suele ser unos pocos grados (3–5 °C) superior a la T _m de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores, es unos pocos grados (3–5 °C) inferior a la T _m del cebador . Las temperaturas más altas proporcionan mayor especificidad para la unión del cebador, y las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente de los productos específicos formados durante los ciclos iniciales. ^{[ 90 ]}
• La PCR de dos colas es una tecnología desarrollada por el profesor Mikael Kubista para amplificar moléculas plantilla cortas como los microARN e incluso más cortas utilizando un cebador en horquilla que se hibrida con el objetivo tanto por su extremo 3' como por su extremo 5'. ^{[ 91 ]}
• Universal Fast Walking : para el rastreo del genoma y la huella genética mediante una PCR de dos lados más específica que los enfoques convencionales de un solo lado (que utilizan solo un cebador específico del gen y un cebador general, lo que puede generar "ruido" artificial) ^{[ 92 ]} gracias a un mecanismo que implica la formación de una estructura en lazo. Los derivados optimizados de UFW son LaNe RAGE (PCR anidada dependiente de lazo para la amplificación rápida de los extremos del ADN genómico), ^{[ 93 ]} 5'RACE LaNe ^{[ 94 ]} y 3'RACE LaNe. ^{[ 95 ]}

Las enzimas termorresistentes que son un componente clave en la reacción en cadena de la polimerasa fueron descubiertas en la década de 1960 como producto de una forma de vida microbiana que vivía en las aguas sobrecalentadas del manantial Mushroom Spring de Yellowstone . ^{[ 96 ]}

Un artículo de 1971 publicado en el Journal of Molecular Biology por Kjell Kleppe y colaboradores del laboratorio de H. Gobind Khorana describió por primera vez un método para replicar in vitro una plantilla corta de ADN con cebadores mediante un ensayo enzimático . ^{[ 97 ]} Sin embargo, esta manifestación temprana del principio básico de la PCR no recibió mucha atención en su momento, y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 se atribuye generalmente a Kary Mullis . ^{[ 98 ]}

Cuando Mullis desarrolló la PCR en 1983, trabajaba en Emeryville , California, para Cetus Corporation , una de las primeras empresas de biotecnología , donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis escribió que concibió la idea de la PCR mientras conducía por la Pacific Coast Highway una noche. ^{[ 99 ]} Estaba pensando en una nueva forma de analizar los cambios (mutaciones) en el ADN cuando se dio cuenta de que, en realidad, había inventado un método para amplificar cualquier región del ADN mediante ciclos repetidos de duplicación impulsados ​​por la ADN polimerasa. En Scientific American , Mullis resumió el procedimiento: «Partiendo de una sola molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 mil millones de moléculas similares en una tarde. La reacción es fácil de realizar. No requiere más que un tubo de ensayo, unos pocos reactivos sencillos y una fuente de calor». ^{[ 100 ]} La huella genética se utilizó por primera vez para pruebas de paternidad en 1988. ^{[ 101 ]}

Mullis ha reconocido que el uso de LSD fue fundamental para el desarrollo de la PCR: "¿Habría inventado la PCR si no hubiera tomado LSD? Lo dudo mucho. Aprendí eso en parte bajo los efectos de drogas psicodélicas." ^{[ 102 ]}

Mullis y el bioquímico Michael Smith , quien había desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, ^{[ 1 ]} recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993, siete años después de que Mullis y sus colegas en Cetus pusieran en práctica su propuesta por primera vez. ^{[ 103 ]} El artículo de Mullis de 1985 con RK Saiki y HA Erlich, "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de β-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia falciforme" —la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)— fue reconocido con una Mención por Avance Químico de la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense en 2017. ^{[ 104 ] [ 2 ]}

La base del método PCR reside en el uso de una ADN polimerasa adecuada capaz de soportar las altas temperaturas (> 90 °C/194 °F) necesarias para la separación de las dos hebras de ADN en la doble hélice tras cada ciclo de replicación . Las ADN polimerasas empleadas inicialmente en los experimentos in vitro previos a la PCR no podían soportar estas altas temperaturas. ^{[ 2 ]} Por lo tanto, los primeros procedimientos de replicación del ADN eran muy ineficientes y lentos, y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa y manipulación continua durante todo el proceso.  

El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq —una ADN polimerasa purificada de la bacteria termófila Thermus aquaticus en un trabajo en coautoría con Alice Chien Chang— que vive naturalmente en ambientes calientes ( 50 a 80 °C (122 a 176 °F) ) ^{[ 20 ]} como las aguas termales— allanó el camino para mejoras drásticas en el método de PCR. La ADN polimerasa aislada de T. aquaticus es estable a altas temperaturas y permanece activa incluso después de la desnaturalización del ADN, ^{[ 21 ]} lo que evita la necesidad de agregar nueva ADN polimerasa después de cada ciclo. ^{[ 3 ]} Esto permitió un proceso automatizado basado en termocicladores para la amplificación del ADN.  

• pruebas de COVID-19
• adición de ADN
• Amplificación isotérmica mediada por bucles
• Técnica de selección
• Termus thermophilus
• ADN polimerasa Pfu

• Patente estadounidense para PCR archivada el 16 de octubre de 2011 en Wayback Machine.
• ¿Qué es el efecto meseta de la PCR? Video tutorial de YouTube.
• Historia de la reacción en cadena de la polimerasa según los archivos de la Institución Smithsonian.
• Veritasium (26 de diciembre de 2024). El hombre que tomó LSD y cambió el mundo . Recuperado el 29 de enero de 2025 – vía YouTube.